本發(fā)明系關(guān)于一種用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物以及其有效成分之用途。

背景技術(shù)：

自體免疫疾病，是一種人體內(nèi)自己的免疫系統(tǒng)攻擊自己身體正常細胞的疾病。于自體免疫患者中，免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生出對抗自己身體內(nèi)正常細胞(甚至細胞內(nèi)的各種正常組成部份)的抗體，造成不正常的過度發(fā)炎反應或是組織傷害，進而影響身體健康。

而自體免疫性疾病，如紅斑性狼瘡(lupuserythematosus)通常影響多重器官，包括腦、肺與腎臟。造成紅斑性狼瘡的確切病因不明，可能與遺傳、賀爾蒙、環(huán)境與感染有關(guān)。盡管紅斑性狼瘡的死亡率在1950年代之后已經(jīng)逐漸降低，然而，患者仍受病癥反復發(fā)作之苦。

因此，目前仍亟需開發(fā)一種更有效之針對如紅斑性狼瘡等的自體免疫疾病治療藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物，包括：一有效量之蕓香科(rutaceae)植物的萃取物為治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的有效成分，其中該自體免疫疾病系擇自于由紅斑性狼瘡(lupuserythematosus)、干癬(psoriasis)、干癬性關(guān)節(jié)炎(psoriaticarthritis)、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis)、克隆氏癥(crohn'sdisease)與潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,uc)所組成之群組。

本發(fā)明也提供一種蕓香科植物的萃取物用于制造治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎之藥物的用途，其中該自體免疫疾病系擇自于由紅斑性狼瘡、干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥與潰瘍性結(jié)腸炎所組成之群組。

本發(fā)明還提供另一種用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物，包括：一有效量之化合物，為治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的有效成分，其中該化合物擇自由下列所組成之群組的至少一個：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

以及

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1為c1-c5烷基、r2為h或c1-c3烷基、r3為h或c1-c3烷基、r4為h或c1-c3烷基，而r5為h或c1-c3烷基。

本發(fā)明另提供一種化合物用于制造治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎之藥物的用途，其中該化合物系擇自由下列所組成之群組的至少一個：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

以及

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1為c1-c5烷基、r2為h或c1-c3烷基、r3為h或c1-c3烷基、r4為h或c1-c3烷基，而r5為h或c1-c3烷基。

為了讓本發(fā)明之上述和其他目的、特征、和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合所附圖示，作詳細說明如下：

附圖說明

圖1a顯示，黃皮(clausenalansium)之乙醇萃取物he-07對于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中之發(fā)炎因子tnf-α產(chǎn)生的影響。

圖1b顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07對于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中之發(fā)炎因子il-6產(chǎn)生的影響。

圖2a顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07對于nzbwf1/j小鼠之尿液中的蛋白質(zhì)含量的影響。

圖2b顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07對于nzbwf1/j小鼠之血清中尿素氮含量的影響。

圖2c顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07對于nzbwf1/j小鼠之血清中肌酸酐含量的影響。

圖2d顯示，經(jīng)載劑、黃皮之乙醇萃取物he-07與環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,ctx)處理之nzbwf1/j小鼠之腎臟組織病理染色結(jié)果。

圖2e顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07對于nzbwf1/j小鼠之腎臟發(fā)炎、腎小管病變與腎絲球炎的影響。

圖2f顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07對于nzbwf1/j小鼠之存活率的影響。以kaplan-meier法及graphpadprism6軟體進行存活率分析，各組均與載劑組進行比較，結(jié)果顯示300mg/kghe-07組與載劑組有顯著差異(p<0.05)，50mg/kgctx組與載劑組亦有顯著差異(p<0.01)。

圖3a顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07對于馬兜鈴酸誘發(fā)腎炎之小鼠之體重變化的影響。

圖3b顯示，經(jīng)載劑、黃皮之乙醇萃取物he-07與未經(jīng)處理之小鼠于馬兜鈴酸投予后第12天的體重變化。相較于載劑處理組具顯著差異：*p<0.05。

圖4a顯示，經(jīng)載劑、黃皮之乙醇萃取物he-07與未經(jīng)處理之小鼠于馬兜鈴酸投予后第7天的血清中尿素氮(bun)含量。相較于載劑處理組具顯著差異：*p<0.05；**p<0.01。

圖4b顯示，經(jīng)載劑、黃皮之乙醇萃取物he-07與未經(jīng)處理之小鼠于馬兜鈴酸投予后第12天的血清中尿素氮(bun)含量。相較于載劑處理組具顯著差異：*p<0.05。

圖5a顯示，經(jīng)載劑、黃皮之乙醇萃取物he-07與未經(jīng)處理之小鼠于馬兜鈴酸投予后第7天的血清中肌酸酐(cre)含量。相較于載劑處理組具顯著差異：**p<0.01。

圖5b顯示，經(jīng)載劑、黃皮之乙醇萃取物he-07與未經(jīng)處理之小鼠于馬兜鈴酸投予后第12天的血清中肌酸酐(cre)含量。相較于載劑處理組具顯著差異：**p<0.01；***p<0.001。

圖6顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之6個化合物的結(jié)構(gòu)。

圖7a顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中對于發(fā)炎因子tnf-α產(chǎn)生的影響。

圖7b顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中對于發(fā)炎因子mcp-1產(chǎn)生的影響。

圖8a顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在紅斑性狼瘡動物模式中對于小鼠體重的影響。

圖8b顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在紅斑性狼瘡動物模式中對于小鼠存活率的影響。以kaplan-meier法及graphpadprism6軟體進行存活率分析，各組均與載劑組進行比較，結(jié)果顯示300mg/kghe-07-x組與50mg/kgctx組均與載劑組有顯著差異(p<0.01)。

圖9a顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在紅斑性狼瘡動物模式中對于小鼠之腎臟發(fā)炎的影響?？ǚ綑z定(chisquaretest)，*p<0.05(相較于載劑處理)。

