本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及白介素17在抵御流感病毒侵染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：白介素種類很多且功能各異，但最近研究發(fā)現(xiàn)的一類新型白介素卻對炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展起著不可忽視的作用，這一類白介素被人們命名為白介素-17，白介素-17的發(fā)現(xiàn)為以前一些有爭議的炎癥現(xiàn)象提供了合理的解釋，同時(shí)也使得人們對于炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)更加細(xì)致深入?？茖W(xué)家從小鼠的T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)了白介素-17A，通過生物信息學(xué)手段，很快發(fā)現(xiàn)在基因組中還含有其他五個(gè)和白介素-17A同源的基因，由此，人們將這六個(gè)同源的細(xì)胞因子歸入一個(gè)新的白介素家族：白介素-17家族。該家族的細(xì)胞因子被分別命名為白介素-17A到白介素-17F。同時(shí)，人們還找到了它們的受體家族：白介素-17受體A到白介素-17受體E。這些白介素-17細(xì)胞因子可以結(jié)合到相對應(yīng)的受體成員上從而介導(dǎo)不同的炎癥反應(yīng)。白介素-17A一方面會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子以及趨化因子的表達(dá)，從而招募更多的免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位加劇機(jī)體的炎癥反應(yīng)，另一方面，白介素-17A還會(huì)誘導(dǎo)一些組織修復(fù)相關(guān)因子的表達(dá)從而加速機(jī)體的恢復(fù)。雖然白介素-17A在宿主抗感染和組織修復(fù)過程中起到擴(kuò)大免疫防御反應(yīng)保護(hù)自身機(jī)體的作用，但是，在很多自身免疫病病人和腫瘤病人當(dāng)中，白介素-17A又是高表達(dá)的，由于它可以誘導(dǎo)很多炎癥因子的表達(dá)，過高的白介素-17A水平對于疾病的病理發(fā)展起到惡化作用。很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明，白介素-17A缺失或者抗體中和白介素-17A，可以有效的抑制多種自身免疫病病理程度。針對白介素-17A的治療性抗體目前正處于研發(fā)之中。除了白介素-17A以外，該家族的另一個(gè)成白介素-17E又具有異于白介素-17A的功能。在機(jī)體遭受過敏原刺激時(shí)，白介素-17E會(huì)被炎癥部位的多種細(xì)胞分泌出來擴(kuò)大機(jī)體的體液免疫反應(yīng)。很多臨床病人樣本和動(dòng)物模型試驗(yàn)證明，白介素-17E對人體抵抗寄生蟲感染非常重要，與此同時(shí)，它對于機(jī)體的過敏反應(yīng)卻起到促進(jìn)作用，這樣白介素-17E就加劇了哮喘等呼吸道疾病的發(fā)病程度。最近，科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)，在人體遭遇腸道或皮膚炎癥時(shí)，腸道上皮細(xì)胞和皮膚角質(zhì)層細(xì)胞會(huì)分泌白介素-17C，白介素-17C又會(huì)作用于它的分泌細(xì)胞使之快速的對外來刺激做出早期反應(yīng)。這樣，這種由白介素-17C介導(dǎo)的早期炎癥反應(yīng)加之隨后白介素-17A介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞侵潤，共同構(gòu)成了宿主的粘膜免疫防線，為機(jī)體清除病原微生物維持自身穩(wěn)態(tài)提供了重要屏障。同樣，白介素-17C的持續(xù)存在也會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生。白介素-17家族的細(xì)胞因子就如同一把雙刃劍，在急性炎癥反應(yīng)中，它們可以快速的分泌出來保護(hù)機(jī)體不受外源有害物質(zhì)的危害，而當(dāng)人體產(chǎn)生由于多種遺傳和環(huán)境因素所導(dǎo)致的慢性炎癥時(shí)，它們又會(huì)加速多種慢性疾病的病程。所以，白介素-17家族細(xì)胞因子和人類的健康息息相關(guān)，科學(xué)家所要做的就是研究清楚它們對于不同炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，這會(huì)為防治許多炎癥相關(guān)重大疾病提供寶貴的參考依據(jù)和治療策略。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供IL-17蛋白的新用途。