本發(fā)明涉及用于治療il-6相關(guān)疾病的藥物組合物或給藥方案。

背景技術(shù)：

白介素-6(il-6)是一種細胞因子，其也被稱為b細胞刺激因子2(bsf2)或干擾素β2。il-6被發(fā)現(xiàn)是參與b淋巴樣細胞激活的分化因子(非專利文獻1)，并且后來發(fā)現(xiàn)其是影響多種細胞的功能的多功能性細胞因子(非專利文獻2)。據(jù)報道，il-6引起t淋巴樣細胞的成熟(非專利文獻3)。

il-6經(jīng)由細胞上的兩類蛋白傳遞其生物學活性。其中之一是il-6受體，所述受體是與il-6結(jié)合的分子量約為80kd的配體結(jié)合蛋白(非專利文獻4和5)。除了在細胞膜上表達的膜結(jié)合形式以外，il-6受體作為可溶性il-6受體存在，其主要由其胞外區(qū)構(gòu)成，并且穿透通過細胞膜。

另一個是膜蛋白gp130，其具有約130kda的分子量并且參與非配體結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導。il-6和il-6受體形成il-6/il-6受體復合物，之后所述復合物與gp130結(jié)合，從而使il-6的生物學活性被傳遞到細胞中(非專利文獻6)。

il-6抑制劑是抑制il-6生物學活性傳遞的物質(zhì)。目前，針對il-6的抗體(抗-il-6抗體)，針對il-6受體的抗體(抗-il-6受體抗體)，針對gp130的抗體(抗-gp130抗體)，il-6變體，il-6或il-6受體的部分肽等是已知的。

有若干關(guān)于抗-il-6受體抗體的報道(非專利文獻7和8，和專利文獻1-3)。其中之一是通過將小鼠抗體pm-1的互補決定區(qū)(cdr)(非專利文獻9)移植到人抗體(專利文獻1)中獲得的人源化pm-1抗體。

托珠單抗，作為一種抗-il-6受體抗體，目前被用于治療炎性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎和卡斯爾曼病(castleman’sdisease)(非專利文獻10)，并且其也已經(jīng)被確認為對疾病如視神經(jīng)脊髓炎(nmo)有效(非專利文獻11)。

也已經(jīng)報道了il-6抗體對重癥肌無力的療效(非專利文獻12)。

人源化抗體如托珠單抗是第一代抗體藥物。目前正通過改進第一代抗體藥物的藥效、方便性和成本來開發(fā)第二代抗體藥物(專利文獻2)。作為第二代抗體藥物，sa237(一種新的抗-il-6受體抗體)已經(jīng)通過應用改進技術(shù)如用于增強效應器功能，抗原-結(jié)合能力，藥物動力學和穩(wěn)定性的那些，或用于減小免疫學風險的那些來制備，并且已經(jīng)進入臨床試驗。

雖然目前正在進行多種抗體治療，但由于抗-抗體的發(fā)展所致的療效的衰減已在阿侖珠單抗(alemtuzumab)中被確認。為了防止該衰減，據(jù)報道，有效的是施用可以高劑量施用的非細胞結(jié)合突變體，而非通過施用高劑量的阿侖珠單抗而引起免疫耐受(非專利文獻13)。

與本申請發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)文獻顯示如下。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

[非專利文獻]

[非專利文獻1]hirano,t等,nature(1986)324,73-76

[非專利文獻2]akira,s等,adv.inimmunology(1993)54,1-78

[非專利文獻3]lotz,m等,j.exp.med.(1988)167,1253-1258

[非專利文獻4]taga,t等,j.exp.med.(1987)166,967-981

[非專利文獻5]yamasaki,k等,science(1988)241,825-828

[非專利文獻6]taga,t等,cell(1989)58,573-581

[非專利文獻7]novick,d等,hybridoma(1991)10,137-146

[非專利文獻8]huang,y.w等,hybridoma(1993)12,621-630

[非專利文獻9]hirata,y等,j.immunol.(1989)143,2900-2906

[非專利文獻10]nishimoto,n等,blood.2005oct15；106(8):2627-32

[非專利文獻11]araki等,mod.rheumatol.(2013)23(4),827-831

[非專利文獻12]aricha,r等,j.autoimmun.(2011)36(2),135-141

[非專利文獻13]charlottel等,naturereviewsrheumatology(2010)6,558-559

[專利文獻]

[專利文獻1]國際專利申請公布號wo92-19759

[專利文獻2]國際專利申請公布號wo2010/035769

發(fā)明概述

[本發(fā)明要解決的問題]

即使是在通過應用降低免疫原性的技術(shù)而制備的sa237(具有seqidno:3的重鏈序列和seqidno:4的輕鏈序列的抗體)的情況下，在向健康成年男性受試者皮下施用單劑量的120mg的sa237的i期研究(sa-001jp)中，在54.2％的情況中(72個例子中的39個)產(chǎn)生抗-sa237抗體并且出現(xiàn)免疫原性問題。本發(fā)明的一個目的是抑制抗-抗體產(chǎn)生并且提供更有效的用于治療il-6相關(guān)疾病的藥物組合物或給藥方案。

[解決問題的方式]

為了解決上述問題，本發(fā)明人聚焦于免疫耐受，并且發(fā)現(xiàn)通過以預定的施用方法和劑量施給藥物組合物可以抑制抗-抗體產(chǎn)生。

更具體地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以通過使用以預定的劑量和施用方法施用的藥物組合物可以抑制抗-抗體產(chǎn)生從而治療il-6相關(guān)疾病，并且由此完成了本發(fā)明。

具體地，本發(fā)明包括以下各項：

[1]用于治療il-6相關(guān)疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含il-6抑制劑作為活性成分，其中在短間隔給藥期后常規(guī)施用所述藥物組合物，在所述短間隔給藥期中以比常規(guī)給藥間隔更短的間隔多次施用與常規(guī)劑量相同的劑量。

[2][1]的藥物組合物，其中所述常規(guī)給藥間隔為三至五周。

[3][1]的藥物組合物，其中所述常規(guī)給藥間隔為四周。

[4][1]至[3]中任一項的藥物組合物，其中以比常規(guī)給藥間隔更短的間隔多次施用所述劑量的所述短間隔給藥期期間的給藥間隔為一至兩周。

[5][1]至[3]中任一項的藥物組合物，其中以比常規(guī)給藥間隔更短的間隔多次施用所述劑量的所述短間隔給藥期期間的給藥間隔為兩周。

[6][1]至[5]中任一項的藥物組合物，其中所述短間隔給藥期為自初始施用起四周。

[7][1]至[6]中任一項的藥物組合物，其中所述常規(guī)劑量為50mg至800mg/施用。

[8][1]至[7]中任一項的藥物組合物，其中所述常規(guī)劑量為120mg/施用。

[9][1]至[8]中任一項的藥物組合物，其中所述il-6抑制劑是il-6受體抗體。

[10][9]的藥物組合物，其中所述il-6受體抗體是嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體。

