本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

納米藥物載體是一種具有納米尺寸級別的包覆治療性藥物的輸送系統(tǒng)，其可經(jīng)過血液循環(huán)進(jìn)入毛細(xì)血管，延長在血流中循環(huán)時(shí)間，還可透過內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入病灶，被細(xì)胞以胞飲的方式吸收，實(shí)現(xiàn)靶向用藥，這有助于減少用藥劑量，降低其副作用。納米藥物載體粒徑較小，擁有較高的比表面，可以包埋疏水性藥物，提高其溶解性，減少常規(guī)用藥中助溶劑的副作用；能在機(jī)體中便利地運(yùn)輸，能實(shí)現(xiàn)多種藥物與多種診斷和治療方法的聯(lián)合。納米藥物載體的這些優(yōu)點(diǎn)為一些腫瘤疾病的治療開辟了新的途徑。

一般藥物載體在血液中循環(huán)過程中，若其帶正電荷有利于在血液中循環(huán)；進(jìn)入病灶后，帶正電荷也有利于攻擊病變細(xì)胞；并且對腦皮層有特異性識(shí)別。然而，現(xiàn)有的藥物載體都未同時(shí)滿足上述三個(gè)要點(diǎn)，所以目前的藥物載體很難克服血腦屏障(BBB)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體及其制備方法，旨在利用電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體使藥物可以在機(jī)體中便利地運(yùn)輸，便于攻擊病變細(xì)胞，且對腦皮層特異性識(shí)別。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體包括內(nèi)核和外核，所述內(nèi)核為載體主體，所述外核為對所述載體主體進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)換的載體鎖，所述內(nèi)核與所述外核通過正負(fù)電荷作用結(jié)合；

所述載體主體為帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖；所述載體鎖為側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸。

本發(fā)明還提供了一種上述所述的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體的制備方法，包括：

載體主體制備步驟：將殼聚糖?；墒杷畾ぞ厶?，再接枝末端為炔基的聚乙二醇(PEG)，然后與末端為疊氮的靶向肽通過點(diǎn)擊反應(yīng)(Click反應(yīng))連接，獲得帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖；

載體鎖制備步驟：將聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)脫芐氧基露出氨基(-NH₂)，再與2,3-二甲基馬來酸酐反應(yīng)，獲得側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸；

納米藥物顆粒載體制備步驟：使用透析法、逆向蒸發(fā)法或乳化溶劑蒸發(fā)法將所述靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖制備成納米內(nèi)核，再通過正負(fù)電荷作用將側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸溶液與所述納米內(nèi)核包裹在一起，獲得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體。

本發(fā)明還提供了一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物包括載藥內(nèi)核和外核，所述外核為對所述載藥內(nèi)核進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)換的載體鎖，所述載藥內(nèi)核與所述外核通過正負(fù)電荷作用結(jié)合；

所述載藥內(nèi)核的載體為帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖，所述藥物為疏水性藥物，負(fù)載在所述載體之中；所述載體鎖為側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸。

本發(fā)明還提供了一種上述所述的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物的制備方法，包括：

載體主體制備步驟：將殼聚糖酰基化生成疏水殼聚糖，再接枝末端為炔基的聚乙二醇，然后與末端為疊氮的靶向肽通過Click反應(yīng)連接，獲得帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖；

載體鎖制備步驟：將聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)脫芐氧基露出-NH₂與2,3-二甲基馬來酸酐反應(yīng)，獲得側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸；

納米藥物組合物制備步驟：將所述靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖和疏水性藥物溶于有機(jī)溶劑中，通過透析法、逆向蒸發(fā)法或乳化溶劑蒸發(fā)法制備成載藥納米內(nèi)核，再通過正負(fù)電荷作用將側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸溶液與所述納米內(nèi)核包裹在一起，獲得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：本發(fā)明實(shí)施例提供的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體，包括由載體主體構(gòu)成的內(nèi)核和由載體鎖構(gòu)成的外核兩層結(jié)構(gòu)，并且通過所述載體鎖對所述載體進(jìn)行鎖定。本發(fā)明實(shí)施例提供電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體具有雙重電荷轉(zhuǎn)換作用，這種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體表面帶負(fù)電荷，在弱酸環(huán)境下，載體鎖被打開，載體電荷發(fā)生反轉(zhuǎn)，由負(fù)電荷轉(zhuǎn)換成正電荷，靶向肽泄露在膠束表面，開始起到靶向作用，克服血腦屏障。此外，載體帶正電荷也有利于在血液中循環(huán)，進(jìn)入病灶后，帶正電荷也有利于攻擊病變細(xì)胞，并且對腦皮層有特異性識(shí)別。