本發(fā)明提供IL-17蛋白在制備抑制流感病毒侵染細(xì)胞產(chǎn)品中的應(yīng)用；或本發(fā)明提供IL-17蛋白在制備抗流感病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；或本發(fā)明提供IL-17蛋白在制備抑制流感病毒在細(xì)胞中生長產(chǎn)品中的應(yīng)用?；虮景l(fā)明提供IL-17蛋白在提高感染流感病毒的細(xì)胞中IL-13、IL-15和IL-17F的表達(dá)量中的應(yīng)用；或本發(fā)明提供IL-17蛋白在制備提高感染流感病毒的細(xì)胞中IL-13、IL-15和IL-17F的表達(dá)量產(chǎn)品中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述IL-17蛋白為IL-17A蛋白。IL-17A前體氨基酸序列為序列1，成熟肽的氨基酸序列為序列2。在本發(fā)明的實(shí)施例中用的IL17A成熟肽(R&D貨號(hào)：BA12416)。上述應(yīng)用中，所述流感病毒為A/PR8；或，所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞；或，所述腫瘤細(xì)胞為腺癌細(xì)胞；或，所述腺癌細(xì)胞為A549細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括IL-17蛋白；所述產(chǎn)品具有如下1)-4)中至少一種功能：1)抑制流感病毒侵染細(xì)胞；2)抗流感病毒；3)抑制流感病毒在細(xì)胞中生長；4)提高感染流感病毒的細(xì)胞中IL-13、IL-15和IL-17F的表達(dá)量。上述產(chǎn)品中，所述IL-17蛋白為IL-17A蛋白。上述產(chǎn)品中，所述流感病毒為A/PR8；或，所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞；或，所述腫瘤細(xì)胞為腺癌細(xì)胞；或，所述腺癌細(xì)胞為A549細(xì)胞。上述中，所述產(chǎn)品為試劑盒。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)白介素17A可以抵擋流感病毒侵染細(xì)胞，為流感病毒的防治等具有重大價(jià)值。附圖說明圖1為在293T細(xì)胞中的差異基因的GO富集分析；1.免疫細(xì)胞間的相關(guān)因子2.無顆粒白細(xì)胞粘附和滲出3.IL17A和IL17F上皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子4.喘氣氣管炎性因子5.IL17A和IL17FT細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。圖2為實(shí)施例2中白介素-17的孵育鑒定結(jié)果。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、白介素17與流感病毒關(guān)系的發(fā)現(xiàn)一、細(xì)胞培養(yǎng)及傳代293T、A549細(xì)胞用含10％FBS、1‰雙抗的DMEM培養(yǎng)于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中。1、細(xì)胞培養(yǎng)至95％以上匯合度時(shí)，準(zhǔn)備進(jìn)行傳代；2、棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞表面培養(yǎng)基殘夜及少量死細(xì)胞；3、加入適量胰酶，按細(xì)胞貼壁能力不同消化相應(yīng)時(shí)間。光學(xué)顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓后，棄去胰酶；4、加入新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞輕輕吹打成細(xì)胞懸液，吸取適量細(xì)胞懸液至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，補(bǔ)添新鮮培養(yǎng)基至8-10mL總體積，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)；5、次日給細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至95％以上匯合度進(jìn)行下次傳代。二、病毒感染1、將上述一培養(yǎng)的293T、A549細(xì)胞至90％匯合度時(shí)，準(zhǔn)備進(jìn)行感染；2、配置病毒感染液：DMEM，2μg/μlTPCK處理的胰酶，按照特定MOI加入流感病毒毒株A/PR8(記載該毒株的已發(fā)表的文獻(xiàn):Li,J.,Zheng,W.,Hou,L.,Chen,C.,Fan,W.,Qu,H.,Jiang,J.,Liu,J.,Gao,G.F.,Zhou,J.,Sun,L.,andLiu,W.