本發(fā)明涉及一種多肽緩釋微球制劑及其制備方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：大多數(shù)具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽類藥物由于口服生物利用度低，往往不能通過口服途徑給藥。通過注射給藥時，體內(nèi)蛋白酶的存在使得藥物在體內(nèi)的半衰期很短，需要頻繁注射，增加了患者的痛苦。為減少給藥頻率、提高患者順應(yīng)性，此類藥物通常需要被開發(fā)成長效緩釋制劑。艾塞那肽是人工合成的北美毒晰外泌肽，由39個氨基酸殘基組成，相對分子量為4186.57，為胰高血糖素-1(GLP-1)受體激動劑。艾塞那肽已知的藥理作用包括：(1)增加葡萄糖依賴性促胰島素分泌；(2)抑制II型糖尿病患者胰高血糖素的分泌；(3)抑制餐后胃腸動力及分泌功能，延遲胃排空，從而有利于餐后血糖的控制；(4)降低食欲，減少食物的攝入；(5)刺激β細(xì)胞凋亡，從而增加β細(xì)胞的數(shù)量；(6)改善II型糖尿病患者的空腹及餐后血糖水平。與傳統(tǒng)的治療糖尿病藥物相比，艾塞那肽具有不可比擬的優(yōu)點。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于2005年4月批準(zhǔn)了艾塞那肽在美國上市。然而由于半衰期短,該產(chǎn)品為每日2次注射劑，頻繁的注射使患者順應(yīng)性較差。目前，已有文獻報道利用生物相容性可降解材料(例如高分子材料)包裹藥物活性成分，制成艾塞那肽微球制劑；通過可降解的生物高分子材料在體內(nèi)逐步降解來控制艾塞那肽的釋放，從而維持有效的血藥濃度，達(dá)到長效緩釋的目的。CN102198103A公開了一種能有效延長艾塞那肽在體內(nèi)作用時間的艾塞那肽緩釋微球制劑，該制劑包含艾塞那肽0.1％-12.5％，乙交酯丙交酯共聚物77.5％-99％，0.1％-10％的保護劑，1.01％-10％的助懸劑，保護劑用于穩(wěn)定和緩釋，在體外的緩釋周期可達(dá)到7-35天。CN102688198A提供了另一種艾塞那肽緩釋微球制劑，該制劑采用穩(wěn)定劑及O/O型乳化-溶劑揮發(fā)法制備而成，藥物釋放時間從一周至一月。然而，為了進一步降低給藥頻率，亟需開發(fā)一種新的制劑和制備工藝，以期得到緩釋周期長達(dá)數(shù)月的多肽緩釋制劑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種多肽緩釋微球制劑及其制備方法。進一步的，本發(fā)明的目的在于提供一種艾塞那肽及其衍生物的緩釋微球制劑及其制備方法。本發(fā)明的多肽緩釋微球制劑不需要使用穩(wěn)定劑或保護劑，采用O/O相凝聚方法，特別是通過對溶劑-凝聚劑-淬滅溶劑體系的研究，采用簡化有效的方法和處方，就可以得到粒徑小、釋藥時間長、有效避免體外突釋、體外初始釋放率低、能克服平臺期的艾塞那肽緩釋微球制劑。本發(fā)明提供了一種多肽(例如艾塞那肽及其衍生物)的緩釋微球制劑，它是由下述重量百分比的原料和輔料組成：多肽3％～10％，高分子聚合物90％～97％，所述的高分子聚合物為聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)或聚羥基乙酸(PGA)中的一種或幾種，所述緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。優(yōu)選的，所述多肽緩釋微球制劑的體外釋放曲線為接近零級的釋放曲線。本發(fā)明的多肽緩釋微球制劑克服了釋放平臺期，實現(xiàn)接近恒速釋放。本發(fā)明的緩釋微球制劑以艾塞那肽為例說明，也可以是其它的生物活性多肽藥物，如GLP-1、LHRH、利拉魯肽、降鈣素、細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、生長激素、EGF、NGF、干擾素、生長激素、酶、白細(xì)胞介素、促紅細(xì)胞生長素、免疫球蛋白、抗體、集落刺激因子、胰島素以及上述蛋白、多肽的類似物、衍生物、修飾物及鹽，上述多肽藥物可以是通過天然提取、化學(xué)合成或者基因工程方法得到。優(yōu)選的，本發(fā)明的多肽緩釋微球制劑是由下述重量百分比的原料和輔料組成：多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)3-10％，聚乳酸(例如1002APLA)90-97％。進一步優(yōu)選的，上述緩釋微球制劑是由下述重量百分比的原料和輔料組成：艾塞那肽或艾塞那肽鹽6％，聚乳酸(例如1002APLA)94％。本發(fā)明的上述緩釋微球制劑不包含保護劑或穩(wěn)定劑，例如糖類，實例如蔗糖。