[11][9]的藥物組合物，其中所述il-6受體抗體包含具有seqidno:1的序列的重鏈可變區(qū)和具有seqidno:2的序列的輕鏈可變區(qū)。

[12][9]的藥物組合物，其中所述il-6受體抗體包含具有seqidno:3的序列的重鏈和具有seqidno:4的序列的輕鏈。

[13][9]的藥物組合物，其中所述il-6受體抗體是sa237。

[14][1]至[13]中任一項的藥物組合物，其中所述il-6相關(guān)疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、全身發(fā)作性青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、卡斯爾曼病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)、狼瘡腎炎、克羅恩氏病、淋巴瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、貧血、血管炎、川崎病、斯蒂爾病、淀粉樣變性、多發(fā)性硬化、移植、年齡相關(guān)性黃斑變性、強直性脊柱炎、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病(copd)、iga腎病、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、糖尿病腎病、gvhd、子宮內(nèi)膜異位癥、肝炎(nash)、心肌梗死、動脈硬化、膿毒癥、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、腎癌、b-細胞非霍奇金、胰腺癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸癌、癌惡病質(zhì)、癌神經(jīng)侵入、心肌梗死、近視性脈絡(luò)膜新血管生成、特發(fā)性脈絡(luò)膜新血管生成、葡萄膜炎、慢性甲狀腺炎、遲發(fā)型超敏反應、接觸性皮炎、特應性皮炎、間皮瘤、多肌炎、皮肌炎、全葡萄膜炎、前葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、鞏膜炎、角膜炎、眼窩炎癥、視神經(jīng)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、干眼癥、術(shù)后炎癥、視神經(jīng)脊髓炎、重癥肌無力或肺高血壓。

[15][1]至[14]中任一項的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于皮下施用的制劑。

[16]用于治療il-6相關(guān)疾病的方法，所述方法包括施用il-6抑制劑，其中在短間隔給藥期后常規(guī)施用所述il-6抑制劑，在所述短間隔給藥期中以比常規(guī)給藥間隔更短的間隔多次施用與常規(guī)劑量相同的劑量。

[17]il-6抑制劑，其用于治療il-6相關(guān)疾病，其中在短間隔給藥期后常規(guī)施用所述il-6抑制劑，在所述短間隔給藥期中以比常規(guī)給藥間隔更短的間隔多次施用與常規(guī)劑量相同的劑量。

[18]il-6抑制劑用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療il-6相關(guān)疾病，其中在短間隔給藥期后常規(guī)施用所述il-6抑制劑，在所述短間隔給藥期中以比常規(guī)給藥間隔更短的間隔多次施用與常規(guī)劑量相同的劑量。

發(fā)明效果

本發(fā)明的藥物組合物或方案可以解決抗-藥物抗體產(chǎn)生的免疫原性問題，并且以使患者負擔較小的方式提供藥物組合物，因為其不使患者暴露于高劑量。

附圖簡述

圖1指示血清sa237濃度的平均值(和標準差)的變化。圖1a顯示主要評估期期間sa237濃度的變化，圖1b顯示延長期期間sa237濃度的變化，圖1c顯示至第8周的血清sa237濃度的變化。

圖2指示作為sa237的藥效學標志物的血清sil-6r濃度的平均值(和標準差)的變化。圖2a顯示主要評估期期間sil-6r濃度的變化，圖2b顯示延長期期間血清sil-6r濃度的變化。

圖3指示作為sa237的藥效學標志物的血清crp濃度的平均值(和標準差)的變化。圖3a顯示主要評估期期間的crp濃度的變化，圖3b顯示延長期期間crp濃度的變化。

具體實施方式

下文中，將詳細描述本發(fā)明。

本發(fā)明涉及用于治療il-6相關(guān)疾病的藥物組合物或給藥方案。

本發(fā)明的“il-6抑制劑”是這樣的物質(zhì)，其阻斷通過il-6的信號轉(zhuǎn)導，并且抑制il-6的生物學活性。il-6抑制劑優(yōu)選是針對與il-6，il-6受體和gp130中任一的結(jié)合具有抑制作用的物質(zhì)。

本發(fā)明的il-6抑制劑的實例包括，但不特別限于，抗-il-6抗體，抗-il-6受體抗體，抗-gp130抗體，il-6變體，可溶性il-6受體變體，或il-6或il-6受體的部分肽，以及顯示類似活性的低分子量物質(zhì)。本發(fā)明的il-6抑制劑的實例可以優(yōu)選是識別il-6受體的抗體。

本發(fā)明抗體的來源不受特別限制，但是其優(yōu)選是哺乳動物并且更優(yōu)選是人。

本發(fā)明中使用的抗-il-6抗體可以使用已知方法作為多克隆或單克隆抗體獲得。來源于哺乳動物的單克隆抗體對于本發(fā)明中使用的抗-il-6抗體是尤其優(yōu)選的。來源于哺乳動物的單克隆抗體包括通過雜交瘤產(chǎn)生的那些和通過使用基因工程方法用含抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的那些。通過結(jié)合il-6，該抗體抑制il-6與il-6受體的結(jié)合，并且阻斷il-6生物學活性轉(zhuǎn)導到細胞中。

此種抗體的實例包括mh166抗體(matsuda,t.等,eur.j.immunol.(1988)18,951-956)和sk2抗體(sato,k.等,theabstractsofthe21stannualmeetingofthejapanesesocietyforimmunology(1991)21,166)。

基本上，產(chǎn)生抗-il-6抗體的雜交瘤可以使用已知方法如下制備。具體地，雜交瘤可以通過以下方式制備：通過常規(guī)免疫方法使用il-6作為敏化抗原進行免疫，通過常規(guī)細胞融合方法將所得的免疫細胞與已知的親本細胞融合，然后使用常規(guī)篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。

具體地，抗-il-6抗體可以制備如下。用作用于獲得抗體的敏化抗原的人il-6可以通過例如使用eur.j.biochem(1987)168,543-550；j.immunol.(1988)140,1534-1541；和agr.biol.chem.(1990)54,2685-2688中公開的il-6基因和/或氨基酸序列獲得。