圖9b顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在紅斑性狼瘡動物模式中對于小鼠之腎小管病變的影響?？ǚ綑z定，*p<0.05(相較于載劑處理)。

圖9c顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x在紅斑性狼瘡動物模式中對于小鼠之腎絲球炎的影響?？ǚ綑z定，*p<0.05(相較于載劑處理)。

圖10a與圖10b顯示，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物f4m、f5m、f3m與f6m對于發(fā)炎因子tnf-α產(chǎn)生的影響。n＝5，結(jié)果顯示為平均值±標準差：學生t檢驗(student’st-test)，**p<0.01；***p<0.001(相較于載劑處理)。

圖11a與圖11b顯示，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物f4m、f5m、f3m與f6m對于發(fā)炎因子il-6產(chǎn)生的影響。n＝5，結(jié)果顯示為平均值±標準差：學生t檢驗，*p<0.05；**p<0.01(相較于載劑處理)。

圖12a與圖12b顯示，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物f4m、f5m、f3m與f6m對于發(fā)炎因子mcp-1產(chǎn)生的影響。n＝5，結(jié)果顯示為平均值±標準差：學生t檢驗，**p<0.01；***p<0.001(相較于載劑處理)。

圖13顯示，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之he-07-fr4(其中含有大于80％之化合物f4m)在紅斑性狼瘡動物模式中對于小鼠存活率的影響。以kaplan-meier法及graphpadprism6軟體進行存活率分析，各組均與載劑組進行比較，結(jié)果顯示50mg/kghe-07-fr4組與載劑組有顯著差異(p<0.05)，50mg/kgctx組與載劑組亦有顯著差異(p<0.01)。

實施方式

本發(fā)明提供一種用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物，其可抑制il-17產(chǎn)生及抑制發(fā)炎等，并具有治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的效果。上述自體免疫疾病的例子，可包括，但不限于紅斑性狼瘡(lupuserythematosus)、干癬(psoriasis)、干癬性關(guān)節(jié)炎(psoriaticarthritis)、僵直性脊髓炎(ankylosingspondylitis)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis)、克隆氏癥(crohn'sdisease)與潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,uc)等。

上述本發(fā)明之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物，可包括，但不限于一有效量之蕓香科植物的萃取物，其中蕓香科植物的萃取物為自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的有效成分。在一實施例中，本發(fā)明之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物，可更包括一藥學上可接受之載體或鹽類。

于上述本發(fā)明之醫(yī)藥組合物中，上述蕓香科植物可包括黃皮屬(clausena)植物、月橘屬(murraya)植物或柑橘屬(citrus)植物，但不限于此。又，上述黃皮屬植物的例子可包括，但不限于黃皮(clausenalansium)、過山香(clausenaexcavataburm.f.)等。上述月橘屬植物的例子，可包括，但不限于山黃皮(murrayaeuchrestifolia)、七里香(murrayapaniculata)等。上述柑橘屬植物的例子則可包括，但不限于柚(citrusgrandis)、桶柑(citrustankan)等。

于上述本發(fā)明之醫(yī)藥組合物中，上述蕓香科植物的萃取物可以一醇類(例如，甲醇、乙醇或丙醇)、一酯類(例如，乙酸乙酯)、一烷類(例如，己烷)或一鹵烷(例如，氯甲烷、氯乙烷)萃取而得，但并不以此為限。在一實施例中，上述蕓香科植物的萃取物可以乙醇萃取而得。

在一實施例中，上述本發(fā)明之醫(yī)藥組合物中，上述蕓香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物。于此實施例中，黃皮之乙醇萃取物之指標成分可包括o-甲基獨活屬醇(o-methylheraclenol)、栓翅芹內(nèi)酯(prangenin)、ζ-黃皮酰胺(ζ-clausenamide)、歐前胡素(imperatorin)、8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen)與印度黃皮唑堿(indizoline)，但不限于此。又，于此實施例中，于黃皮之乙醇萃取物中對于自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎有治療或減緩功效的活性成分，可包括，栓翅芹內(nèi)酯、ζ-黃皮酰胺、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素、印度黃皮唑堿或其任意之組合，但不限于此。

在上述蕓香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物的實施例中，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡。而上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又于此實施例中，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡的并發(fā)癥，例如狼瘡腎炎。再者，于此實施例中，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物也可用于治療或減緩一般腎炎。

本發(fā)明也提供一種以化合物為主要有效成分之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物。

上述本發(fā)明之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物，可包括，但不限于，一有效量之化合物，其為治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的有效成分，其中上述化合物系可擇自下列化合物之至少一個：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

與

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1為c1-c5烷基、r2為h或c1-c3烷基、r3為h或c1-c3烷基、r4為h或c1-c3烷基，而r5為h或c1-c3烷基。

又，上述自體免疫疾病的例子，可包括紅斑性狼瘡、干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥與潰瘍性結(jié)腸炎等，但不限于此。

在一實施例中，上述本發(fā)明之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物，可更包括一藥學上可接受之載體或鹽類。

而于上述本發(fā)明之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物中，具有式(i)之化合物的例子，可包括栓翅芹內(nèi)酯、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素等，但不限于此。具有式(ii)之化合物的例子可包括，但不限于，ζ-黃皮酰胺等。具有式(iii)之化合物的例子可包括，印度黃皮唑堿等，但不限于此。

在一實施例中，于上述本發(fā)明之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物中，具有式(i)之化合物可為栓翅芹內(nèi)酯、歐前胡素或8-牛兒醇基補骨脂素，具有式(ii)之化合物可為ζ-黃皮酰胺而具有式(iii)之化合物可為印度黃皮唑堿。

在另一實施例中，上述本發(fā)明之用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物中系以具有式(i)之化合物為有效成分。于此實施例中，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡。上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又于此實施例中，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡的并發(fā)癥，例如狼瘡腎炎。另外，于此實施例中，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物可用于治療或減緩一般腎炎。在一特定實施例中，上述具有式(i)之化合物為8-牛兒醇基補骨脂素。