進一步的，本發(fā)明所述的緩釋微球制劑，通過將多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)和高分子聚合物溶于溶劑中，再加入凝聚劑，轉(zhuǎn)移至淬滅溶劑中硬化得到。其中，上述溶劑為可以使多肽和高分子聚合物溶解的任何溶劑，例如有機溶劑，優(yōu)選為冰醋酸。優(yōu)選的，凝聚劑為硅油、液體石蠟、礦物油中的至少一種與C6-C8的飽和脂肪烴中的至少一種形成的混合物，所述飽和脂肪烴的體積百分比為50％-80％，其余為硅油、液體石蠟、礦物油中的至少一種。更進一步的，所述的C6-C8的飽和脂肪烴包括，例如正己烷、正庚烷、正辛烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷、環(huán)辛烷等。優(yōu)選的，所述凝聚劑為正庚烷和硅油的混合物。更優(yōu)選的，所述凝聚劑為50％-80％(V/V％)的正庚烷和20％-50％(V/V％)的硅油，例如在具體實施例中，所述凝聚劑為50％(V/V％)的正庚烷和50％(V/V％)的硅油、48％正庚烷和52％硅油、55％正庚烷和45％硅油。進一步的，所述的淬滅溶劑為正庚烷或正庚烷與乙醇的混合物進一步的，所述淬滅溶劑中正庚烷與乙醇的體積比為1:0-5，優(yōu)選1:0-2.5，更優(yōu)選1:0-1。進一步優(yōu)選的，所述淬滅溶劑為體積比為1:1的正庚烷和乙醇的混合物。進一步的，所述淬滅溶劑的加入量為不低于2倍體積的凝聚劑，進一步優(yōu)選為淬滅溶劑的加入量為不低于8倍體積的凝聚劑。在一個優(yōu)選的實施例中，所述的艾塞那肽緩釋微球制劑，通過將多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)和高分子聚合物溶于冰醋酸中，再加入由正庚烷和硅油的混合物組成的凝聚劑中，再轉(zhuǎn)移至由正庚烷和乙醇的混合物組成的淬滅溶劑中硬化得到。在另一個優(yōu)選的實施例中，凝聚劑中正庚烷和硅油的體積比為1:1，淬滅溶劑中正庚烷和乙醇的體積比為1:1。本發(fā)明以上緩釋微球制劑中的上述技術(shù)特征可以任意組合。本發(fā)明還提供了一種所述多肽緩釋微球制劑的制備方法，包含以下步驟：(1)、將多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)與高分子聚合物溶于溶劑；(2)、向步驟(1)制備的混合物中加入凝聚劑，形成初期微球；(3)、將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至淬滅溶劑中硬化得到硬化微球；還任選地包括以下步驟中的一個或多個：(4)、清洗步驟(3)制備的硬化微球表面；(5)、收集步驟(3)或步驟(4)的硬化微球、干燥。本發(fā)明提供的上述制備方法中，步驟(4)和步驟(5)均為可選或可不選的步驟，并且，步驟(4)和步驟(5)可以同時采用或者擇一采用。在一個優(yōu)選的多肽緩釋微球制劑制備方法中，包含以下步驟：(1)、將多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)與高分子聚合物溶于溶劑；(2)、向步驟(1)制備的混合物中加入凝聚劑，形成初期微球；(3)、將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至淬滅溶劑中硬化得到微球制劑。在一個優(yōu)選的多肽緩釋微球制劑的制備方法中，包含以下步驟：(1)、將多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)與高分子聚合物溶于溶劑；(2)、向步驟(1)制備的混合物中加入凝聚劑，形成初期微球；(3)、將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至淬滅溶劑中硬化得到硬化微球；(4)、清洗步驟(3)制備的硬化微球表面；得到微球制劑。在另一優(yōu)選的多肽緩釋微球制劑制備方法中，包含以下步驟：(1)、將多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)與高分子聚合物溶于溶劑；(2)、向步驟(1)制備的混合物中加入凝聚劑，形成初期微球；(3)、將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至淬滅溶劑中硬化得到硬化微球；(4)、清洗步驟(3)制備的硬化微球表面；(5)、收集步驟(4)的硬化微球、干燥，得到微球制劑。進一步的，所述步驟(1)的溶劑為可以使多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)和高分子聚合物溶解的任何溶劑，優(yōu)選多肽(例如艾塞那肽或艾塞那肽鹽)和高分子聚合物溶解性好的溶劑，例如包括冰醋酸、丙酮、乙腈、乙酸乙酯，艾塞那肽或艾塞那肽鹽和高分子聚合物在冰醋酸中溶解性好。