本發(fā)明涉及藥物用途領域，具體地，涉及噻唑酰胺衍生物在制備抗骨質疏松藥物中的應用。

背景技術：

骨質疏松癥(osteoprosis簡稱op)是以骨量減少，骨組織微細結構破壞導致骨脆性增加和骨折危險性增加為特征的一種系統(tǒng)性、全身性骨骼疾病。臨床表現(xiàn)和體征主要是疼痛，其次為身長縮短、駝背、骨折及呼吸系統(tǒng)障礙。流行病學調(diào)研顯示，50歲以上的人群中，約有50％的女性和20％的男性有骨折的風險(rachner,khoslaetal.2011)。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示：到2050年，我國50歲以上的人口將近全國人口的一半(49％)，約6.36億，預計到2050年我國骨質疏松患者數(shù)目約為3億人。

破骨細胞(osteoclast)和成骨細胞(osteoblast)之間的比例失衡是骨質疏松產(chǎn)生的病理基礎(rachner,khoslaetal.2011)。破骨細胞分化相對增多或成骨細胞分化相對減少，都會造成骨量流失，引起骨質疏松。降低骨吸收、促進骨合成是當前臨床上治療骨質疏松的主要治療手段。骨吸收抑制劑主要有雌激素受體調(diào)控劑如他莫昔芬，托瑞米芬，屈洛昔芬，雷洛昔芬，阿佐昔芬，巴多昔芬，依普黃酮等、雙磷酸酯/鹽類如乙醇酸膦酸鹽，氯膦酸鹽，帕米膦酸，鹵素磷酸鹽，磷酸艾倫，利塞膦酸鈉，磷酸唑來膦，伊班膦酸鈉等、以及降鈣素等。促進骨合成藥物主要有wnt信號調(diào)控劑(amg785,bhq880)、甲狀旁腺激素parathyroidhormone(pth)、鈣敏感受體拮抗劑(如：atf936)，和他汀類藥物。還有既抑制骨吸收又促成骨的制劑，如阿法骨化醇，骨化三醇(alfacalcidol,calcitriol,ro-26-9228,ed-71)等。然而，上述藥物雖然能在一定程度上阻止骨密度下降，但不能顯著降低非典型性骨折的風險，而且存在著不同程度的副作用，尚未能滿足抗骨質疏松治療的要求(siris,selbyetal.2009)。因此，目前迫切需要開發(fā)一種新的抗骨質疏松的特效藥，以解決當前臨床用藥無法滿足治療需求的問題。

破骨細胞是來源于骨髓巨噬細胞系的一種終末分化細胞，是目前所知唯一具有骨吸收作用的細胞。核受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactorkappabligand,rankl)是破骨細胞維持其結構、功能和存活所必需的一種跨膜的可溶性蛋白。rank與其配體結合，激活下游nf-κb、akt，絲裂原激活蛋白激酶(mapk)，激活t細胞核受體(nfat)，鈣離子通道，和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶信號通路，使得未分化的骨髓巨噬細胞向破骨細胞分化，進而引起骨質疏松(boyle,simonetetal.2003)。大量的研究證實，干擾rankl信號通路可抑制破骨細胞分化，產(chǎn)生抗骨質疏松的藥理作用(kimandkim2016)。近年來，通過干擾rankl信號通路研發(fā)新型抗骨質疏松藥物成為熱點。尋找具有抑制由rankl誘導產(chǎn)生的破骨細胞抑制活性的藥物，將有望解決當前骨質疏松治療藥物存在的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于新靶標rankl信號通路發(fā)現(xiàn)新的抗骨質疏松藥物，以克服現(xiàn)有骨質疏松治療藥物不能降低非典型性骨折的風險的問題，提供一類噻唑酰胺衍生物在制備抗骨質疏松藥物中的應用。

本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明的設計思路是根據(jù)三維結構相似度篩選的方法，以已知具有抗骨質疏松或破骨細胞分化抑制劑為模板，對本實驗室現(xiàn)有化合物進行篩選，獲得一系列化合物可能具有抗骨質疏松作用的潛在活性化合物，然后在細胞水平對篩選獲得的化合物進行破骨細胞分化抑制實驗，發(fā)現(xiàn)其中一類抑制活性高、細胞毒性低的噻唑酰胺衍生物可以有效抑制破骨細胞分化。所以，此類噻唑酰胺衍生物可安全用于制備治療和/或預防骨質疏松藥物。

本發(fā)明所選取的化合物均為現(xiàn)有的化合物。計算機篩選指的是運用計算機輔助藥物設計相關軟件，采用相似度檢索等技術手段對現(xiàn)有的化合物庫進行篩選，篩選得到的化合物進行生物活性測試。