本發(fā)明實(shí)施例提供的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體，使藥物可以在機(jī)體中便利地運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)了多種藥物與多種診斷和治療方法的聯(lián)合，從而為一些腫瘤疾病開辟了新途徑。

本發(fā)明實(shí)施例提供的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物，由所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體和藥物組成，所述藥物包裹于所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體的內(nèi)核之中，載體攜帶藥物進(jìn)行組織，在弱酸環(huán)境下，載體鎖被打開，載體電荷發(fā)生反轉(zhuǎn)，由負(fù)電荷轉(zhuǎn)換成正電荷，靶向肽暴露在膠束表面，開始起到靶向作用。載體帶正電荷也有利于在血液中循環(huán)，進(jìn)入病灶后，帶正電荷也有利于攻擊病變細(xì)胞，并且對腦皮層有特異性識(shí)別。此外，進(jìn)入病變細(xì)胞后，由于溶酶體的作用，pH變的更小，藥物開始釋放，從而開始發(fā)揮藥效。

附圖說明

圖1為本發(fā)明第二實(shí)施例提供的peptide14-PEG-g-HC的合成路線圖；

圖2為本發(fā)明第二實(shí)施例提供的D-PLL-DMMA的合成路線圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明第一實(shí)施例提供了一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體包括內(nèi)核和外核，所述內(nèi)核為載體主體，所述外核為對所述載體主體進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)換的載體鎖，所述內(nèi)核與所述外核通過正負(fù)電荷作用結(jié)合；

所述載體主體為帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖；所述載體鎖為側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸。

本發(fā)明第一實(shí)施例提供的一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體，包括由載體主體構(gòu)成的內(nèi)核和由載體鎖構(gòu)成的外核兩層結(jié)構(gòu)，并且通過所述載體鎖對所述載體進(jìn)行鎖定。本發(fā)明實(shí)施例提供電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體具有雙重電荷轉(zhuǎn)換作用，這種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體表面帶負(fù)電荷，在弱酸環(huán)境下，載體鎖被打開，載體電荷發(fā)生反轉(zhuǎn)，由負(fù)電荷轉(zhuǎn)換成正電荷，靶向肽泄露在膠束表面，開始起到靶向作用，克服血腦屏障。此外，載體帶正電荷也有利于在血液中循環(huán)，進(jìn)入病灶后，帶正電荷也有利于攻擊病變細(xì)胞，并且對腦皮層有特異性識(shí)別。

具體地，所述載體主體由疏水改性殼聚糖、聚乙二醇及靶向肽連接形成；所述載體鎖由引發(fā)劑引發(fā)L-賴氨酸酸酐(lys-NCA)進(jìn)行活性開環(huán)聚合(ROP聚合)和接上2,3-二甲基馬來酸酐(DMMA)而形成。

所述改性殼聚糖為?；鶜ぞ厶牵鲺；乎；⑹；蚴缩；?，優(yōu)選己酰基；所述酰基殼聚糖的?；仁?.3～1，優(yōu)選0.5，0.8或1。所述殼聚糖的分子量為5000～100000。

具體地，所述聚乙二醇的分子量為2000～20000，優(yōu)選2000，5000，10000，20000，更優(yōu)選2000，5000。

具體地，所述帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖中改性殼聚糖、聚乙二醇及靶向肽的質(zhì)量比為1:(0.02～0.2):(0.05～0.2)，優(yōu)選1:0.1:0.05，1:0.05:0.05或1:0.2:0.1。具體地，所述載體主體與所述載體鎖的質(zhì)量比為0.1～1.4:1，優(yōu)選0.1:1，0.5:1或1:1。所述載體主體與所述載體鎖的質(zhì)量比不同，所得的納米藥物載體的粒徑、電位的大小會(huì)不一樣。

具體地，所述靶向肽14為H-THAPMTSPVTP-NH₂，H-pwvpswmpprht-NH₂，H-thrppmwp-NH₂或H-T(NMe)H(NMe)RPPM(NMe)WSPVWP-NH₂。