進一步的，所述的凝聚劑為硅油、液體石蠟、礦物油中的至少一種與C6-C8的飽和脂肪烴中的至少一種形成的混合物，所述飽和脂肪烴的體積百分比為50％-80％，其余為硅油、液體石蠟、礦物油中的至少一種。更進一步的，所述的C6-C8的飽和脂肪烴為包括正己烷、正庚烷、正辛烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷、環(huán)辛烷等。優(yōu)選的，所述凝聚劑為正庚烷和硅油的混合物。進一步優(yōu)選的，所述凝聚劑為50％-80％(V/V％)的正庚烷和20％-50％(V/V％)的硅油。，例如在一個具體實施例中，所述凝聚劑為50％(V/V％)的正庚烷和50％(V/V％)的硅油。已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的凝聚劑可以有效的實現(xiàn)對冰醋酸的萃取，及微球粒徑的控制，將微球粒徑控制在60微米-120微米，包封率好，有效避免藥物突釋現(xiàn)象。進一步的，所述的淬滅溶劑為正庚烷或正庚烷與乙醇的混合物。進一步的，所述正庚烷與乙醇的體積比為1:0-1。進一步優(yōu)選的，所述淬滅溶劑為體積比為1:1的正庚烷和乙醇的混合物。進一步的，所述淬滅溶劑的加入量為不低于2倍體積的凝聚劑，進一步優(yōu)選淬滅溶劑的加入量為不低于8倍體積的凝聚劑。在一個優(yōu)選的實施例中，所述的溶劑為冰醋酸；所述的凝聚劑為正庚烷和硅油的混合物。在另一優(yōu)選的實施例中，所述的溶劑為冰醋酸；所述凝聚劑為體積比為1:1的正庚烷和硅油的混合物。在一個優(yōu)選的實施例中，所述的溶劑為冰醋酸；所述的淬滅溶劑為正庚烷和乙醇的混合物。在另一優(yōu)選的實施例中，所述的溶劑為冰醋酸；所述淬滅劑為體積比為1:1的正庚烷和乙醇的混合物。在一個優(yōu)選的實施例中，所述的凝聚劑為正庚烷和硅油的混合物；所述的淬滅溶劑為正庚烷和乙醇的混合物。在另一優(yōu)選的實施例中，所述凝聚劑為體積比為1:1的正庚烷和硅油的混合物，所述淬滅溶劑為體積比為1:1的正庚烷和乙醇的混合物。在一個優(yōu)選的實施例中，所述的溶劑為冰醋酸；所述的凝聚劑為正庚烷和硅油的混合物；所述的淬滅溶劑為正庚烷和乙醇的混合物。在另一優(yōu)選的實施例中，所述的溶劑為冰醋酸；所述凝聚劑為體積比為1:1的正庚烷和硅油的混合物，所述淬滅劑為體積比為1:1的正庚烷和乙醇的混合物。進一步的，所述的清洗步驟采用通常的微球清洗方法對硬化微球表面進行清洗即可，本發(fā)明提供一種優(yōu)選的清洗步驟，包括：清洗液為乙醇-正庚烷，采用逐步減小其中乙醇的比例的清洗液清洗微球表面，最后采用正庚烷浸泡，以得到良好形態(tài)的微球。進一步的，所述的收集硬化微球步驟采用濕法篩分。進一步的，所述的干燥步驟采用真空干燥。本發(fā)明以上制備方法中的技術(shù)特征都可以任意組合。本發(fā)明以上制備方法中不需要加入保護劑或穩(wěn)定劑(例如包含蔗糖在內(nèi)的糖類)來控制粒徑及其帶來的注射順應(yīng)性、或解決突釋問題等。本發(fā)明以上制備方法中通過對溶劑-凝聚劑-淬滅溶劑體系的選擇，能很好地解決現(xiàn)有技術(shù)存在的艾塞那肽緩釋微球制劑的突釋問題、粒徑問題、以及平臺期問題，延長單次給藥期可長達(dá)3個月。本發(fā)明還提供一種通過上述制備方法制備得到的艾塞那肽緩釋微球制劑。本發(fā)明中“組成”可以理解為不包括如蔗糖等糖類在內(nèi)的保護劑或穩(wěn)定劑，或者不包括其它原料或輔料，但是，應(yīng)該理解，并不排除在制備過程中殘留的溶劑等。本發(fā)明中的V/V％是指體積/體積％，即體積百分比。本發(fā)明中的初始釋放率，即體外初始釋放率，是指1小時內(nèi)的體外累計釋放率(重量百分比)。本發(fā)明中的凝聚劑是將艾塞那肽或艾塞那肽鹽與高分子聚合物的溶液不易溶解于其中因此與該溶液形成不同相的試劑。本發(fā)明中提供的緩釋微球制劑中，采用艾塞那肽作為活性成分，艾塞那肽(exenatide)是人工合成的北美毒蜥外泌肽(exendin-4)，由39個氨基酸殘基構(gòu)成，分子式為C184H282N50O60S，相對分子量4186.57，其氨基酸序列如下：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-SerLys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽為人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的類似物，是GLP-1的受體激動劑，與GLP-1具有相同的生理功能，艾塞那肽在體外顯示可以結(jié)合并活化已知的人類GLP-1受體。