(2016),Differentialnucleocytoplasmicshuttlingofthenucleoproteinofinfluenzaavirusesandassociationwithhosttropism,CellularMicrobiology,doi:10.1111/cmi.12692)液；3、棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞表面殘夜；4、加入配置的病毒感染液，細(xì)胞于37℃5％CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)1h；5、棄去病毒感染液后，再用PBS清洗細(xì)胞表面1次，加入未加病毒的感染液繼續(xù)培養(yǎng)。6、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，收集病毒培養(yǎng)上清檢測病毒，或者收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白檢測，或者加入Trizol進(jìn)行RNA提取。三、Real-timePCR1、293T、A549細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中(1x106個(gè)/孔)，待細(xì)胞長至90％以上匯合度時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞表面殘夜；2、配置A/PR8病毒感染液(是上述二得到的病毒)，加入6孔板中(MOI＝1)，感染1h后，PBS清洗細(xì)胞1次，未感染組為感染0h的樣品；3、感染后4、8、12h棄去感染液，加PBS洗1遍；4、每孔加入1mLTRIZOL，溶解細(xì)胞后收集到RNase-free的1.5mLEp管中；5、加入200μl氯仿，用手輕輕震蕩混勻后室溫靜置2min；6、4℃12000rpm離心15min，小心吸取上層水相400μl與一新的1.5mLEp管中；7、加入同等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻后室溫靜置5min；8、4℃12000rpm離心15min，棄上清；9、取1mLDEPC水配置的75％乙醇加入Ep管，輕輕地吹彈起白色RNA沉淀，輕輕吹洗幾次；10、4℃8000rpm離心5min，棄上清；11、重復(fù)步驟9，再清洗沉淀1次；12、其上清后，室溫晾干至白色消失即可；13、加入50μlDEPC水，室溫靜置5min，充分溶解RNA；14、瓊脂糖核酸電泳鑒定提取的RNA質(zhì)量；15、NanoDrop測定提取的RNA濃度、260/280及260/230；16、取2μgRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，50μl總體積反轉(zhuǎn)錄體系為：加入DEPCH2O補(bǔ)齊至50μl。17、反轉(zhuǎn)錄出cDNA后，進(jìn)行real-timePCR，20μl總體積反應(yīng)體系為：(上游：5’-GCAGGCACAAACTCATCCAT-3’下游：5’-CAGGCTCAGCAGCAGTAGCA-3’)18、反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30s；[95℃5s，60℃30s]×40個(gè)循環(huán)；在60℃收集熒光。19、收集數(shù)據(jù)，根據(jù)2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。四、RNA-Seq樣本制備1、293T、A549細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞長至90％匯合度時(shí)進(jìn)行感染；2、用含2μg/mLTPCK處理胰酶的DMEM感染液稀釋A/PR8(是上述二得到的病毒)，以MOI＝1的感染劑量分別感染293T、A549；3、感染8h后，棄去感染液，用PBS清洗細(xì)胞表面1次，每孔加入1mLTRIZOL，靜置半分鐘，輕輕吹打細(xì)胞至細(xì)胞完全溶解，收集TRIZOL細(xì)胞裂解液至1.5mL的RNase-freeEp管中；4、每管加入200μl氯仿，輕輕振蕩混勻后，4℃12000rpm離心15min；5、取上清水相400μl至新的RNase-freeEp管中，再加入400μl異丙醇，顛倒混勻，靜置5min后，4℃12000rpm離心15min，RNA沉淀離于管底；6、小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失；7、每管加入900μl70％乙醇(DEPC水配置)，用移液器輕輕吹起RNA沉淀，充分洗滌沉淀表面，4℃12000rpm離心15min；8、可重復(fù)步驟7；9、盡可能吸棄上清，防止RNA沉淀丟失，室溫靜置干燥，直至乙醇完全揮發(fā)，白色消失；10、加入50μlDEPC水將RNA溶解；11、取出1μlRNA進(jìn)行瓊脂糖核酸電泳觀察RNA條帶，并觀察有無基因組DNA污染；12、取出1.5μlRNA于微量核酸濃度測定儀測定濃度及觀察260/280、260/230比值。13、DNase處理剩余RNA并純化后，-80℃低溫保存或進(jìn)行RNA-Seq測定。