在將合適的宿主細胞用插入有il-6基因序列的已知的表達載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后，使用已知方法從宿主細胞內(nèi)部或從培養(yǎng)物上清中純化靶il-6蛋白。此純化的il-6蛋白可用作敏化抗原。備選地，il-6蛋白和另一種蛋白的融合蛋白可以用作敏化抗原。

本發(fā)明中使用的抗-il-6受體抗體可以使用已知方法作為多克隆或單克隆抗體獲得。來源于哺乳動物的單克隆抗體對于本發(fā)明中使用的抗-il-6受體抗體是尤其優(yōu)選的。來源于哺乳動物的單克隆抗體包括通過雜交瘤產(chǎn)生的那些和通過使用基因工程方法用含抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的那些。通過結(jié)合il-6受體，該抗體抑制il-6與il-6受體的結(jié)合，并且阻斷il-6生物學活性轉(zhuǎn)導到細胞中。

此種抗體的實例包括mr16-1抗體(tamura,t.等proc.natl.acad.sci.usa(1993)90,11924-11928)，pm-1抗體(hirata,y.等,j.immunol.(1989)143,2900-2906)，auk12-20抗體，auk64-7抗體，和auk146-15抗體(國際專利申請公布號wo92-19759)。其中，列出pm-1抗體作為優(yōu)選的針對人il-6受體的單克隆抗體的實例，并且列出mr16-1抗體作為優(yōu)選的針對小鼠il-6受體的單克隆抗體的實例。

基本上，產(chǎn)生抗-il-6受體單克隆抗體的雜交瘤可以使用已知方法制備如下。具體地，雜交瘤可以通過以下方式制備：通過常規(guī)免疫方法使用il-6受體作為敏化抗原進行免疫，通過常規(guī)細胞融合方法將所得的免疫細胞與已知的親本細胞融合，然后使用常規(guī)篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。

具體地，抗-il-6受體抗體可以如下制備。用作用于獲得抗體的敏化抗原的人il-6受體或小鼠il-6受體可以通過例如使用分別在歐洲專利申請公布號ep325474和日本專利申請kokai公布號(jp-a)h03-155795(未審的已公布的日本專利申請)中公開的il-6受體基因和/或氨基酸序列獲得。

有兩種類型的il-6受體蛋白：一種表達在細胞膜上而另一種分離自細胞膜(可溶性il-6受體)(yasukawa,k.等,j.biochem.(1990)108,673-676)?？扇苄詉l-6受體基本上由與細胞膜結(jié)合的il-6受體的胞外區(qū)構(gòu)成，并且與膜結(jié)合的il-6受體的不同之處在于其缺少跨膜區(qū)或跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)兩者。任何il-6受體都可以用作il-6受體蛋白，只要其可以用作用于產(chǎn)生本發(fā)明中使用的抗-il-6受體抗體的敏化抗原即可。

在將合適的宿主細胞用插入有il-6受體基因序列的已知的表達載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后，使用已知方法從宿主細胞內(nèi)部或從培養(yǎng)物上清中純化靶il-6受體蛋白。此純化的il-6受體蛋白可用作敏化抗原。備選地，表達il-6受體的細胞或il-6受體蛋白與另一種蛋白的融合蛋白可以用作敏化抗原。

本發(fā)明中使用的抗-gp130抗體可以使用已知方法作為多克隆或單克隆抗體獲得。來源于哺乳動物的單克隆抗體對于本發(fā)明中使用的抗-gp130抗體是尤其優(yōu)選的。來源于哺乳動物的單克隆抗體包括通過雜交瘤產(chǎn)生的那些和通過使用基因工程方法用含抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的那些。通過結(jié)合gp130，該抗體抑制il-6/il-6-受體復合物與gp130的結(jié)合，并且阻斷il-6生物學活性向細胞中的轉(zhuǎn)導。

此種抗體的實例包括am64抗體(jp-a(kokai)h03-219894)，4b11和2h4抗體(us5571513)，以及b-s12和b-p8抗體(jp-a(kokai)h08-291199)。

基本上，產(chǎn)生抗-gp130單克隆抗體的雜交瘤可以使用已知技術(shù)如下制備。具體地，雜交瘤可以通過以下方式制備：通過常規(guī)免疫方法使用gp130作為敏化抗原進行免疫，通過常規(guī)細胞融合方法將所得的免疫細胞與已知的親本細胞融合，然后使用常規(guī)篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。

具體地，單克隆抗體可以可以制備如下。例如，用作用于獲得抗體的敏化抗原的gp130可以通過使用歐洲專利申請公布號ep411946中公開的gp130基因和/或氨基酸序列獲得。

在將合適的宿主細胞用插入有g(shù)p130基因序列的已知的表達載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后，使用已知方法從宿主細胞內(nèi)部或從培養(yǎng)物上清中純化靶g(shù)p130蛋白。此純化的gp130蛋白可用作敏化抗原。備選地，表達gp130的細胞或gp130蛋白與另一種蛋白的融合蛋白可以用作敏化抗原。

用敏化抗原免疫的哺乳動物不受特別限制，但是考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性進行優(yōu)選選擇。典型地，使用嚙齒動物如小鼠，大鼠和倉鼠。

根據(jù)已知方法用敏化抗原免疫動物。典型地，免疫通過例如腹膜內(nèi)或皮下注射敏化抗原至哺乳動物進行。具體地，優(yōu)選的是，將敏化抗原稀釋或懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，生理鹽水等中至適當?shù)捏w積，并在需要時將其與適量的常規(guī)佐劑如弗氏完全佐劑混合并乳化，然后每4至21天向哺乳動物施用若干次。適當?shù)妮d體也可以用于利用敏化抗原的免疫。

在以此方式免疫動物并確認所需抗體的血清水平增加后，將免疫的細胞從哺乳動物中移出并進行細胞融合。脾細胞作為進行細胞融合的免疫細胞是特別優(yōu)選的。

將來自哺乳動物的骨髓瘤細胞用作與免疫的細胞融合的親本細胞。目前，多種已知的細胞系如p3x63ag8.653(kearney,j.f.等,j.immunol(1979)123,1548-1550)，p3x63ag8u.1(currenttopicsinmicrobiologyandimmunology(1978)81,1-7)，ns-1(kohler,g.和milstein,c.,eur.j.immunol.(1976)6,511-519)，mpc-11(margulies,d.h.等,cell(1976)8,405-415),sp2/0(shulman,m.等,nature(1978)276,269-270)，f0(dest.groth,s.f.等,j.immunol.methods(1980)35,1-21)，s194(trowbridge,i.s.,j.exp.med.(1978)148,313-323)和r210(galfre,g.等,nature(1979)277,131-133)被合適地使用。