這就意味著通過包括cAMP和/或其他細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制使葡萄糖依賴性胰島素合成及胰島β細(xì)胞在體內(nèi)分泌胰島素增加。在葡萄糖濃度升高的情況下，艾塞那肽可促進胰島素從β細(xì)胞中釋放。體內(nèi)給藥后艾塞那肽模擬GLP-1的某種抗高血糖藥作用。本發(fā)明中所述的高分子聚合物為生物相容性，可為生物降解性聚合物或非生物降解性聚合物或其摻合物或共聚物。本發(fā)明所用聚合物的可接受的分子量根據(jù)聚合物的降解率、物理特性(例如機械強度)、端基化學(xué)和聚合物于溶劑中溶出率等因素來確定。通?？山邮芊肿恿糠秶鸀榧s2,000道爾頓到約2,000,000道爾頓。本發(fā)明的緩釋組合物可形成很多形狀，例如薄膜、丸狀、圓柱狀、盤狀或微粒。如本發(fā)明所定義，微粒包含直徑小于約一毫米且生物活性多肽分散或溶于其間的聚合物組分。微粒可為球形、非球形或不規(guī)則形狀。本發(fā)明提供了一種多肽緩釋微球制劑，并通過對制備時溶劑、凝聚劑和淬滅溶劑的選擇，不僅微球粒徑小、包封率高，還進一步延長了藥物釋放時間，單次給藥可以持續(xù)釋放半月以上，可長達(dá)3個月，顯著降低了給藥頻率，提高患者的順應(yīng)性；并且克服了現(xiàn)有的多肽，尤其是艾塞那肽緩釋微球制劑在釋放中存在的平臺期，本發(fā)明的多肽緩釋微球制劑意外地能夠?qū)崿F(xiàn)近乎零級的釋放曲線；同時，有效避免了體外突釋，經(jīng)實驗證實，本發(fā)明制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。本發(fā)明的艾塞那肽緩釋微球制劑用于治療糖尿病，包括I型和II型糖尿??；可以用于通過降低血漿葡萄糖水平的藥劑而獲益的疾病的治療中；用于預(yù)防高血糖；用于預(yù)防高血壓；和用于治療會通過給予延遲和/或延緩胃排空的藥劑而獲益的疾病的治療；還可以用于減少食物攝入、抑制食欲并治療肥胖癥；本發(fā)明的艾塞那肽緩釋微球制劑還可以用于治療充血性心力衰竭。盡管“肥胖癥”通常被定義為體重指數(shù)超過30，出于本發(fā)明公開的目的，需要或希望減輕體重的任何對象，包括體重指數(shù)小于30的那些，都被包括在“肥胖”的范圍內(nèi)。本發(fā)明的多肽緩釋微球制劑通?？砂凑毡绢I(lǐng)域通常所知方法給藥?？赏ㄟ^注射、植入(例如皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、顱內(nèi)和皮內(nèi))、粘膜給藥(例如鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、肺內(nèi)或借助栓劑)、口服、通過無針注射或原位遞送(例如通過灌腸劑或氣霧劑)將本發(fā)明的緩釋微球制劑給予患者(例如需要該制劑的人類)或其它動物?？捎迷谒钑r間內(nèi)達(dá)到所需治療水平的任何給藥時間給予該緩釋微球制劑。舉例而言，可給予緩釋微球制劑，監(jiān)測患者直到所遞送的藥物水平回到基線?；氐交€后，可再次給予緩釋微球制劑?；蛘?，可在患者體內(nèi)達(dá)到基線水平前序慣給予緩釋微球制劑。本發(fā)明的緩釋微球制劑還可與皮質(zhì)類固醇一起給予。本發(fā)明的緩釋微球制劑與皮質(zhì)類固醇一起給予可進一步提高緩釋微球制劑中生物活性多肽的生物利用度。本發(fā)明所定義的皮質(zhì)類固醇指類固醇類抗炎性劑，也稱為糖皮質(zhì)激素。本發(fā)明中所用術(shù)語患者是指人類，例如需要該藥劑或治療方法、預(yù)防方法或診斷方法的人類。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1本發(fā)明艾塞那肽微球制劑體外釋放曲線。圖2本發(fā)明艾塞那肽微球制劑體內(nèi)釋放曲線。具體實施方式本發(fā)明具體實施方式中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。本發(fā)明中所述的“艾塞那肽鹽”可以為任何可以藥用的艾塞那肽鹽，包括艾塞那肽有機酸鹽和艾塞那肽無機酸鹽，例如目前已經(jīng)藥用的為艾塞那肽醋酸鹽，還包括艾塞那肽鹽酸鹽、艾塞那肽乳酸鹽、艾塞那肽三氟乙酸鹽、艾塞那肽枸櫞酸鹽、艾塞那肽富馬酸鹽、艾塞那肽丙二酸鹽、艾塞那肽馬來酸鹽、艾塞那肽酒石酸鹽、艾塞那肽門冬氨酸鹽、艾塞那肽苯甲酸鹽、艾塞那肽琥珀酸鹽或艾塞那肽撲酸鹽，可將艾塞那肽鹽作為一種優(yōu)選的艾塞那肽鹽原料用作制備艾塞那肽微球制劑。本發(fā)明實施例中的PLGA或PLA或PGA命名組成通常是丙交酯和乙交酯聚合比例+旋光性+比濃對數(shù)粘度+高分子末端類型。