于上述任何本發(fā)明用于治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的醫(yī)藥組合物中，前述藥學上可接受之載體可包括，但不限于溶劑、分散媒(dispersionmedium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorptiondelaying)試劑等與藥學投予相容者。對于不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配置成劑型(dosageform)。

又，上述藥學上可接受之鹽類可包括，但不限于鹽類包括無機陽離子，例如，堿金屬鹽類，如鈉、鉀或胺鹽，堿土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環(huán)己胺鹽類、甲基-d-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸酰胺。

本發(fā)明所制備之藥物給藥可以口服、非口服、經(jīng)由吸入噴霧(inhalationspray)或藉由植入貯存器(implantedreservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮內(nèi)(intradermal)靜脈內(nèi)(intravenous)、肌肉內(nèi)(intramuscular)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intraarticular)、動脈內(nèi)(intraarterial)、滑囊(腔)內(nèi)(intrasynovial)、胸骨內(nèi)(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(nèi)(intralesional)注射以及灌注技術(shù)。

口服成分的形式可包括，但不限定于，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueoussuspensions)、分散液(dispersions)與溶液。

再者，本發(fā)明還提供一種蕓香科植物的萃取物用于制造治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎之藥物的用途。

上述藥物可抑制il-17產(chǎn)生及抑制發(fā)炎等，并具有治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的效果。而上述自體免疫疾病，可包括，紅斑性狼瘡、干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥與潰瘍性結(jié)腸炎等，但不限于此。

又，上述蕓香科植物可包括黃皮屬植物、月橘屬植物或柑橘屬植物，但不限于此。上述黃皮屬植物的例子可包括，但不限于黃皮、過山香等。上述月橘屬植物的例子可包括，但不限于山黃皮、七里香等。此外，上述柑橘屬植物的例子可包括，但不限于柚、桶柑等。

再者，上述蕓香科植物的萃取物可以一醇類(例如，甲醇、乙醇或丙醇)、一酯類(例如，乙酸乙酯)、一烷類(例如，己烷)或一鹵烷(例如，氯甲烷、氯乙烷)萃取而得，但并不以此為限。在一實施例中，上述蕓香科植物的萃取物可以乙醇萃取而得。

在一實施例中，上述蕓香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物。于此實施例中，黃皮之乙醇萃取物之指標成分可包括o-甲基獨活屬醇、栓翅芹內(nèi)酯、ζ-黃皮酰胺、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素與印度黃皮唑堿，但不限于此。又，于此實施例中，于黃皮之乙醇萃取物中對于自體免疫疾病及/或腎炎有治療或減緩功效的活性成分可包括，但不限于栓翅芹內(nèi)酯、ζ-黃皮酰胺、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素、印度黃皮唑堿或其任意之組合，但不限于此。

在上述蕓香科植物的萃取物為黃皮之乙醇萃取物的實施例中，在上述本發(fā)明蕓香科植物的萃取物用于制造治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎之藥物的用途中，所述藥物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡。上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又于此實施例中，所述藥物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡的并發(fā)癥，例如狼瘡腎炎。再者，于此實施例中，所述藥物可用于治療或減緩一般腎炎。

另外，本發(fā)明也提供一種化合物用于制造治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎之藥物的用途。上述化合物可擇自下列化合物之至少一個：

(a)具有式(i)之化合物：

(b)具有式(ii)之化合物：

與

(c)具有式(iii)之化合物：

其中r1為c1-c5烷基、r2為h或c1-c3烷基、r3為h或c1-c3烷基、r4為h或c1-c3烷基，而r5為h或c1-c3烷基。

上述化合物可為治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎的一有效成分。而上述自體免疫疾病的例子，則可包括紅斑性狼瘡、干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥與潰瘍性結(jié)腸炎等，但不限于此。

具有式(i)之化合物的例子，可包括栓翅芹內(nèi)酯、歐前胡素、8-牛兒醇基補骨脂素等，但不限于此。具有式(ii)之化合物的例子可包括，但不限于，ζ-黃皮酰胺等。又，具有式(iii)之化合物的例子可包括，印度黃皮唑堿等，但不限于此。

在一實施例中，于上述本發(fā)明之化合物用于制造治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎之藥物的用途中，具有式(i)之化合物可為栓翅芹內(nèi)酯、歐前胡素或8-牛兒醇基補骨脂，具有式(ii)之化合物可為ζ-黃皮酰胺，而具有式(iii)之化合物可為印度黃皮唑堿。

又在一實施例中，在本發(fā)明之化合物用于制造治療或減緩自體免疫疾病及/或其并發(fā)癥及/或腎炎之藥物的用途中，上述化合物系以具有式(i)之化合物為有效成分。于此實施例中，所述藥物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡。上述紅斑性狼瘡可為全身性紅斑性狼瘡。又于此實施例中，所述藥物可用于治療或減緩紅斑性狼瘡的并發(fā)癥，例如狼瘡腎炎。另外，于此實施例中，所述藥物可用于治療或減緩一般腎炎。在一特定實施例中，上述具有式(i)之化合物為8-牛兒醇基補骨脂素。

實施例

a.材料與方法

1.方法1：藥材之乙醇萃取物的制備

將藥材清洗或烘干后，進行粗粉碎。將500g藥材粉末加入5倍體積的95％乙醇，并以25℃震蕩萃取一周。將所獲得之萃取液進行抽氣過濾，以取得濾液并將其定量體積。之后，將濾液取樣2ml以進行高效液相色譜分析(highperformanceliquidchromatography,hplc)與薄層色層分析(thinlayerchromatography,tlc)分析。