基本上，前述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合可以根據(jù)已知方法如milstein等的方法(kohler,g.和milstein,c.,methodsenzymol.(1981)73,3-46)進行。

更具體地，例如在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中在細胞融合促進劑存在下進行細胞融合。例如，將聚乙二醇(peg)或仙臺病毒(hvj)用作融合促進劑，并且如果需要，可以進一步添加佐劑如二甲亞砜以用于提高融合效率。

使用的免疫細胞與骨髓瘤細胞之比優(yōu)選為，例如，1至10個免疫細胞對一個骨髓瘤細胞。用于細胞融合的培養(yǎng)基例如是適用于骨髓瘤細胞系的增殖的rpmi1640或mem培養(yǎng)基。也可以使用用于該類型細胞培養(yǎng)的其他常規(guī)培養(yǎng)基。此外，血清補充物如胎牛血清(fcs)也可以組合使用。

對于細胞融合，目的融合細胞(雜交瘤)通過以下方式形成：將預定量的前述免疫細胞與骨髓瘤細胞在前述培養(yǎng)基中充分攪拌，添加預熱至約37℃的濃度通常為30％至60％(w/v)的peg溶液(例如，平均分子量為約1,000至6,000的peg的溶液)，然后將其混合。然后，可以通過重復以下操作將不適合雜交瘤生長的細胞融合劑等除去：順序地添加適當?shù)呐囵B(yǎng)基并通過離心除去上清。

通過在常規(guī)的選擇培養(yǎng)基，例如，hat培養(yǎng)基(含次黃嘌呤，氨基蝶呤和腺苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)來選擇雜交瘤。在hat培養(yǎng)基中的培養(yǎng)進行足夠長的時間，通常數(shù)日至數(shù)周，以殺死目的雜交瘤以外的細胞(未融合的細胞)。然后，進行標準有限稀釋方法以篩選和克隆產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤。

除了用抗原免疫非人動物獲得雜交瘤以外，所需的對所需的抗原或抗原表達細胞具有結(jié)合活性的人抗體可以通過以下方式獲得：在體外用所需的抗原蛋白或抗原表達細胞敏化人淋巴細胞，并且將敏化的b淋巴細胞與人骨髓瘤細胞如u266融合(參見，日本專利申請kokoku公布號(jp-b)h01-59878(經(jīng)審查批準的日本專利申請，公布用于異議))。此外，可以將抗原或抗原表達細胞施用于具有人抗體基因庫(repertoire)的轉(zhuǎn)基因動物，然后可以遵循前述方法獲得所需的人抗體(參見，國際專利申請公布號wo93/12227，wo92/03918，wo94/02602，wo94/25585，wo96/34096和wo96/33735)。

可以將由此制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤在常規(guī)培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)并長期儲存在液氮中。

為了由雜交瘤獲得單克隆抗體，可以使用以下方法：根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)雜交瘤并且獲得作為培養(yǎng)物上清的抗體或?qū)㈦s交瘤施用到相容的哺乳動物中而使其增殖并且由腹水獲得抗體；等等。前一種方法適用于獲得高純度的抗體，而后一種方法適用于大規(guī)?？贵w生產(chǎn)。

例如，產(chǎn)生抗-il-6受體抗體的雜交瘤可以通過jp-a(kokai)h03-139293中公開的方法制備。此種制備可以通過以下方式進行：將產(chǎn)生pm-1抗體的雜交瘤注射到balb/c小鼠的腹腔中，獲得腹水，然后由腹水純化pm-1抗體；或在適當?shù)呐囵B(yǎng)基(如含10％胎牛血清和5％bm-condimedh1(boehringermannheim)的rpmi1640培養(yǎng)基；雜交瘤sfm培養(yǎng)基(gibco-brl)；或pfhm-ii培養(yǎng)基(gibco-brl))中培養(yǎng)雜交瘤，然后由培養(yǎng)物上清純化pm-1抗體。

重組抗體可以用作本發(fā)明的單克隆抗體，其中所述重組抗體通過以下方式制備：使用遺傳重組技術(shù)，從雜交瘤克隆抗體基因，將基因插入到適當?shù)妮d體中，然后將載體引入宿主中(見，例如，borrebaeck,c.a.k.和larrick,j.w.,therapeuticmonoclonalantibodies,在英國由macmillanpublishersltd出版,1990)。

更具體地，將編碼抗體可變(v)區(qū)的mrna從產(chǎn)生目的抗體的細胞(如雜交瘤)分離。mrna可以通過以下方式分離：根據(jù)已知方法如胍超速離心法(chirgwin,j.m.等,biochemistry(1979)18,5294-5299)和agpc法(chomczynski,p.等,anal.biochem.(1987)162,156-159)制備總rna，并且使用mrna純化試劑盒(pharmacia)等制備mrna。備選地，mrna可以直接使用quickprepmrna純化試劑盒(pharmacia)制備。

使用反轉(zhuǎn)錄酶由獲得的mrna合成抗體v區(qū)的cdna。cdna可以使用amv反轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cdna合成試劑盒等合成。此外，為了合成和擴增cdna，可以使用利用5’-amplifinderrace試劑盒(clontech)和pcr的5’-race法(frohman,m.a.等,proc.natl.acad.sci.usa(1988)85,8998-9002；belyavsky,a.等,nucleicacidsres.(1989)17,2919-2932)。由獲得的pcr產(chǎn)物純化目的dna片段，然后與載體dna連接。然后，使用以上制備重組載體，并將其引入大腸桿菌等中，然后選擇其克隆以制備所需的重組載體。通過已知方法如雙脫氧法確認目的dna的核苷酸序列。

當獲得編碼目的抗體的v區(qū)的dna時，將該dna與編碼所需抗體的恒定區(qū)(c區(qū))的dna連接，并插入表達載體中。備選地，編碼抗體v區(qū)的dna可被插入到包含抗體c區(qū)的dna的表達載體中。

為了制備本發(fā)明中使用的抗體，將抗體基因插入到表達載體中以使其在表達調(diào)節(jié)區(qū)如增強子和啟動子的控制下表達，如下所述。然后，可以通過用該表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞來表達所述抗體。

在本發(fā)明中，可以使用人工修飾的重組抗體，例如，嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體，例如，以減小針對人的雜抗原性。這些修飾的抗體可以使用已知方法制備。