例如，50：50DLG1APLGA的具體含義，是指PLGA是外消旋物質(zhì)，由丙交酯、乙交酯的環(huán)狀二聚合物在親核引發(fā)劑催化作用下的開環(huán)聚合物，聚合比例1:1，PLGA比濃對數(shù)粘度在1左右，PLGA末端基團是羧基，命名時DLG也可以放在聚合比例之前，如DLG50501A。本發(fā)明中，生物活性多肽的緩釋是從本發(fā)明的緩釋制劑釋放該多肽，釋放發(fā)生的時間比直接給予該多肽溶液后存在可利用的生物學(xué)顯著量的時間長。緩釋通?？梢詾檫B續(xù)釋放或不連續(xù)釋放，釋放速率相對恒定或有變化。所用聚合物組成的類型等可能影響釋放的連續(xù)性和釋放水平。實施例1微球制劑及其制備方法(1)將5g純化50：50DLG2APLGA(聚合比例1:1，PLGA比濃對數(shù)粘度在1左右，末端基團是羧基的PLGA)，0.3g艾塞那肽溶于50ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合200ml正庚烷與200ml硅油，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(3)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至1800ml正庚烷和1800ml乙醇的混合溶液中，20℃下攪拌1-2h；(4)用200ml50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面的殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。4℃干燥24h，25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。實施例2微球制劑及其制備方法(1)將5g純化50：50DLG3APLGA，0.3g艾塞那肽溶于50ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合200ml正庚烷與200ml硅油，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至1500ml正庚烷和1500ml乙醇的混合溶液中；(4)用200ml50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面的殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。4℃干燥24h，25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。實施例3微球制劑及其制備方法(1)將5g純化1002APLA，0.3g艾塞那肽溶于50ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合200ml正庚烷與200ml硅油，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至2100ml正庚烷和2100ml乙醇的混合溶液中，20℃下攪拌1-2h；(4)用200ml50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。4℃干燥24h，25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。實施例4微球制劑及其制備方法(1)將5g純化75：25DLG2APLGA，0.3g艾塞那肽溶于50ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合200ml正庚烷與200ml硅油，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至1800ml正庚烷和1800ml乙醇的混合溶液中，20℃下攪拌1-2h；(4)用200ml50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。4℃干燥24h，25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。實施例5微球制劑及其制備方法(1)將60g純化50：50DLG3APLGA，1.9g艾塞那肽溶于冰醋酸中，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合4000ml正庚烷與1000ml硅油，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至20L正庚烷中，25℃下攪拌5-6h；(4)清洗；(5)收集微球，真空干燥。