將其余之濾液減壓濃縮至體積約30ml，之后分裝至冷凍干燥瓶并進行冷凍干燥，所獲得之冷凍干產(chǎn)物即為試驗藥物(萃取率：約3.5％)。

2.方法2：以周邊血液白血球(peripheralbloodleukocyte,pbl)細胞平臺篩選抑制il-17分泌的藥物

利用隱靜脈采血方式取得sd大鼠血液。將大鼠血液加入含edta離心管中(最終濃度為2mg/ml)充份混勻，之后加入4倍體積量的ack緩沖溶液以破解紅血球細胞。將上述離心管置于37℃水浴中5分鐘，加入4倍體積量的pbs緩沖溶液以3000rpm速度離心5分鐘，并除去上清液后。之后，重復破解紅血球細胞的步驟二次，并加入適量體積的細胞培養(yǎng)液。

將細胞植入于96孔盤中(2x10⁵個細胞/孔)，加入適當濃度的試驗藥物(10μl/孔)，并混合均勻。接著，將96孔盤放入37℃且含5％co2之細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。之后，于每孔加入刺激物丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,pma)(最終濃度為30ng/ml)及離子霉素(ionomycin)(最終濃度為1μg/ml)。于均勻混合后，將96孔盤置入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。

于培養(yǎng)48小時后，將96孔盤以3000rpm離心5分鐘，使細胞沉淀并將上清液(細胞培養(yǎng)液)移至新的96孔盤(約155μl/孔)。

將保留于原96孔盤中之細胞添加alamarblue(5μl/孔)，并放入37℃且含5％co2細胞培養(yǎng)箱中4小時。之后，利用elisa讀取儀以激發(fā)光560nm與發(fā)射光590nm檢測細胞存活率。

而將新的96孔盤中之細胞培養(yǎng)液稀釋2-4倍后，利用大鼠il-17elisa套組(ebioscience,88-7170)檢測其il-17含量。

細胞存活分析與il-17含量分析皆以添加丙二醇甲醚醋酸酯及離子霉素組為100％，并以百分比顯示il-17之分泌。

方法3：th17細胞分化試驗(th17differentiationassay)

c57bl/6小鼠由國家動物中心購入后即飼養(yǎng)于工研院動物站，并遵循工研院動物站使用實驗動物及實驗操作之規(guī)范(itri-iacuc-2012-025)。

將6-8周齡之c57bl/6小鼠的脾臟取出。之后利用cellstrainer(corning)將脾臟磨碎，并收集細胞懸浮液即為初級脾臟細胞。接著，利用imagmagneticsystem(bdpharmingen)依據(jù)其操作步驟自初級脾臟細胞分離出cd4+t細胞。

接著將cd4+t細胞加入24孔細胞培養(yǎng)盤中(5×10⁵個細胞/孔)，其中24孔細胞培養(yǎng)盤需于前一天以anti-cd3(1μg/ml；ebioscience)作吸附處理。然后將anti-cd28(ebioscience)加入24孔細胞培養(yǎng)盤以使t細胞活化，同時加入il-6(peprotech)、tgf-β(peprotech)、anti-ifn-γ(ebioscience)、anti-il-4(ebioscience)、anti-il-2(ebioscience)以進行th17細胞之分化，并于最后加入待測樣品。之后，將24孔細胞培養(yǎng)盤置于37℃且含5％co2之培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。

于培養(yǎng)3天后，將24孔細胞培養(yǎng)盤以1100rpm離心5分鐘，使細胞沉淀并將上清液(細胞培養(yǎng)液)移至新的24孔盤(950μl/孔)。

將保留于原24孔盤中之細胞添加alamarblue(abdserotec)(20μl/孔)，并于37℃且含5％co2之培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)6小時。于上述培養(yǎng)后，利用連續(xù)波長微孔盤分析儀測量細胞于波長570nm與600nm之吸光值，并依據(jù)產(chǎn)品建議之分析公式計算細胞存活率。

將上述細胞培養(yǎng)液進行5倍稀釋，接著利用市售套組mouseil-17aelisa(ebioscience)并根據(jù)產(chǎn)品所建議之操作步驟分析其中之il-17表現(xiàn)量。

4.方法4：以ifn-γ誘導單核球細胞產(chǎn)生cxcl9之試驗

自bcrc取得人類單核球細胞(thp-1)細胞。首先，將thp-1細胞(2×10⁴/ml)種于96孔培養(yǎng)盤中。經(jīng)于37℃且含5％co2之培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時后，加入重組人類ifn-γ(1mg/ml)與待測樣品于96孔培養(yǎng)盤中共同培養(yǎng)24小時。

于培養(yǎng)24小時后，將96孔培養(yǎng)盤以1100rpm離心3分鐘，使細胞沉淀并將上清液(細胞培養(yǎng)液)移至新的96孔培養(yǎng)盤(90μl/孔)。

將保留于原96孔盤中之細胞添加alamarblue(abdserotec；cat.no.buf012b)，并于37℃且含5％co2之培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4小時。于上述培養(yǎng)后，利用連續(xù)波長微孔盤分析儀測量細胞于波長570nm與600nm之吸光值，并透過下列公式計算細胞存活率：

細胞存活率＝(11,726×實驗組od570)–(80,586×實驗組od600)/(11,726×對照組od570)–(80,586×對照組od600)×100％，其中，11,726與80,586分別為alamarblue在od570與od600之莫耳吸光系數(shù)。

利用人類cxcl9/migduosetelisa(r&d；cat.no.dy392)并根據(jù)產(chǎn)品所建議之操作步驟分析細胞培養(yǎng)液之cxcl9表現(xiàn)量。

5.方法5：脂多醣(lipopolysaccharide,lps)誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式

5.1balb/c小鼠

6-8周大之balb/c公鼠系購自樂斯科生物科技股份有限公司(biolascotaiwanco.,ltd)。之后進入工研院動物實驗站一般小鼠實驗區(qū)進行為期一周之檢疫工作，飼養(yǎng)條件符合國家實驗動物規(guī)范。進動物當天即將小鼠進行標示、分籠及秤重。于檢疫期間觀察小鼠之活動力與環(huán)境適應性。一周后，若小鼠體重正常增加，則將其移入飼養(yǎng)區(qū)等待實驗之進行。