本發(fā)明第一實(shí)施例提供的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體，使藥物可以在機(jī)體中便利地運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)了多種藥物與多種診斷和治療方法的聯(lián)合，從而為一些腫瘤疾病開辟了新途徑。

本發(fā)明第二實(shí)施例提供了一種上述所述的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體的制備方法，包括：

載體主體制備步驟：將殼聚糖?；墒杷畾ぞ厶?，再接枝末端為炔基的聚乙二醇，然后與末端為疊氮的靶向肽通過Click反應(yīng)連接，獲得帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖；

載體鎖制備步驟：將聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)脫芐氧基露出-NH₂，再與2,3-二甲基馬來酸酐反應(yīng)，獲得側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸；

納米藥物顆粒載體制備步驟：使用透析法、逆向蒸發(fā)法或乳化溶劑蒸發(fā)法將所述靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖制備成納米內(nèi)核，再通過正負(fù)電荷作用將側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸溶液與所述納米內(nèi)核包裹在一起，獲得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體。

具體地，所述載體主體制備步驟包括：將殼聚糖?；甚；鶜ぞ厶?HC)；將炔基-聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(Propyne-PEG-NHS)與所述HC反應(yīng)，生成炔基-聚乙二醇-接枝已酰殼聚糖(Propyne-PEG-g-HC)；將反應(yīng)生成的Propyne-PEG-g-HC與靶向肽14通過Click反應(yīng)連接，獲得靶向肽14-聚乙二醇-接枝酰基殼聚糖(肽14-PEG-g-HC)；

所述載體鎖制備步驟包括：將二(三氯甲基)碳酸酯與Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸反應(yīng)，使Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸形成環(huán)狀的Lys-NCA；使用引發(fā)劑引發(fā)上述所形成的環(huán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)；進(jìn)行脫芐氧基反應(yīng)(去保護(hù)基反應(yīng))，露出-NH₂；將露出的-NH₂接上2,3-二甲基馬來酸酐(DMMA)，獲得二乙胺-聚賴氨酸-2,3-二甲基馬來酸酐(D-PLL-DMMA)；所述引發(fā)劑、lys-NCA及2,3-二甲基馬來酸酐的摩爾比為1:15～30:3～30，優(yōu)選1:15:10，1:20:10，1:30:10，1:15:20或1:15:30。所述引發(fā)劑包括二乙胺、三乙胺和聚乙二醇氨基(PEG-NH₂)中的至少一種。

所述納米藥物顆粒載體制備步驟包括：使用透析法、逆向蒸發(fā)法或乳化溶劑蒸發(fā)法將肽14-PEG-g-HC制成納米顆粒，通過正負(fù)電荷作用將D-PLL-DMMA溶液與肽14-PEG-g-HC納米顆粒包裹在一起，獲得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體。

在載體主體制備步驟中，通過將殼聚糖?；蒆C來將所述殼聚糖進(jìn)行疏水改性；Propyne-PEG-NHS與所述HC反應(yīng)生成Propyne-PEG-g-HC的過程中是將HC連接PEG，此過程中PEG是作為親水端，目的是為后面自組裝成膠束。Propyne-PEG-g-HC與靶向肽14連接，是Propyne-PEG-g-HC跟肽上的疊氮反應(yīng)。

具體地，peptide14-PEG-g-HC的合成路線圖參見圖1，D-PLL-DMMA的合成路線參見圖2。

具體地，所述聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)與2,3-二甲基馬來酸酐的摩爾比為(0.05～2):1。

本發(fā)明第二實(shí)施例提供的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體的制備方法，根據(jù)所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體的結(jié)構(gòu)組成，制備其具有的獨(dú)特的雙層結(jié)構(gòu)，所述制備方法操作簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明第三實(shí)施例提供了一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物包括載藥內(nèi)核和外核，所述外核為對所述載藥內(nèi)核進(jìn)行電荷轉(zhuǎn)換的載體鎖，所述載藥內(nèi)核與所述外核通過正負(fù)電荷作用結(jié)合；

所述載藥內(nèi)核的載體為帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖，所述藥物為疏水性藥物，負(fù)載在所述載體之中；所述載體鎖為側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸。