實施例6微球制劑及其制備方法(1)將9gPGA，1g艾塞那肽溶于200ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合800ml正庚烷與400ml硅油，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至3000ml正庚烷和1800ml乙醇的混合溶液中，攪拌；(4)用500ml50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。0-4℃干燥24h，20-25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。實施例7微球制劑及其制備方法(1)將9.2g純化75：25DLG2APLGA，0.8g艾塞那肽溶于溶劑中，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合600ml正辛烷與400ml液體石蠟，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至6L正庚烷和4L乙醇的混合溶液中，20℃下攪拌；(4)用50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。真空干燥。實施例8微球制劑及其制備方法(1)將60g純化60：40DLG2APLGA，2g艾塞那肽溶于溶劑中，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合2000ml正辛烷與2000ml液體石蠟，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至8000ml正庚烷和8000ml乙醇的混合溶液中，室溫攪拌6h；(4)用50％的正庚烷-乙醇溶液并逐步減小其中乙醇的比例來清洗步驟(3)得到的微球表面；(5)濕法篩分收集步驟(4)得到的微球，真空干燥。實施例9微球制劑及其制備方法(1)將4.88g純化1002APLA，0.32g艾塞那肽溶于冰醋酸中，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合500ml正己烷與500ml礦物油，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至3L正庚烷和3L乙醇的混合溶液中；(4)用50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。4℃干燥20-24h，35℃真空干燥20-24h。實施例10微球制劑及其制備方法(1)將5g純化1002APLA，0.3g艾塞那肽溶于50ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合200ml正庚烷與200ml硅油，制備凝聚劑；向步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液中加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至2100ml正庚烷和2100ml乙醇的混合溶液中硬化得到微球制劑。實施例11微球制劑及其制備方法(1)將5g純化1002APLA，0.3g艾塞那肽溶于50ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合200ml正庚烷與200ml硅油，制備凝聚劑；向步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液中加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至2100ml正庚烷和2100ml乙醇的混合溶液中硬化得到微球制劑。(4)、清洗步驟(3)制備的硬化微球表面；(5)、收集硬化微球、干燥。實施例12微球制劑及其制備方法(1)將5g純化50:50PLA2APLGA，0.3g艾塞那肽溶于50ml冰醋酸，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合200ml正庚烷與200ml硅油，制備凝聚劑；(3)剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入步驟(2)制備的凝聚劑，得到初期微球；(4)將步驟(3)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至2100ml正庚烷和2100ml乙醇的混合溶液中，20℃下攪拌1-2h；(5)用200ml50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(4)得到的微球表面殘留溶劑；(6)使用多層篩收集步驟(5)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。