RNA-Seq測定結(jié)果顯示，利用cDNA微矩陣技術(shù)檢測A/PR8毒株感染A549細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)了456個(gè)上調(diào)基因和346個(gè)下調(diào)基因，其中大部分基因參與天然免疫、炎癥反應(yīng)和胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程。利用高通量測序方法(RNA-Seq)對A型流感病毒感染A549和293T細(xì)胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化進(jìn)行檢測，以未感染細(xì)胞作為陰性對照，與人cDNA文庫進(jìn)行比對后。對兩種細(xì)胞系中檢測到的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)差異基因富集的分類條目而為下一步的功能分析做基礎(chǔ)。如圖1所示，在A549細(xì)胞中上調(diào)基因和下調(diào)基因分別進(jìn)行GO富集分析后，選取p-value值最小前10個(gè)分類條目。p-value值越小，即-log10(p-value)越大，表示基因在此GO分析條目中越富集。從圖中來看，在A549細(xì)胞中，上調(diào)基因主要參與炎性因子及炎性因子調(diào)節(jié)因子的過程。GO富集分析表明，在流感病毒感染的293T細(xì)胞中，IL-17A在腸上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的差異調(diào)節(jié)也富集在前5個(gè)Pathway通路中，表明了IL-17A在調(diào)節(jié)A549細(xì)胞中的病毒繁殖或炎癥反應(yīng)的潛在作用。實(shí)施例2、白介素-17在抑制流感病毒生長中的應(yīng)用IL-17A前體氨基酸序列為序列1，成熟肽的氨基酸序列為序列2。1、IL17A孵育A549細(xì)胞將A549細(xì)胞分如下兩組培養(yǎng)細(xì)胞：待感染A549細(xì)胞：A549細(xì)胞(記載于“S-SWang,Zh-DZhao,Y-HBi,LSun,X-LLiu*,W-JLiu*.2013.Tyrosine132phosphorylationofinfluenzaAvirusM1proteiniscrucialforvirusreplicationbycontrollingitsnuclearimport.JournalofVirology,87(11):6182-91”一文中，公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得。)在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，至90％匯合度；待感染不同濃度IL17A孵育A549細(xì)胞：將A549細(xì)胞在含有IL17A的細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，至90％匯合度。含有不同濃度的IL17A的細(xì)胞培養(yǎng)基為將IL17A(R&D貨號(hào)：BA12416，是成熟肽)與DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，得到培養(yǎng)基，且IL17A在含有IL17A的細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度分別為10ng/mL，20ng/mL和50ng/mL。2、病毒感染第一組-待感染A549細(xì)胞病毒感染組：將100ul流感病毒毒株A/PR8(記載該毒株的已發(fā)表的文獻(xiàn):Li,J.,Zheng,W.,Hou,L.,Chen,C.,Fan,W.,Qu,H.,Jiang,J.,Liu,J.,Gao,G.F.,Zhou,J.,Sun,L.,andLiu,W.(2016),Differentialnucleocytoplasmicshuttlingofthenucleoproteinofinfluenzaavirusesandassociationwithhosttropism,CellularMicrobiology,doi:10.1111/cmi.12692)、2μg/μlTPCK處理25％胰酶(Gibco，貨號(hào)25200-056)、2mlDMEM(Gibco，貨號(hào)31600034)待感染A549細(xì)胞病毒混勻，其中，MOI值為0.1；于37℃5％CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)，收集上清液。第三組-待感染不同濃度IL17A孵育A549細(xì)胞組：將100ul流感病毒毒株A/PR8、2μg/μlTPCK處理25％胰酶(Gibco胰酶，貨號(hào)25200-056)、2mlDMEM(Gibco，貨號(hào)31600034)待感染不同濃度IL17A孵育A549細(xì)胞混勻，其中，MOI值為0.1；于37℃5％CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)，收集上清液。