噻唑酰胺衍生物在制備抗骨質疏松藥物中的應用，所述苯噻唑酰胺衍生物的結構式如式(i)所示：

其中，r1為直鏈烷基或取代的直鏈烷基、環(huán)烷基、烯基或被取代的烯基、五元或六元雜環(huán)；r2為氫、烷基、不飽和烷基、苯基或取代苯基，r3為氫或烷基，n為0～4中任意一個整數(shù)。

優(yōu)選地，r1為c3～c10的環(huán)烷基、烯基或被取代的烯基、五元或六元雜環(huán)；r2為氫、c1～c6烷基、c1～c6不飽和烷基、苯基或取代苯基，r3為氫或c1～c6烷基。

術語“烷基”是用于表示飽和烷烴，c1～c6的烷基是指含有1～6個碳原子的飽和烴基?！安伙柡屯榛北硎臼怯糜诒硎咎?、氫兩種原子的官能團，可以看作是相應的烷基失去1～4氫原子(h)后剩下的自由基。

優(yōu)選地，r1為2-乙硫基苯甲酸甲酯、乙烯苯并二茂、c3～c10的環(huán)烷基或取代的c3～c10的環(huán)烷基、六元含氧或含氮的雜環(huán)基或取代的六元含氧或含氮的雜環(huán)基，r2為氫、c1～c6烷基、苯基、被甲氧基、羥基、羧基、酯基取代的苯基，r3為氫或c1～c6烷基。

優(yōu)選地，r1為2-乙硫基苯甲酸甲酯、乙烯苯并二茂、環(huán)己烷甲酸、甲基呋喃，r2為氫、c1～c6烷基、苯基、甲基苯基或甲氧基苯基，r3為氫或c1～c6烷基。

優(yōu)選地，所述噻唑酰胺衍生物的結構式為

最優(yōu)選地，所述噻唑酰胺衍生物的結構式為

本發(fā)明所述藥物包括藥學上可接受的鹽、載體和/或賦形劑。

更近一步地，本發(fā)明所述苯內(nèi)酰烯酯酰胺類衍生物是作為破骨細胞分化抑制劑在制備抗骨質疏松藥物中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的噻唑酰胺衍生物均能一定程度上抑制破骨細胞分化，其中化合物1a活性最高，治療指數(shù)最高?；衔?c毒性最低。本發(fā)明提供的噻唑酰胺衍生物結構簡單、易合成；而且此類化合物毒性小，可安全用于制備治療和/或預防骨質疏松或骨量減少的藥物。

附圖說明

圖1為1a細胞毒性和破骨細胞分化抑制曲線圖。

圖2為1b細胞毒性和破骨細胞分化抑制曲線圖。

圖3為1c細胞毒性和破骨細胞分化抑制曲線圖。

圖4為1d細胞毒性和破骨細胞分化抑制曲線圖。

圖5為1a～1d4個化合物的破骨細胞分化抑制曲線圖。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。

實施例1：計算機藥物篩選

化合物庫預處理：化合物庫為自備化合物數(shù)據(jù)庫?；衔飵熳魅缦绿幚恚喝コx子及絡合水分子、加電荷、質子化、產(chǎn)生三維構象。這些流程均在藥物設計軟件包discoverystudio2.5中完成。其中質子化在ph6.5～8.5條件下進行。準備好的小分子庫用于虛擬篩選。

以已知抗骨質疏松藥物和破骨細胞分化抑制劑進行三維相似度檢索，找出相似度高于80％的化合物。本發(fā)明通過計算機藥物篩選程序為本實驗室自主研發(fā)程序wega，預測出本實驗室化合物儲備庫擁有20個潛在活性的化合物。對該20個化合物進行細胞水平的抑制骨質疏松分化活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中4個化合物(1a～1d)具有抑制破骨細胞分化的作用。這4個化合物均屬噻唑酰胺衍生物。

實施例2：化合物細胞的毒性測定

s1.細胞培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)raw264.7細胞。使用含有10％胎牛血清，dmem高糖培養(yǎng)基，在37℃，5％二氧化碳濃度條件下進行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。

s2.化合物干預。

收集對數(shù)期細胞，將細胞懸液濃度配成1×10⁵個/ml，加入96孔細胞培養(yǎng)板中。于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成含有不同化合物濃度的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)2天，于第3天檢測細胞毒性。使用dmso將待測化合物配置為不同濃度的溶液。每個濃度設3個平行復孔，并設不經(jīng)化合物處理的對照組進行比較。

s3.測試方法。

采用mtt[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法測定經(jīng)化合物處理6天之后的細胞。應用酶標儀(檢測波長570nm，參考波長630nm)測定個孔吸光值(od值)。

s4.結果處理。

按下面的公式計算各個藥物對raw264.7細胞的生長抑制率：

以raw264.7細胞生長抑制率為縱坐標，化合物濃度得log值為橫坐標繪制各化合物對細胞生長的抑制曲線圖，根據(jù)各化合物對細胞抑制率，求出半數(shù)毒性濃度cc50，即抑制細胞生長達50％時藥物濃度。