飼養(yǎng)區(qū)之光照時間自動控制為12小時亮、12小時暗，溫度控制為23±2℃。動物可自由取得充分之食物及飲水。本品系實驗動物已有豐富的基礎(chǔ)參考資料與數(shù)據(jù)，可適用于發(fā)炎性功能評估試驗，實驗方法已獲得工研院iacuc委員會核準。

5.2小鼠之處理

于實驗前先將小鼠秤重并分組，使各組平均體重無明顯差異，并紀錄其臨床癥狀。實驗前2-4小時將小鼠禁食，但仍正常供應飲水。在以脂多醣(lipopolysaccharides,lps)刺激前/后特定時間，以口服、腹腔注射(ip)或靜脈注射(iv)方式給予小鼠試驗藥物，給藥后觀察并紀錄小鼠臨床癥狀，對照組則控制為給予相同體積之溶劑。以腹腔注射(ip)方式給予小鼠1mg/kg之脂多醣(0.25ml/小鼠)刺激，觀察并紀錄小鼠之臨床癥狀。

于以脂多醣刺激后1.5小時，將小鼠以過量co2安樂死，之后以心臟采血方式取得小鼠全血。

小鼠全血以6000rpm于4℃離心10分鐘。之后收集血漿，以進行tnf-α、il-6與mcp-1分泌量的測定。

5.3tnf-α、il-6與mcp-1分泌量的測定

血漿中之tnf-α、il-6與mcp-1分泌量系依照elisa套組分析步驟進行分析，步驟簡述如下：

室溫下，于elisa96孔盤加入捕捉抗體(captureantibody)混合液(100μl/孔)，以覆蓋elisa96孔盤的表面。隔夜后，吸干混合液并以清洗緩沖溶液(washbuffer)清洗elisa96孔盤(300μl/孔)，清洗三次，然后將阻礙緩沖溶液(blockbuffer)加至elisa96孔盤(200μl/孔)以覆蓋剩余空間，并在室溫下作用1小時。重復前述清洗步驟。

接著，將適當稀釋倍數(shù)之待測樣品及標準品加至elisa96孔盤(100μl/孔)，并在室溫下作用2小時。然后重復前述清洗步驟。

于清洗后，再將偵測抗體(detectionantibody)混合液加至elisa96孔盤(100μl/孔)，并于室溫下作用2小時。重復前述清洗步驟。

再將鏈霉親和素-山葵過氧化氫酵素(streptavidin-hrp)混合液加至elisa96孔盤(100μl/孔)，并于室溫下避光作用20分鐘。重復前述清洗步驟。

之后，將基質(zhì)溶液(substratesolution)(tmb)(100μl/孔)加至elisa96孔盤，并于室溫下避光作用20分鐘。最后，將終止溶液(stopsolution)(1nhcl)加至elisa96孔盤(50μl/孔)以終止顯色反應，并測定od450nm的吸光值。

5.4統(tǒng)計分析

本試驗數(shù)據(jù)以實驗結(jié)果之平均值(mean)±標準差(standarderror,s.e.)來表示。采用t-test比較各組間是否具差異性，若p值小于0.05則表示兩試驗組之間具有統(tǒng)計上顯著差異。

6.方法6：nzbwf1/j全身性紅斑性狼瘡(sle)自體免疫動物模式

6.1nzbwf1/j母鼠

nzbwf1/j母鼠系購自美國thejacksonlaboratory，動物檢疫后，代養(yǎng)至適當周齡(約16-25周大)。

實驗開始前，根據(jù)anti-dsdna抗體數(shù)值將小鼠隨機分組，之后開始給予測試樣品。一周投藥5天，連續(xù)投藥10-18周后犧牲動物。投藥期間每周記錄體重變化，且每1-2周輕壓小鼠腹部使排尿，以試紙及蛋白質(zhì)測定套組測定尿中白蛋白含量(mg/dl)。

實驗結(jié)束時，搜集尿液并以心臟采血方式取得小鼠全血。之后取下小鼠腎臟秤重并記錄其外觀病變，并保存于10％中性福馬林中以備做病理切片觀察之用。病理評分標準系依文獻shackelfordetal.toxicol.pathol.30:93-96做判斷，以0-5分表示：0分代表無(notpresent)；1分代表極微(minimal)(<1％)；2分代表輕微(slight)(1-25％)；3分代表中度(moderate)(26-50％)；4分代表中/重度(moderate/severe)(51-75％)；5分代表嚴重(severe)(76-100％)。

6.2測定尿中蛋白質(zhì)含量

每1-2周輕壓小鼠腹部(膀胱)使其排尿，并將尿液收集于1.5ml離心管中，以尿液試紙測定尿液中的蛋白質(zhì)含量(mg/dl)。以試紙沾染尿液，靜置1分鐘，依據(jù)試紙呈色結(jié)果判定蛋白質(zhì)含量。其中以“-”代表尿蛋白含量為0mg/dl；以“+/-”代表尿蛋白含量為10mg/dl；以“+”代表尿蛋白含量為30mg/dl；以“++”代表尿蛋白含量為100mg/dl；以“+++”代表尿蛋白含量為300mg/dl；以“++++”代表尿蛋白含量為1000mg/dl。若呈色介于兩個區(qū)間之間，則取兩區(qū)間之平均值為尿蛋白數(shù)值。

6.3測定血清中尿素氮(bloodureanitrogen,bun)及肌酸酐(creatinine,cre)的含量

以尾巴采血方式自小鼠取得約0.1ml血液。將血液于室溫下靜置1-2小時后，以6,000rpm于室溫離心10分鐘。之后取上層血清測定血清中尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)的含量。

血清中尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)的含量以fujichem4000i干式血清生化儀進行測定，步驟簡述如下：