嵌合抗體可以通過以下方式獲得：將如上獲得的編碼抗體v區(qū)的dna與編碼人抗體c區(qū)的dna連接，將其插入到表達載體中，并將載體引入到宿主中以產(chǎn)生嵌合抗體(參見，歐洲專利申請公布號ep125023；國際專利申請公布號wo92-19759)。該已知方法可用于獲得可用于本發(fā)明的嵌合抗體。

人源化抗體也被稱為改造的人抗體或制成人類型的抗體。其通過將來自非人動物(例如，小鼠)的抗體的互補決定區(qū)(cdr)移植到人抗體的cdr中來制備。用于該基因重組的一般方法也是已知的(參見，歐洲專利申請公布號ep125023，國際專利申請公布號wo92-19759)。

更具體地，被設(shè)計成將小鼠抗體的cdr與人抗體的框架區(qū)(fr)連接的dna序列通過pcr由被制備成在其末端含重疊部分的若干寡核苷酸合成。將獲得的dna與編碼人抗體c區(qū)的dna連接并插入到表達載體中，并將表達載體引入到宿主中以制備人源化抗體(參見，歐洲專利申請公布號ep239400，國際專利申請公布號wo92-19759)。

選擇經(jīng)由cdr連接的人抗體fr以致cdr形成令人滿意的抗原結(jié)合位點。當需要時，可以替換抗體可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)的氨基酸，以致改造的人抗體的cdr形成適當?shù)目乖Y(jié)合位點(sato,k.等,cancerres.(1993)53,851-856)。

將人抗體c區(qū)用于嵌合和人源化抗體。人抗體c區(qū)的實例包括cγ，并且例如，可以使用cγ1，cγ2，cγ3或cγ4。此外，為了提高抗體及其制備的穩(wěn)定性，可以修飾人抗體c區(qū)。

嵌合抗體由來源于非人動物的抗體的可變區(qū)和來源于人抗體的c區(qū)組成；人源化抗體由來源于非人動物的抗體的cdr和來源于人抗體的框架區(qū)和c區(qū)組成。其在人體中的抗原性被減弱，并且因此其可用作本發(fā)明中使用的抗體。

用于本發(fā)明的人源化抗體的優(yōu)選的具體實例包括人源化pm-1抗體(參見，國際專利申請公布號wo92-19759)。

此外，除了上述獲得人抗體的方法以外，通過使用人抗體文庫進行淘選來獲得人抗體的技術(shù)也是已知的。例如，可以通過使用噬菌體展示方法將人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scfv)表達在噬菌體表面上，然后可以選擇結(jié)合抗原的噬菌體。通過分析所選噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的dna序列。在揭示了與抗原結(jié)合的scfv的dna序列后，可以制備包含所述序列的適當?shù)谋磉_載體以獲得人抗體。這些方法是已知的，并且公開wo92/01047，wo92/20791，wo93/06213，wo93/11236，wo93/19172，wo95/01438和wo95/15388可用作參考。

如上所述構(gòu)建的抗體基因可以根據(jù)已知方法表達。當使用哺乳動物細胞時，可以通過以下方式表達抗體基因：使用其中常用的有效啟動子基因，要表達的抗體基因，和抗體基因3’側(cè)(下游)的多聚腺苷酸信號被可操作地連接在一起的dna，或使用含所述dna的載體。啟動子/增強子的實例包括人巨細胞病毒立早啟動子/增強子。

此外，可用于表達可用于本發(fā)明的抗體的其他啟動子/增強子包括來自反轉(zhuǎn)錄病毒，多瘤病毒，腺病毒，猿猴病毒40(sv40)等的病毒啟動子/增強子；和來源于哺乳動物細胞的啟動子/增強子如人延伸因子1α(hef1α)。

表達可以容易地進行，例如，在使用sv40啟動子/增強子時遵循mulligan等(mulligan,r.c.等,nature(1979)277,108-114)中的方法，或在使用hef1α啟動子/增強子時遵循mizushima等(mizushima,s.和nagatas.,nucleicacidsres.(1990)18,5322)中的方法。

當使用大腸桿菌時，可以通過可操作地連接常用的有效啟動子基因，用于抗體分泌的信號序列，和要表達的抗體基因來表達所述抗體基因。啟動子的實例包括lacz啟動子和arab啟動子。可以根據(jù)ward等的方法(ward,e.s.等,nature(1989)341,544-546；ward,e.s.等,fasebj.(1992)6,2422-2427)使用lacz啟動子；并且可以根據(jù)better等的方法(better,m.等,science(1988)240,1041-1043)使用arab啟動子。

當在大腸桿菌的周質(zhì)中制備抗體時，pelb信號序列(lei,s.p.等,j.bacteriol.(1987)169,4379-4383)可以用作抗體分泌的信號序列。將周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體分離，然后適當再折疊要使用的抗體結(jié)構(gòu)(參見，例如，wo96/30394)。

作為復制起點，可以使用來源于sv40，多瘤病毒，腺病毒，牛乳頭瘤病毒(bpv)等的那些。此外，為了增加宿主細胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)，表達載體可以包含氨基葡糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(aph)基因，腺苷激酶(tk)基因，大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(ecogpt)基因，二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標志物。

任何制備系統(tǒng)都可以用于制備用于本發(fā)明的抗體。用于抗體制備的制備系統(tǒng)包括體外和體內(nèi)制備系統(tǒng)。體外制備系統(tǒng)包括使用真核細胞的那些或使用原核細胞的那些。

當使用真核細胞時，制備系統(tǒng)包括使用動物細胞，植物細胞或真菌細胞的那些。此種動物細胞包括(1)哺乳動物細胞如cho，cos，骨髓瘤，幼侖鼠腎(bhk)，hela和vero；(2)兩棲動物細胞如非洲爪蟾卵母細胞；和(3)昆蟲細胞如sf9，sf21和tn5。已知的植物細胞包括來源于煙草(nicotianatabacum)的細胞，其可以在愈傷組織中培養(yǎng)。已知的真菌細胞包括酵母如酵母屬(saccharomyces)(例如，釀酒酵母(saccaromycescerevisiae))和霉菌真菌如曲霉菌屬(aspergillus)(例如，黑曲霉(aspergillusniger))。

當使用原核細胞時，制備系統(tǒng)包括使用細菌細胞的那些。已知的細菌細胞包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)。

可以通過轉(zhuǎn)化將目的抗體基因引入到這些細胞中然后在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞來獲得抗體。細胞根據(jù)已知方法培養(yǎng)。例如，dmem，mem，rpmi1640或imdm可以用作培養(yǎng)基，并且可以組合使用血清補充物如胎牛血清(fcs)。備選地，引入有抗體基因的細胞可以被轉(zhuǎn)移到動物的腹腔中以在體內(nèi)制備抗體。