另按照公式：選擇抑制常數(shù)(si)＝cc50/ic50計算各化合物的選擇抑制常數(shù)，以評價各化合物的用藥安全性。1a、1b、1c和1d四個化合物的選擇抑制常數(shù)結果見表1。1a、1b、1c和1d四個化合物對raw264.7細胞的毒性測定結果分別見圖1～圖4。

實施例3：破骨細胞分化抑制實驗

s1.細胞培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)raw264.7細胞。使用含有10％胎牛血清，dmem高糖培養(yǎng)基，在37℃，5％二氧化碳濃度條件下進行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。

s2.化合物干預。

收集對數(shù)期細胞，將細胞懸液濃度配成2×10⁴個/ml，加入96孔細胞培養(yǎng)板中。于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成含有100ng/mlrankl及不同化合物濃度的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)5天，每2天換上相同rankl濃度和化合物濃度的培養(yǎng)基，于第5天檢測采用trap染色法對破骨細胞進行染色。每個濃度設3個平行復孔，并設不經(jīng)化合物處理的對照組進行比較。

s3.測試方法。

采用trap試劑盒對分化形成的破骨細胞進行染色，計數(shù)≧3個細胞核融合的破骨細胞數(shù)目。

s4.結果處理。

按下面的公式計算各藥物對rankl誘導的破骨細胞分化抑制率：

以破骨細胞分化抑制率為縱坐標，化合物濃度的log值為橫坐標繪制各化合物對破骨細胞分化抑制曲線圖，根據(jù)各化合物對破骨細胞分化的抑制率，求出半數(shù)有效率ic50，即抑制破骨細胞分化達50％時藥物濃度。

另按照公式：選擇抑制常數(shù)(si)＝cc50/ic50計算各化合物的選擇抑制常數(shù)，以評價各化合物的用藥安全性。1a、1b、1c和1d四個化合物的選擇抑制常數(shù)結果見表1。1a、1b、1c和1d四個化合物對宿主細胞的毒性測定結果分別見圖1～圖4。

根據(jù)選擇性指數(shù)si＝cc50/ic50值，按以下標準評價化合物的抗骨質疏松分化的效果。si<1.0表明化合物有毒無效，1.0≤si≤2.0表明化合物低效有毒即弱陽性，2.0<si<10.0表明化合物有效低毒即陽性，si≥10.0表明化合物高效低毒即強陽性。

由表1和圖1～4的結果可見，本發(fā)明通過破骨細胞分化抑制實驗，發(fā)現(xiàn)4個化合物對破骨細胞分化均有不同程度的抑制作用，其中1a活性最好，治療指數(shù)最高，ic50為3.98，si為42.59(見圖1、表1)；其次為1b，ic50為4.03，si為34.96(見圖2、表1)；活性次之的是1d，ic50為8.12，si為18.57(見圖4、表1)；與其它三個化合物相比，1c活性較差，ic50為12.99，si為28.93(見圖3、表1)。其中，圖5為綜合化合物1a、1b、1c和1d共4個化合物的破骨細胞分化抑制曲線圖。

表1藥物篩選獲得的化合物結構及其對破骨細胞分化的抑制作用

本發(fā)明通過計算機輔助藥物設計相似度檢索的方法發(fā)現(xiàn)一類噻唑酰胺衍生物。并通過破骨細胞分化抑制實驗和細胞毒性(mtt)實驗，發(fā)現(xiàn)此類化合物中，1a、1b、1d對破骨細胞分化抑制活性均小于10μm，細胞毒性小，治療指數(shù)高。1a對破骨細胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為3.98μm，細胞半致死劑量(cc50)為168.50μm，選擇抑制常數(shù)(si)為42.59(表1，圖1)；1b對破骨細胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為4.03μm，細胞半致死劑量(cc50)為140.90μm，選擇抑制常數(shù)(si)為43.95(表1，圖2)；1c對破骨細胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為12.99μm，細胞半致死劑量(cc50)為375.8μm，選擇抑制常數(shù)(si)為28.93(表1，圖3)；1d1c對破骨細胞分化半數(shù)抑制劑量(ic50)為8.12μm，選擇抑制常數(shù)(si)為18.57(表1，圖4)。結果表明，此類化合物對破骨細胞分化的抑制活性高、細胞毒性小，可作為一類破骨細胞抑制劑用于制備骨質疏松或骨質減少防治藥物。