實驗前先將尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)試片及待測血清置于室溫下回溫。之后，依儀器指示在試片中央加入10μl之血清原液(如數(shù)值超出測定范圍則將血清以滅菌水進行適當稀釋后測定)，并進行測定。待測定完成則可得到血清中尿素氮(bun)及肌酸酐(cre)的含量(mg/dl)。

7.方法7：馬兜鈴酸(aristolochicacid,aa)誘發(fā)之腎炎模式建立

將雌性balb/c小鼠(lasco,taiwan)以口服方式投予試驗藥物(250mg/kg及750mg/kg)。3天后，再以腹腔注射每日投予5mg/kg的馬兜鈴酸至balb/c小鼠。馬兜鈴酸投予過程中，仍持續(xù)投予小鼠試驗藥物(250mg/kg及750mg/kg)并記錄其體重變化。連續(xù)注射馬兜鈴酸12天之后犧牲小鼠，并采集血清以進行后續(xù)血清生化值(尿素氮(bun)及肌酸酐(cre))分析。血清生化值以富士干式生化分析儀(4000i,fuji)進行分析。

8.方法8：以el4細胞平臺篩選抑制il-17分泌藥物

將el4細胞植入于96孔盤(1x10⁵細胞/孔)，加入適當濃度之試驗藥物(10μl/孔)，并混合均勻。

接著，將96孔盤放入37℃且含5％co2之細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。之后，于每孔加入刺激物丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,pma)(最終濃度為10ng/ml)及離子霉素(ionomycin)(最終濃度為5ng/ml)。于均勻混合后，將96孔盤置入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時。

于培養(yǎng)18小時后，將96孔盤以1200rpm離心5分鐘，使細胞沉淀并將上清液(細胞培養(yǎng)液)移至新的96孔盤(155μl/孔)。

將保留于原96孔盤中之細胞添加5mg/ml之mtt(5μl/孔)，并放入37℃且含5％co2之細胞培養(yǎng)箱中1小時。之后將dmso添加至細胞(150μl/孔)，以將結(jié)晶紫溶出。將96孔盤中之液體混合均勻之后，測定各孔于570nm之吸光值，以測定細胞存活率。

而將新的96孔盤中之細胞培養(yǎng)液稀釋2-4倍后，利小鼠il-17elisa套組(r&d,dy421e)檢測其il-17含量。

細胞存活分析與il-17含量分析皆以添加丙二醇甲醚醋酸酯及離子霉素組為100％，并以百分比顯示il-17之分泌。

b.結(jié)果

(a)黃皮之乙醇萃取物的作用

以上述方法1獲得黃皮之乙醇萃取物，將其命名為he-07。

1.黃皮之乙醇萃取物he-07對于周邊血液白血球(peripheralbloodleukocyte,pbl)細胞與th17細胞的影響

分別以上述方法2與方法3來確認黃皮之乙醇萃取物(he-07)對于大鼠周邊血液白血球與cd4+t細胞所分化成之th17細胞之存活率與il-17分泌的影響。結(jié)果分別如表1與表2所示。

表1、黃皮之乙醇萃取物he-07對于大鼠周邊血液白血球之存活率與il-17分泌的影響

表2、黃皮之乙醇萃取物he-07對于cd4+t細胞所分化成之th17細胞之存活率與il-17分泌的影響

表1與表2顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07可有效抑制兩種不同細胞之il-17分泌。

目前已知il-17在自體免疫疾病，如干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎等之中扮演了關(guān)鍵性角色，且il-17的單株抗體已于臨床實驗證實對于上述自體免疫疾病具有顯著的治療效果，此外動物實驗與臨床資料顯示，il-17與紅斑性狼瘡相關(guān)。因此，具備抑制il-17分泌之功效的黃皮之乙醇萃取物應可應用于上述自體免疫疾病的治療。

2.黃皮之乙醇萃取物he-07對于以ifn-γ誘導單核球細胞所產(chǎn)生cxcl9的影響

cxcl9為紅斑性狼瘡相關(guān)趨化因子。以上述方法4與來確認黃皮之乙醇萃取物he-07對于以ifn-γ誘導單核球細胞所產(chǎn)生cxcl9的影響。結(jié)果如表3所示。

表3、黃皮之乙醇萃取物he-07對于以ifn-γ誘導單核球細胞所產(chǎn)生cxcl9的影響

結(jié)果顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07能夠有效抑制以ifn-γ所誘導之單核球細胞的cxcl9分泌。

3.黃皮之乙醇萃取物he-07對于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中之發(fā)炎因子tnf-α與il-6產(chǎn)生的影響

tnf-α與il-6為目前公認與發(fā)炎相關(guān)之因子。以上述方法5與來確認黃皮之乙醇萃取物he-07對于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中之發(fā)炎因子tnf-α與il-6產(chǎn)生的影響。結(jié)果分別如圖1a與圖1b所示。

依據(jù)圖1a與圖1b可知，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，黃皮之乙醇萃取物he-07可顯著抑制之發(fā)炎因子tnf-α與il-6的產(chǎn)生。

由于黃皮之乙醇萃取物對于tnf-α或il-6有顯著的抑制效果，而已知tnf-α或il-6涉及自體免疫疾病，因此應可將黃皮之乙醇萃取物應用于類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥、潰瘍性結(jié)腸炎等自體免疫疾病的治療或減緩。

4.黃皮之乙醇萃取物(he-07)對于nzbwf1/j小鼠的作用

nzbwf1/j小鼠為常用之全身性紅斑性狼瘡自體免疫動物模式。以上述方法6來確認黃皮之乙醇萃取物(he-07)對于nzbwf1/j小鼠之作用。結(jié)果如第2a至2f圖及表4所示。