4℃干燥24h，25℃真空干燥24h，35℃真空干燥24h。實施例13微球制劑及其制備方法(1)將9.2g純化75：25DLG2APLGA，0.8g艾塞那肽醋酸鹽溶于溶劑中，形成聚合物與藥物的溶液；(2)混合600ml正辛烷與400ml液體石蠟，制備凝聚劑；剪切步驟(1)制備的聚合物與藥物的溶液，同時加入制備的凝聚劑，得到初期微球；(3)將步驟(2)制備的初期微球轉(zhuǎn)移至6L正庚烷和4L乙醇的混合溶液中，20℃下攪拌；(4)用50％的正庚烷-乙醇溶液沖洗步驟(3)得到的微球表面殘留溶劑；(5)使用多層篩收集步驟(4)得到的微球，用50％的正庚烷-乙醇溶液漂洗。真空干燥。實施例14一種艾塞那肽緩釋微球制劑，由艾塞那肽和聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為3％，聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)的重量百分比為97％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例15一種艾塞那肽緩釋微球制劑，由艾塞那肽和聚乳酸(PLA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為10％，聚乳酸(PLA)的重量百分比為90％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例16一種艾塞那肽緩釋微球制劑，由艾塞那肽和聚羥基乙酸(PGA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為5％，聚羥基乙酸(PGA)的重量百分比為95％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)，該艾塞那肽緩釋微球制劑的體外釋放曲線為接近零級的釋放曲線。實施例17一種艾塞那肽緩釋微球制劑，由艾塞那肽和聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為8％，聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)的重量百分比為92％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例18一種艾塞那肽緩釋微球制劑，采用與實施例2相似的方法制備得到，由艾塞那肽和高分子聚合物組成，高分子聚合物由等重量份的聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)和聚乳酸(PLA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為7％，高分子聚合物的重量百分比為93％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例19一種艾塞那肽緩釋微球制劑，采用與實施例3相似的方法制備得到，由艾塞那肽和高分子聚合物組成，高分子聚合物由重量比為2:1的聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)和聚羥基乙酸(PGA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為4％，高分子聚合物的重量百分比為96％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例20一種艾塞那肽緩釋微球制劑，采用與實施例3相似的方法制備得到，由艾塞那肽和高分子聚合物組成，高分子聚合物由重量比為2:2:1的聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為5％，高分子聚合物的重量百分比為95％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例21一種艾塞那肽緩釋微球制劑，采用與實施例1相似的方法制備得到，由艾塞那肽和高分子聚合物組成，高分子聚合物由重量比為3：2的聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為3.5％，高分子聚合物的重量百分比為96.5％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例22一種艾塞那肽緩釋微球制劑，由艾塞那肽和聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為9％，聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)的重量百分比為91％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)。