同時，體內(nèi)制備系統(tǒng)包括使用動物的那些或使用植物的那些。當使用動物時，制備系統(tǒng)包括使用哺乳動物或昆蟲的那些。

可以使用的哺乳動物包括包括山羊，豬，綿羊，小鼠和牛(vickiglaser，spectrumbiotechnologyapplications，1993)。此外，可以使用的昆蟲包括蠶。當使用植物時，可以使用煙草等。

抗體基因被引入到這些動物或植物中，并且在動物或植物體內(nèi)制備抗體，然后回收。例如，抗體基因可以通過將其插入到編碼僅在乳汁中生產(chǎn)的蛋白(如山羊β酪蛋白)的基因的中部而被制備成融合基因。將含有包含插入的抗體基因的融合基因的dna片段注射到山羊胚胎中，并且將胚胎移入到母山羊中。所需的抗體獲得自由受胎的山羊產(chǎn)下的轉(zhuǎn)基因山羊或其后代產(chǎn)的乳汁。當適當時，可以給予轉(zhuǎn)基因山羊以激素來增加其產(chǎn)出的含有所需抗體的奶量(ebert,k.m.等,bio/technology(1994)12,699-702)。

當使用蠶時，用插入有目的抗體基因的桿狀病毒感染蠶，并且所需的抗體獲得自這些蠶的體液(maeda,s.等,nature(1985)315,592-594)。此外，當使用煙草時，將目的抗體基因插入到植物表達載體如pmon530中，并將所述載體引入到細菌如根瘤農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)中。將該細菌用于感染煙草如nicotianatabacum，然后所需的抗體獲得自該煙草的葉子(julian,k.-c.ma等,eur.j.immunol.(1994)24,131-138)。

當使用如上所述的體外或體內(nèi)制備系統(tǒng)制備抗體時，可以將編碼抗體重鏈(h鏈)和輕鏈(l鏈)的dna插入到分開的表達載體中，然后用所述載體共轉(zhuǎn)化宿主。備選地，編碼h鏈的dna和編碼l鏈的dna可以被插入到單個表達載體中用于轉(zhuǎn)化宿主(參見國際專利申請公布號wo94-11523)。

本發(fā)明中使用的抗體可以是抗體片段或其修飾產(chǎn)物，只要其可適用于本發(fā)明即可。例如，抗體片段包括fab，f(ab’)2，fv和單鏈fv(scfv)，其中h和l鏈的fv經(jīng)由適當?shù)慕宇^連接。

具體地，抗體片段通過以下方式制備：用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體，或備選地，構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因并將其引入到表達載體中，然后在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_所述載體(參見，例如，co,m.s.等,j.immunol.(1994)152,2968-2976；better,m.&horwitz,a.h.,methodsinenzymology(1989)178,476-496；plueckthun,a.&skerra,a.,methodsinenzymology(1989)178,497-515；lamoyi,e.,methodsinenzymology(1989)121,652-663；rousseaux,j.等,methodsinenzymology(1989)121,663-666；以及bird,r.e.等,tibtech(1991)9,132-137)。

scfv可以通過將抗體的h-鏈v區(qū)和l-鏈v區(qū)連接而獲得。在此scfv中，h-鏈v區(qū)和l-鏈v區(qū)經(jīng)由接頭連接，優(yōu)選經(jīng)由肽接頭連接(huston,j.s.等,proc.natl.acad.sci.usa(1988)85,5879-5883)。scfv中h和l鏈的v區(qū)可以來源于任何上述抗體。用于連接v區(qū)的肽接頭包括，例如，由12至19個氨基酸殘基組成的任意單鏈肽。

編碼scfv的dna可以通過以下方式獲得：利用pcr使用限定編碼所需氨基酸序列的dna部分的末端的引物對擴增模板序列中的所述部分，其中編碼前述抗體的h鏈或h-鏈v區(qū)的dna和編碼前述抗體的l鏈或l-鏈v區(qū)的dna被用作模板，然后利用編碼肽接頭部分的dna和限定接頭兩端的引物對進一步擴增擴增的dna部分，以使其可以被連接至h和l鏈中的每個。

在制備了編碼scfv的dna后，可以根據(jù)常規(guī)方法獲得包含所述dna的表達載體和轉(zhuǎn)化有所述表達載體的宿主。此外，可以根據(jù)常規(guī)方法通過使用宿主獲得scfv。

與以上類似，抗體片段可以通過獲得其基因，將其表達，然后使用宿主來制備。本文中使用的“抗體”涵蓋此種抗體片段。

與多種分子如聚乙二醇(peg)結(jié)合的抗體也可以用作修飾的抗體。本文中使用的“抗體”涵蓋此種修飾的抗體。這些修飾的抗體可以通過將獲得的抗體化學修飾獲得。此種方法在本領(lǐng)域中已是確定的。

如上制備和表達的抗體可以自細胞內(nèi)部或外部或自宿主分離，然后純化至均質(zhì)。用于本發(fā)明的抗體可以通過親和色譜來分離和純化。用于親和色譜的柱包括蛋白a柱和蛋白g柱。用于蛋白a柱的載體包括hyperd，poros和sepharosef.f。其他用于普通蛋白的分離和/或純化的方法可以使用而不受限制。

例如，用于本發(fā)明的抗體可以通過適當?shù)剡x擇和組合除上述親和色譜以外的色譜法，過濾，超濾，鹽析，透析等來分離和純化。色譜法的實例包括離子交換色譜法，疏水性色譜法，和凝膠過濾。這些色譜法可以應用于高能液相色譜(hplc)。備選地，可以使用反相hplc。

如上獲得的抗體的濃度可以通過吸光度測量，elisa等來確定。具體地，當使用吸光度測量時，濃度可以通過以下方式確定：用pbs(-)適當?shù)叵♂尶贵w溶液，測量其在280nm的吸光度，并且使用轉(zhuǎn)換因子1.35od/1mg/ml計算濃度。備選地，當使用elisa時，濃度可以如下確定。具體地，將用0.1m碳酸氫鹽緩沖液(ph9.6)稀釋至1μg/ml的100μl山羊抗-人igg(tag)添加至96孔板(nunc)中并在4℃過夜孵育以固定抗體。在封閉后，添加100μl要用于本發(fā)明的適當稀釋的抗體或作為標準品的包含抗體或人igg(cappel)的適當稀釋的樣品，并將平板在室溫孵育一小時。