第二組-待感染A549細(xì)胞未感染組：將2μg/μlTPCK處理25％胰酶(Gibco胰酶，貨號(hào)25200-056)、2mlDMEM(Gibco，貨號(hào)31600034)待感染A549細(xì)胞混勻；于37℃5％CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)，收集上清液。第四組-待感染不同濃度IL17A孵育A549細(xì)胞未感染組：將2μg/μlTPCK處理25％胰酶(Gibco胰酶，貨號(hào)25200-056)、2mlDMEM(Gibco，貨號(hào)31600034)待感染不同濃度IL17A孵育A549細(xì)胞混勻；于37℃5％CO2培養(yǎng)箱放置培養(yǎng)，收集上清液。上述實(shí)驗(yàn)分組如表1所示。表1A549細(xì)胞IL17A孵育A549細(xì)胞病毒感染第一組第三組病毒未感染第二組第四組3、病毒滴度檢測取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)：分別在培養(yǎng)第0h、8h、12h、16h、24h、48h、72h取細(xì)胞上清液。將第一組和第三組培養(yǎng)8h、12h、16h、24h、36h、48h、72h取細(xì)胞上清液進(jìn)行TCID50檢測(檢測方法是常規(guī)公知)。結(jié)果如圖2(橫坐標(biāo)為病毒感染時(shí)間，縱坐標(biāo)為病毒滴度)所示，可以看出，根據(jù)IL-17A蛋白孵育劑量的不同，在感染后48和72小時(shí)，病毒滴度顯著降低，表明，IL-17A蛋白抑制病毒的生長。4、相關(guān)基因表達(dá)量檢測收集上述2培養(yǎng)第三組和第四組8h和12h樣品的沉淀，提取RNA作為模板，用下面的引物對進(jìn)行不同基因的real-timePCR檢測。檢測real-timePCR的基因和引物如下表2：表2結(jié)果顯示，與第四組病毒未感染組相比，不同濃度IL17A孵育A549細(xì)胞在感染病毒后，IL-13表達(dá)量顯著下調(diào)；當(dāng)IL-17A濃度從20ng/mL增加至50ng/mL時(shí)，IL-15表達(dá)增加；而IL-17F表達(dá)在用較低IL-17A濃度(20ng/mL)感染后幾乎所有時(shí)間點(diǎn)都增加。因此，IL17A可提高感染流感病毒的細(xì)胞中IL-13、IL-15和IL-17F的表達(dá)量。<110>中國科學(xué)院微生物研究所南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>白介素17在抵御流感病毒侵染中的應(yīng)用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>155<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>1MetThrProGlyLysThrSerLeuValSerLeuLeuLeuLeuLeuSer151015LeuGluAlaIleValLysAlaGlyIleThrIleProArgAsnProGly202530CysProAsnSerGluAspLysAsnPheProArgThrValMetValAsn354045LeuAsnIleHisAsnArgAsnThrAsnThrAsnProLysArgSerSer505560AspTyrTyrAsnArgSerThrSerProTrpAsnLeuHisArgAsnGlu65707580AspProGluArgTyrProSerValIleTrpGluAlaLysCysArgHis859095LeuGlyCysIleAsnAlaAspGlyAsnValAspTyrHisMetAsnSer100105110ValProIleGlnGlnGluIleLeuValLeuArgArgGluProProHis115120125CysProAsnSerPheArgLeuGluLysIleLeuValSerValGlyCys130135140ThrCysValThrProIleValHisHisValAla145150155<210>2<211>132<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2GlyIleThrIleProArgAsnProGlyCysProAsnSerGluAspLys151015AsnPheProArgThrValMetValAsnLeuAsnIleHisAsnArgAsn202530ThrAsnThrAsnProLysArgSerSerAspTyrTyrAsnArgSerThr354045SerProTrpAsnLeuHisArgAsnGluAspProGluArgTyrProSer505560ValIleTrpGluAlaLysCysArgHisLeuGlyCysIleAsnAlaAsp65707580GlyAsnValAspTyrHisMetAsnSerValProIleGlnGlnGluIle859095LeuValLeuArgArgGluProProHisCysProAsnSerPheArgLeu100105110GluLysIleLeuValSerValGlyCysThrCysValThrProIleVal115120125HisHisValAla130當(dāng)前第1頁1 2 3