實施例23一種艾塞那肽緩釋微球制劑，由艾塞那肽和聚乳酸(PLA)組成，其中艾塞那肽的重量百分比為6％，聚乳酸(PLA)的重量百分比為94％，該緩釋微球制劑在1小時內(nèi)的體外初始釋放率在重量百分比2％以內(nèi)，該艾塞那肽緩釋微球制劑的體外釋放曲線為接近零級的釋放曲線。以下通過上述實施例制備的微球制劑的質(zhì)量評價實驗證明本發(fā)明的有益效果。[方法]1、粒徑分布測定：采用激光粒度儀(Malvern3000)測定微球的粒徑分布。2、包封率測定：稱量10mg微球，加入2ml二甲基亞砜，渦流振蕩使完全溶解，加入純化水定容至10ml。通過HPLC分析柱：TSK-GEL進行定量檢測。計算包封率。包封率(％)＝(投藥量-游離藥量)/投藥量×100％3、體外釋放測定：通過測定在釋放緩沖液(pH9.4的tris-HCl溶液)中不同時間艾塞那肽的濃度，可測定體外釋放(即體外累計釋放)。室溫下將100±2mg微球置于100ml緩沖液(pH9.4的tris-HCl溶液)中，振蕩約30s以懸浮該溶液，然后置于37℃恒溫水浴中。一定時間后振蕩混合，靜置30min，取上清液，立即通過HPLC分析柱：TSK-GEL進行定量檢測。其中，測定1h的釋放度為體外初始釋放率。4、體內(nèi)釋放測定：夾層免疫定量血漿中艾塞那肽，用固相單克隆抗體EXE4:2-8.4來捕獲分析物，通過放射性碘標(biāo)記單克隆抗體GLP-1:3-3來檢測。標(biāo)準(zhǔn)校正曲線來定量。對照制劑：美國禮來公司(EliLillyandCompany)、Amylin、Alkermes公司生產(chǎn)的艾塞那肽緩釋制劑(Bydureon)。對照制劑制備方法來自于中國專利公開號CN101065116A包含多肽和糖的基于丙交酯/乙交酯共聚物的緩釋微膠囊，具體制備步驟如下：采用W/O/O相凝聚原理來制備艾塞那肽微球，先將多肽與聚合物分別溶于水和有機溶劑，制備油包水型乳劑，其中水相中加入蔗糖作為保護劑，避免藥物降解；隨著硅油的加入，形成初期微粒；將其轉(zhuǎn)移至猝滅溶劑中硬化；收集硬化微粒；干燥。實施例23實施例1-3的緩釋制劑的參數(shù)評價采用上述方法測定實施例1-3的緩釋制劑的平均粒徑、包封率以及體外初始釋放率，如表1所示。表1：實施例1-3的參數(shù)評價微球制劑實施例1實施例2實施例3平均粒徑μm66.258.362.5包封率％93.892.091.3初始釋放％0.961.051.11從表1可以看出，實施例1-3的艾塞那肽緩釋制劑的包封率均達(dá)到了90％以上，初始釋放率在2％重量百分比以內(nèi)，平均粒徑小，注射容易，患者注射的疼痛感小，進一步實驗證實，其他實施例4-22也有具有與實施例1-3相似的效果。實施例24實施例1-3的緩釋制劑與對照制劑的平臺期比較測定實施例1-3的緩釋制劑和對照制劑在第1、3、5、8、10、14、17天時的體外累計釋放率，結(jié)果如表2所示。表2：實施例1-3的制劑與對照制劑的體外累計釋放率從表2可知，對照制劑的平臺期大于17天，而本發(fā)明實施例1-3的制劑沒有平臺期。對照制劑的平臺期使得實際的給藥過程存在疊加效應(yīng)，加大體內(nèi)突釋效應(yīng)，產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，進一步實驗證實，其他實施例4-22也有具有與實施例1-3相似的效果。實施例25測定實施例3的緩釋制劑和對照制劑的體外釋放曲線測定實施例3的緩釋制劑和對照制劑在一定時間內(nèi)的體外累計釋放率％，如表3所示，并以此數(shù)據(jù)得到圖1的體外釋放曲線。表3：實施例3的制劑與對照制劑的體外累計釋放率從圖1和表3可以看出，本發(fā)明的實施例3的釋放曲線為接近零級釋放曲線，進一步實驗證實，本發(fā)明的其他實施例也有具有與實施例3相似的效果。實施例26測定實施例3的緩釋制劑和對照制劑的體內(nèi)釋放曲線測定實施例3的緩釋制劑和對照制劑在體內(nèi)一定時間的體內(nèi)血藥濃度，結(jié)果如表4所示，并以此數(shù)據(jù)得到圖2的體內(nèi)釋放曲線。表4：實施例3的制劑與對照制劑的體內(nèi)血藥濃度(ng/ml)其中，“-”表示未檢出。從表3和圖2可以看出，對照制劑體內(nèi)釋放波動大，而實施例3的體內(nèi)釋放穩(wěn)定，釋放可達(dá)60天以上，進一步實驗證實，本發(fā)明其他實施例也有具有與實施例3相似的效果。當(dāng)前第1頁1 2 3