在洗滌后，添加100μl的5,000x稀釋的堿性磷酸酶標記的抗-人igg(biosource)，并將平板在室溫孵育一小時。在又一次洗滌后，加入底物溶液，將平板孵育，并使用microplatereadermodel3550(bio-rad)測量在405nm的吸光度以計算目的抗體的濃度。

本發(fā)明中使用的il-6變體是這樣的物質(zhì)，其對il-6受體具有結(jié)合活性并且不傳導il-6生物學活性。即，il-6變體與il-6競爭結(jié)合il-6受體，但是不傳導il-6生物學活性，并因此阻斷il-6介導的信號轉(zhuǎn)導。

il-6變體通過置換在il-6的氨基酸序列中的氨基酸殘基引入突變來制備。可以使用il-6變體所來源于的任何il-6，但是考慮到抗原性等，人il-6是優(yōu)選的。

更具體地，氨基酸置換通過使用已知的分子建模程序如whatif(vriend等,j.mol.graphics(1990)8,52-56)由il-6氨基酸序列預測il-6的二級結(jié)構(gòu)并進一步評估置換的氨基酸殘基對整個分子的影響來進行。在確定了置換的適當?shù)陌被釟埢?，通過常規(guī)進行的pcr方法使用包含編碼人il-6基因的核苷酸序列的載體作為模板來引入突變從而導致氨基酸置換，并且由此獲得編碼il-6變體的基因。如果需要，將該基因插入到適當?shù)谋磉_載體中，并且可以根據(jù)前述用于表達，制備和純化重組抗體的方法獲得il-6變體。

il-6變體的具體實例公開在brakenhoff等,j.biol.chem.(1994)269,86-93；savino等,emboj.(1994)13,1357-1367；wo96-18648；和wo96-17869中。

本發(fā)明中使用的il-6或il-6受體的部分肽是這樣的物質(zhì)，其分別對il-6受體或il-6具有結(jié)合活性，并且不傳導il-6生物學活性。即，il-6或il-6受體的部分肽結(jié)合并捕獲il-6受體或il-6，并由此特異性地抑制il-6與il-6受體的結(jié)合。因此，il-6生物學活性不被傳導，并且因此，il-6介導的信號轉(zhuǎn)導被阻斷。

il-6或il-6受體的部分肽是這樣的肽，其由參與il-6和il-6受體之間的結(jié)合的il-6或il-6受體氨基酸序列的區(qū)域或其部分的整個氨基酸序列組成。此種肽通常由10至80，優(yōu)選20至50，更優(yōu)選20至40個氨基酸參見組成。

il-6或il-6受體的部分肽可以通過以下方式制備：指定參與il-6和il-6受體之間的結(jié)合的il-6或il-6受體氨基酸序列的區(qū)域，并將通常已知的方法如基因工程技術(shù)和肽合成方法應用于指定的區(qū)域或其部分的整個氨基酸序列。

為了通過基因工程方法制備il-6或il-6受體的部分肽，將編碼所需肽的dna序列插入到表達載體中，然后可以通過應用前述用于表達，制備和純化重組抗體的方法來獲得所述肽。

為了通過肽合成方法制備il-6或il-6受體的部分肽，可以使用常用的肽合成方法如固相合成方法和液相合成方法。

具體地，所述肽可以根據(jù)“thesequelofdevelopmentofpharmaceuticals(zokuiyakuhinnokaihatsu),vol.14,peptidesynthesis(編輯haruakiyajima,1991,hirokawashoten)”中所述的方法合成。作為固相合成方法，可以采用以下方法等：使對應于要合成的肽的c末端的氨基酸結(jié)合至在有機溶劑中可溶的支持物，然后通過交替重復以下來使肽鏈延伸(1)縮合α-氨基和支鏈官能團受適當?shù)谋Ｗo基保護的氨基酸的反應，在c末端至n末端方向上，每次一個；和(2)從與樹脂結(jié)合的氨基酸或肽的α-氨基除去保護基的反應。固相肽合成根據(jù)所用保護基的類型被大體分為boc法和fmoc法。

在如上合成目的肽后，進行去保護反應和從支持物上切割肽鏈的反應。對于切割肽鏈的反應，氟化氫或三氟甲磺酸通常用于boc法，而tfa通常用于fmoc法。在boc法中，例如，在茴香醚存在下將與受保護的肽結(jié)合的樹脂用氟化氫處理。然后，通過除去保護基并將肽從其支持物上切割下來而回收所述肽。通過凍干回收的肽，可以獲得粗肽。在fmoc法中，去保護反應和從支持物上切割肽鏈的反應可以在tfa等中通過與上述類似的操作來進行。

獲得的粗肽可以通過應用hplc來分離和純化。洗脫可以在最優(yōu)條件下使用常用于蛋白純化的水-乙腈溶劑系統(tǒng)來進行。對應于獲得的色譜特征曲線的峰的級分被收集和凍干。將以此方式純化的肽級分通過經(jīng)由質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析等的分子量分析來鑒別。

il-6和il-6受體的部分肽的具體實例被公開在jp-a(kokai)h02-188600，jp-a(kokai)h07-324097，jp-a(kokai)h08-311098，和美國專利公布號us5210075中。

本發(fā)明中使用的抗體可以是與多種分子如聚乙二醇(peg)，放射性物質(zhì)和毒素結(jié)合的綴合抗體。此種綴合抗體可以通過對獲得的抗體進行化學修飾獲得。用于抗體修飾的方法在本領(lǐng)域中是已經(jīng)確定的。因此，當在本文中使用時，術(shù)語“抗體”涵蓋此種綴合抗體。

在本發(fā)明中，“il-6相關(guān)疾病”是指與il-6有關(guān)的疾病，并且實例包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、全身發(fā)作性青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、卡斯爾曼病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)、狼瘡腎炎、克羅恩氏病、淋巴瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、貧血、血管炎、川崎病、斯蒂爾病、淀粉樣變性、多發(fā)性硬化、移植、年齡相關(guān)性黃斑變性、強直性脊柱炎、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病(copd)、iga腎病、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、糖尿病腎病、gvhd、子宮內(nèi)膜異位癥、肝炎(nash)、心肌梗死、動脈硬化、膿毒癥、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、腎癌、b-細胞非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸癌、癌惡病質(zhì)、癌神經(jīng)侵入、心肌梗死、近視性脈絡(luò)膜新血管生成、特發(fā)性脈絡(luò)膜新血管生成、葡萄膜炎、慢性甲狀腺炎、遲發(fā)型超敏反應、接觸性皮炎、特應性皮炎、間皮瘤、多肌炎、皮肌炎、全葡萄膜炎、前葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、鞏膜炎、角膜炎、眼窩炎癥、視神經(jīng)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、干眼癥、術(shù)后炎癥、視神經(jīng)脊髓炎、重癥肌無力和肺高血壓。