本發(fā)明第三實(shí)施例提供的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物，由所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體和藥物組成，所述藥物包裹于所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體的內(nèi)核之中，載體攜帶藥物進(jìn)行組織，在弱酸環(huán)境下，載體鎖被打開，載體電荷發(fā)生反轉(zhuǎn)，由負(fù)電荷轉(zhuǎn)換成正電荷，靶向肽暴露在膠束表面，開始起到靶向作用。載體帶正電荷也有利于在血液中循環(huán)，進(jìn)入病灶后，帶正電荷也有利于攻擊病變細(xì)胞，并且對腦皮層有特異性識(shí)別。此外，進(jìn)入病變細(xì)胞后，由于溶酶體的作用，pH變的更小，藥物開始釋放，從而開始發(fā)揮藥效。

具體地，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物為納米顆粒，在pH為7.1～7.9時(shí)，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物的粒徑大小為50-150nm；在pH為6.1～6.9時(shí)，所述外核脫落。

具體地，在pH為7.1～7.9時(shí)，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物的表面電荷為弱負(fù)電或不帶電，在pH為6.1～6.9時(shí)，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物的表面電荷為正電荷。

具體地，，所述疏水性藥物包括紫杉醇、伊利替康、疏水阿霉素、美法侖、替莫唑胺中的至少一種。所述靶向肽14為H-THAPMTSPVTP-NH₂，H-pwvpswmpprht-NH₂，H-T(NMe)H(NMe)RPPM(NMe)WSPVWP-NH₂或H-thrppmwp-NH₂。所述疏水性藥物與所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物載體的質(zhì)量比為0.1～1:1，優(yōu)選0.4:1或0.5:1。

本發(fā)明第四實(shí)施例提供了一種上述所述的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物的制備方法，包括：

載體主體制備步驟：將殼聚糖?；墒杷畾ぞ厶?，再接枝末端為炔基的聚乙二醇，然后與末端為疊氮的靶向肽通過Click反應(yīng)連接，獲得帶正電的靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖；

載體鎖制備步驟：將聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)脫芐氧基露出-NH₂與2,3-二甲基馬來酸酐反應(yīng)，獲得側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸；

納米藥物組合物制備步驟：將所述靶向肽修飾的聚乙二醇-疏水改性殼聚糖和疏水性藥物溶于有機(jī)溶劑中，通過透析法、逆向蒸發(fā)法或乳化溶劑蒸發(fā)法制備成載藥納米內(nèi)核，再通過正負(fù)電荷作用將側(cè)鏈修飾2,3-二甲基馬來酸的聚賴氨酸溶液與所述納米內(nèi)核包裹在一起，獲得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

具體地，所述聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)與2,3-二甲基馬來酸酐的摩爾比為(0.05～2):1。

本發(fā)明第五實(shí)施例提供了一種電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物顆粒制劑，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物顆粒制劑包括超純水及分散于所述超純水中的如上所述的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

具體地，所述電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物顆粒的濃度為0.5-4mg/mL，優(yōu)選1mg/mL，2mg/mL或3mg/mL。

將本發(fā)明第三實(shí)施例提供的電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物制成藥物顆粒制劑，方便使用者使用，使所述藥物組合物的療效獲得最大程度地發(fā)揮。

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后在二甲基亞砜(DMSO)中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為3500)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N(克當(dāng)量濃度)的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間；再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8mL己酰氯。己酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)?，插在瓶塞上。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg己?；瘹ぞ厶枪腆w溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量2000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為3500)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mg PEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)?，加?0mg CuBr與80mg三(3-羥基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過透析法制備。其具體方法如下：將50mg聚合物溶于5mL甲醇中；用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾；放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM(毫摩爾每升)pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，在室溫下，透析3天，最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH為7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

實(shí)施例2

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后在DMSO中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為5000)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8g十八酰氯。十八酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)?，插在瓶塞上。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg酰基化殼聚糖固體溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量2000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為5000)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mg PEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)猓尤?0mg CuBr與80mg THPTA，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過透析法制備。其具體方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾。放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM pH7.4的PBS中，在室溫下，透析3天。最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

實(shí)施例3

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后在DMSO中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為10000)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)?，插在瓶塞上。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg?；瘹ぞ厶枪腆w溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量2000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為10000)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mg PEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)?，加?0mg CuBr與80mg THPTA，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過透析法制備。其具體方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾。放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM pH為7.4的PBS中，在室溫下，透析3天。最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