表4、黃皮之乙醇萃取物(he-07)對于nzbwf1/j小鼠之存活率的影響

kaplan-meier法

圖2a顯示，黃皮之乙醇萃取物he-07可有效減少nzbwf1/j小鼠之尿液中的蛋白質(zhì)含量。又，由圖2b與圖2c可知，黃皮之乙醇萃取物he-07可有效降低nzbwf1/j小鼠之血清中尿素氮與肌酸酐含量。

而依據(jù)圖2d與圖2e可知，于nzbwf1/j小鼠中，黃皮之乙醇萃取物he-07可顯著減少腎臟發(fā)炎細胞浸潤，并顯著降低腎小管病變與腎絲球炎。

再者，圖2f及表4顯示，黃皮之乙醇萃取物(he-07)可顯著提高nzbwf1/j小鼠的存活率。

由于黃皮之乙醇萃取物有效改善紅斑性狼瘡動物模式nzbwf1/j小鼠之腎炎并提高其存活率，因此應可將其應用于治療紅斑性狼瘡與狼瘡腎炎。

5.黃皮之乙醇萃取物he-07對于以馬兜鈴酸誘發(fā)腎炎之小鼠的作用

以上述方法7來確認黃皮之乙醇萃取物he-07對于馬兜鈴酸誘發(fā)腎炎之小鼠之體重、血清中之尿素氮(bun)含量以及血清中之肌酸酐(cre)含量的影響。結(jié)果分別如第3a與3b圖、第4a與4b圖以及第5a與5b圖所示。

第3a與3b圖顯示，于馬兜鈴酸誘發(fā)小鼠腎炎12天后，黃皮之乙醇萃取物he-07具有減緩小鼠體重下降的效果。

而由第4a與4b圖可清楚得知，于馬兜鈴酸誘發(fā)小鼠腎炎后，黃皮之乙醇萃取物he-07顯著降低了小鼠血清中之尿素氮(bun)含量。

又，第5a與5b圖則顯示，于馬兜鈴酸誘發(fā)小鼠腎炎后，黃皮之乙醇萃取物he-07顯著降低了小鼠血清中之肌酸酐(cre)含量。

依據(jù)上述結(jié)果可知，黃皮之乙醇萃取物可有效改善馬兜鈴酸所誘發(fā)之腎炎，應可將其應用于腎炎相關(guān)治療。

(b)黃皮之乙醇萃取物的活性片段與其作用

1.黃皮之乙醇萃取物he-07之活性片段的確認

將黃皮之乙醇萃取物he-07經(jīng)由高效液相色譜分析與薄層色層分析分析，獲得各個黃皮之乙醇萃取物he-07之片段，并進行活性測試，以確認出其活性片段，并將其命名為he-07-x。

之后經(jīng)由核磁共振光譜法(nuclearmagneticresonancespectroscopy,nmrspectroscopy)分析，確認于he-07-x中之6個化合物，分別編碼為f8m、f7m、f6m、f5m、f4m與f3m。

f8m、f7m、f6m、f5m、f4m與f3m之結(jié)構(gòu)如圖6所示，其中f8m為o-甲基獨活屬醇(o-methylheraclenol)、f7m為栓翅芹內(nèi)酯(prangenin)、f6m為ζ-黃皮酰胺(ζ-clausenamide)、f5m為歐前胡素(imperatorin)、f4m為8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen)，與f3m為印度黃皮唑堿(indizoline)。

又，上述6個化合物于活性片段he-07-x中之含量，則如表5所示。

表5、活性片段he-07-x中之含量

依據(jù)表5可知，化合物f8m、f7m、f6m、f5m、f4m與f3m共占活性片段he-07-x的56.11wt％

2.活性片段he-07-x對于周邊血液白血球與el4細胞之il-17分泌的影響

分別以上述方法2與方法8來確認活性片段he-07-x對于大鼠周邊血液白血球與el4細胞之il-17分泌的影響。結(jié)果如表6所示。

表6、活性片段he-07-x對于大鼠周邊血液白血球與el4細胞之il-17分泌的影響

依據(jù)表6可知，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可抑制周邊血液白血球與el4細胞分泌il-17。

由于黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可抑制il-17分泌，而il-17的單株抗體已于臨床實驗中被證實對于自體免疫疾病具有顯著的治療效果，且動物實驗與臨床資料顯示il-17與紅斑性狼瘡相關(guān)。因此應可將其應用于自體免疫疾病，如干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等的治療。

3.活性片段he-07-x對于以ifn-γ誘導單核球細胞所產(chǎn)生cxcl9的影響

以上述方法4與來確認活性片段he-07-x對于以ifn-γ誘導單核球細胞所產(chǎn)生cxcl9的影響。結(jié)果如表7所示。

表7、活性片段he-07-x對于以ifn-γ誘導單核球細胞所產(chǎn)生cxcl9的影響

依據(jù)表7可知，黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可抑制th-1細胞分泌cxcl9。

4.活性片段he-07-x對于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中之發(fā)炎因子tnf-α與mcp-1產(chǎn)生的影響

tnf-α與mcp-1為目前公認與發(fā)炎相關(guān)之因子。以上述方法5與來確認活性片段he-07-x在脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中對于發(fā)炎因子tnf-α與mcp-1產(chǎn)生的影響。結(jié)果分別如第7a圖與第7b圖所示。

依據(jù)第7a圖與第7b圖可知，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，活性片段he-07-x可顯著抑制發(fā)炎因子tnf-α與mcp-1的產(chǎn)生并具有劑量效應。

由于黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x對于tnf-α或mcp-1有顯著的抑制效果，而已知tnf-α及mcp-1涉及自體免疫疾病，因此應可將其應用于類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥、潰瘍性結(jié)腸炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等自體免疫疾病的治療或減緩。

5.活性片段he-07-x對于nzbwf1/j小鼠的作用

以上述方法6來確認活性片段he-07-x對于nzbwf1/j小鼠之作用。結(jié)果如第8a與8b圖與表8，以及第9a至9c圖所示。

表8、活性片段he-07-x對于nzbwf1/j小鼠之存活率的影響

kaplan-meier法

第8a圖顯示，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予300mg/kg之活性片段he-07-x可使小鼠體重穩(wěn)定地增加。