實(shí)施例4

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后在DMSO中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為3500)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)?，插在瓶塞上。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg?；瘹ぞ厶枪腆w溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為1000)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mgPEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)?，加?0mg CuBr與80mg THPTA，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過透析法制備。其具體方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾。放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM pH7.4的PBS中，在室溫下，透析3天。最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

實(shí)施例5

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后在DMSO中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為3500)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)?，插在瓶塞上。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg?；瘹ぞ厶枪腆w溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為1000)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mgPEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)猓尤?0mg CuBr與80mg THPTA，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過透析法制備。其具體方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾。用以上溶液用注射器吸取，將藥物放在50mM的PBS中攪拌，將以上注射器的夜里慢慢注入含有藥物的PBS中。最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

實(shí)施例6

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后在DMSO中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為3500)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)猓逶谄咳?。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg?；瘹ぞ厶枪腆w溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為1000)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mg PEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)?，加?0mg CuBr與80mg THPTA，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過透析法制備。其具體方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾。放入燒瓶內(nèi)，將甲醇蒸發(fā)后，加入在50mM的PBS中超聲，最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

實(shí)施例7

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后在DMSO中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為3500)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)?，插在瓶塞上。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg酰基化殼聚糖固體溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為1000)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mg PEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)?，加?0mgCuBr與80mg THPTA，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過乳化溶劑蒸發(fā)法制備。其具體方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾。再加入0.1ml的水，攪拌形成W/O型乳狀液，再加較大量水進(jìn)行第二次乳化得W/O/W型復(fù)乳，再蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

實(shí)施例8

1、制備電荷轉(zhuǎn)換型藥物載體：

a、D-PLL-DMMA的合成

稱取11.2g Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸固體溶解在于180mL無水四氫呋喃中；稱取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固體溶于40mL無水四氫呋喃中，倒入等壓漏斗中。在油浴反應(yīng)中，反應(yīng)溫度保持在50℃左右。將已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-芐氧羧基-L-賴氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反應(yīng)0.5h。將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸蒸發(fā)濃縮至20～30mL。用200mL無水正丁烷沉淀產(chǎn)物，-4℃重結(jié)晶6h抽濾，除去濾液。將抽濾所得固體在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下儲(chǔ)存；

在冰水浴中，將20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常溫下，反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后在DMSO中透析12h，然后在去離子水中透析24h(分子截留量為3500)，凍干；

先用CF₃COOH將P(Lys-芐氧基)溶解，再將33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反應(yīng)2h。凍干；

將脫芐氧基后的聚賴氨酸P(Lys)溶于3mL去離子水中，用0.1N的NaOH溶液緩慢滴加調(diào)節(jié)pH，使其pH平衡在8～10之間。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后測試pH，緩慢滴加0.2N的NaOH，確保其pH平衡在8～10之間。

b、肽14-PEG-g-HC的合成

稱取2g殼聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，攪拌至殼聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，將氣球充入適量氮?dú)?，插在瓶塞上。室溫下磁力攪?h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。離心，離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，棄去上清液。然后將固體產(chǎn)物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱溫度設(shè)定為35℃；

稱取200mg?；瘹ぞ厶枪腆w溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亞胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)24h；將反應(yīng)產(chǎn)物一滴一滴地滴入20mL無水乙醚中，沉淀出來，重復(fù)操作3～5次。將所得產(chǎn)物在去離子水中透析2天(分子截留量為1000)，期間每隔0.5～1h更換一次水；

N3-肽14與PEG-g-HC是通過Click反應(yīng)連接，300mg PEG-g-HC與100mg N3-肽14溶于20mL去離子水中，通入連續(xù)的氮?dú)?，加?0mg CuBr與80mg THPTA，在常溫下反應(yīng)24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，凍干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。

2.電荷轉(zhuǎn)換型納米納米藥物組合物的制備

肽14-PEG-g-HC膠束通過逆向蒸發(fā)法制備。其具體方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的過濾器把不溶灰塵過濾。再加入0.5ml的水，攪拌形成W/O型乳狀液，再蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，逆向蒸發(fā)法獲得的囊泡體積相對較大，最后溶度為1mg/mL；

D-PLL-DMMA溶于pH為7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的過濾器過濾。將此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS膠束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入藥物，其兩滴的間隔時(shí)間為5min。由此制得電荷轉(zhuǎn)換型納米藥物組合物。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。