又，根據(jù)第8b圖與表8可以清楚得知，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予300mg/kg之活性片段he-07-x可以大幅提高小鼠之存活率。

而依據(jù)第9a至9c圖可知，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予300mg/kg之活性片段he-07-x可顯著減緩小鼠腎臟發(fā)炎，并顯著降低腎小管病變與減緩腎絲球炎。

由于黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x可有效改善紅斑性狼瘡動物模式nzbwf1/j小鼠之腎炎并提高其存活率，因此應可將其應用于治療紅斑性狼瘡與狼瘡腎炎。

(c)黃皮之乙醇萃取物的活性成分與其作用

將前述存在于黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x之6個化合物中占較高重量比例之5個化合物，f7m、f6m、f5m、f4m與f3m進一步確認其個別之功效。

1.黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物對于周邊血液白血球與el4細胞之il-17分泌的影響

分別以上述方法2與方法8來確認活性片段he-07-x中之化合物對于周邊血液白血球與el4細胞之il-17分泌的影響。結(jié)果如表9所示。

表9、活性片段he-07-x中之化合物對于周邊血液白血球與el4細胞之il-17分泌的影響

依據(jù)表9可知，在從黃皮分離出之上述6個化合物中，f3m(印度黃皮唑堿(indizoline))、f4m(8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen))、f5m(歐前胡素(imperatorin))、f6m(ζ-黃皮酰胺(ζ-clausenamide))與f7m(栓翅芹內(nèi)酯(prangenin))具有抑制il-17分泌之活性。

由于f3m(印度黃皮唑堿)、f4m(8-牛兒醇基補骨脂素)、f5m(歐前胡素)、f6m(ζ-黃皮酰胺)與f7m(栓翅芹內(nèi)酯)可抑制il-17分泌，而il-17的單株抗體已于臨床實驗中被證實對于自體免疫疾病具有顯著的治療效果，因此應可將其應用于自體免疫疾病，如干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等的治療。

4.黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物對于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中之發(fā)炎因子tnf-α、il-6與mcp-1產(chǎn)生的影響

以上述方法5與來確認活性片段he-07-x中之化合物對于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中之發(fā)炎因子tnf-α、il-6與mcp-1產(chǎn)生的影響。結(jié)果分別如第10a與10b圖、第11a與11b圖與第12a與12b圖所示。

第10a與10b圖顯示，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，f4m與f5m可顯著抑制發(fā)炎因子tnf-α的產(chǎn)生。第11a與11b圖顯示，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，f4m、f3m與f6m可顯著抑制發(fā)炎因子il-6的產(chǎn)生。而第12a與12b圖顯示，于脂多醣誘發(fā)小鼠急性發(fā)炎模式中，f4m、f5m、f3m與f6m皆可顯著抑制發(fā)炎因子mcp-1的產(chǎn)生。

依據(jù)上述結(jié)果可知，在從黃皮分離出之上述6個化合物中，f3m(印度黃皮唑堿(indizoline))、f4m(8-牛兒醇基補骨脂素(8-geranyloxypsoralen))、f5m(歐前胡素(imperatorin))與f6m(ζ-黃皮酰胺(ζ-clausenamide))具有抗發(fā)炎之活性。

由于f3m(印度黃皮唑堿)、f4m(8-牛兒醇基補骨脂素)、f5m(歐前胡素)與f6m(ζ-黃皮酰胺)對于tnf-α、il-6與mcp-1有顯著的抑制效果，因此應可將其應用于類風濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型自發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、克隆氏癥、潰瘍性結(jié)腸炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等自體免疫疾病的治療或減緩。

5.黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物對于nzbwf1/j小鼠的作用

以上述方法6來確認黃皮之乙醇萃取物的活性片段he-07-x中之化合物對于nzbwf1/j小鼠之作用。結(jié)果如第13圖以及表10所示。

表10、活性片段he-07-fr4(含有大于80％之f4m)對于nzbwf1/j小鼠之存活率的影響

kaplan-meier法

第13圖及表10顯示，在紅斑性狼瘡動物模式中，投予50mg/kg之活性片段he-07-fr4(含有大于80％之f4m(8-牛兒醇基補骨脂素))12周可顯著提高小鼠之存活率。

由于f4m(8-牛兒醇基補骨脂素)可有效改善紅斑性狼瘡動物模式nzbwf1/j小鼠之存活率，因此應可將其應用于治療紅斑性狼瘡。

(d)蕓香科植物之乙醇萃取物的作用

將其他蕓香科植物分別以上述方法1獲得乙醇萃取物。上述其他蕓香科植物分別為，屬于黃皮屬之過山香，屬于月橘屬之七里香與山黃皮，以及屬于柑橘屬之柚與桶柑。

以上述方法8來確認其他蕓香科植物之乙醇萃取物對于el4細胞之il-17分泌的影響。結(jié)果如表11所示。

表11、其他蕓香科植物之乙醇萃取物對于el4細胞之il-17分泌的影響

依據(jù)表11可知，黃皮之近源屬種植物，屬于黃皮屬之過山香、屬于月橘屬之七里香與山黃皮，以及屬于柑橘屬之柚與桶柑之乙醇萃取物皆可抑制el4細胞分泌il-17。

由于，屬于黃皮屬之過山香、屬于月橘屬之七里香與山黃皮，以及屬于柑橘屬之柚與桶柑之乙醇萃取物皆可抑制il-17分泌，而il-17的單株抗體已于臨床實驗中被證實對于自體免疫疾病具有顯著的治療效果，因此應可將其應用于自體免疫疾病，如干癬、干癬性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊髓炎、紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎等的治療。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當可作些許之更動與潤飾，因此本發(fā)明之保護范圍當視后附之權(quán)利要求所界定者為準。