在本發(fā)明中，“常規(guī)給藥間隔”是指通常用于上述藥物(本發(fā)明的藥物組合物)的給藥間隔，例如，在包裝內(nèi)頁中可被描述為“隨后劑量應當以四周為間隔施用”等的常規(guī)施用的給藥間隔。本發(fā)明中的常規(guī)給藥間隔不受特別限制，但是實例包括一天至24周，優(yōu)選兩周至八周，更優(yōu)選三至五周，并且甚至更優(yōu)選四周。常規(guī)給藥間隔可以具有一定的范圍。

在本發(fā)明中，“常規(guī)劑量”是通常用于上述藥物(本發(fā)明的藥物組合物)的劑量，例如，在包裝內(nèi)頁中可被描述為“通常，單劑量為8mg/kg體重”的通常施用的劑量。本發(fā)明中的常規(guī)劑量不受特別限制，但是每次施用的劑量可以為，例如，2至20mgil-6抑制劑/kg體重(2-20mg/kg)或50mg至800mgil-6抑制劑，優(yōu)選2至8mgil-6抑制劑/kg體重(2-8mg/kg)或80至160mgil-6抑制劑，或更優(yōu)選8mgil-6抑制劑/kg體重(8mg/kg)或120mgil-6抑制劑。

在本發(fā)明中，“短間隔給藥期”是指引起針對藥物(本發(fā)明的藥物組合物)的免疫耐受以抑制由于免疫原性所致的抗-藥物抗體產(chǎn)生的給藥期。本發(fā)明中的短間隔給藥期是指這樣的給藥期，其中以比常規(guī)給藥間隔更短的間隔多次施用與常規(guī)劑量相同的劑量。雖然短間隔期間不受特別限制，只要其是引起免疫耐受的期間即可，該期間優(yōu)選為自初始施用起1至8周，并且更優(yōu)選為自初始施用起4周。“與常規(guī)劑量相同的劑量”包括這樣的劑量，所述劑量提供與常規(guī)劑量相同的il-6抑制劑血液濃度?！氨瘸Ｒ?guī)給藥間隔更短的間隔”不受特別限制，只要其短于常規(guī)給藥間隔即可，并且優(yōu)選為常規(guī)給藥間隔的一半，例如，兩周(當常規(guī)給藥間隔為四周時)。例如，短間隔給藥期可以具有一定的范圍如一至兩周。“(被)多次施用”是指包括初始施用在內(nèi)的兩次以上施用，并且優(yōu)選為包括初始施用在內(nèi)的2至5次施用，更優(yōu)選包括初始施用在內(nèi)的3次施用。是否引起免疫耐受可以通過觀察抗-藥物抗體產(chǎn)生是否被抑制來確定。

本發(fā)明中的“常規(guī)施用”是指常用于上述藥物(本發(fā)明的藥物組合物)的施用，例如，按上述“常規(guī)劑量”和“常規(guī)給藥間隔”施用。

本發(fā)明的“il-6受體抗體”的優(yōu)選實例包括作為人源化抗-il-6受體igg1抗體的托珠單抗，和通過修飾托珠單抗的可變區(qū)和恒定區(qū)制備的人源化抗-il-6受體抗體，具體地，含有包含seqidno:1的序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno:2的序列的輕鏈可變區(qū)的抗體。更優(yōu)選的實例是這樣的抗體，所述抗體含有包含seqidno:3的序列的重鏈(sa237的重鏈)和包含seqidno:4的序列的輕鏈(sa237的輕鏈)。sa237是尤其優(yōu)選的。

此種抗體可以根據(jù)wo2010/035769，wo2010/107108，wo2010/106812等中所述的方法獲得。具體地，抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳重組技術(shù)，基于上述il-6受體抗體的序列制備(參見，例如，borrebaeckcak和larrickjw,therapeuticmonoclonalantibodies,在英國由macmillanpublishersltd出版,1990)。重組抗體可以通過以下方式獲得：由產(chǎn)生雜交瘤或抗體的細胞如產(chǎn)生抗體的敏化的淋巴細胞克隆編碼抗體的dna，將所述dna插入到適當?shù)妮d體中，并將所述載體引入到宿主(宿主細胞)中以制備抗體。

此種抗體可以使用常規(guī)用于抗體純化的分離和純化方法來分離和純化而不受限制。例如，所述抗體可以通過適當?shù)剡x擇和組合柱色譜，過濾，超濾，鹽析，溶劑沉淀，溶劑萃取，蒸餾，免疫沉淀，sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦，透析，再結(jié)晶等來分離和純化。

在本發(fā)明中，常規(guī)給藥期始自短間隔給藥期的最后一次給藥。更具體地，短間隔給藥期中的最后一次給藥之后是常規(guī)給藥間隔，然后進行常規(guī)給藥期中的第一次給藥。

本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是這樣的藥物組合物，其中自短間隔給藥期中的初次給藥起以1至3周的間隔將與常規(guī)劑量相同的劑量的il-6抑制劑施用2至5次，然后自短間隔給藥期中的最后一次給藥開始以2至8周的間隔施用il-6抑制劑，使用50mg至800mg/施用的常規(guī)劑量；或更優(yōu)選這樣的藥物組合物，其中自短間隔給藥期中的初次給藥起以2周的間隔(即，在第0周，第2周和第4周)以與常規(guī)劑量相同的劑量將sa237施用3次，然后自短間隔給藥期中的最后一次給藥開始(即，在第12周，第20周，第28周，以此類推，以8周為間隔，自短間隔給藥期中的初次給藥起計數(shù))以8周的間隔常規(guī)施用sa237，使用120mg/施用的常規(guī)劑量。

可以調(diào)整對于il-6抑制劑的優(yōu)選的給藥時間安排，例如，通過監(jiān)測疾病狀況和血液測試值的變化適當?shù)匮娱L給藥間隔。

用于治療或預防目的的本發(fā)明的藥物組合物可以被配制成在需要時通過與合適的藥用載體，賦形劑等混合來制備凍干制劑或溶液制劑。合適的藥用載體和賦形劑包括，例如，無菌水，生理鹽水，穩(wěn)定劑，賦形劑，抗氧化劑(如抗壞血酸)，緩沖劑(如磷酸鹽，檸檬酸鹽，組氨酸及其他有機酸)，殺菌劑，表面活性劑(如peg和tween)，螯合劑(如edta)和粘合劑。也可以含有其他低分子量多肽，蛋白如血清白蛋白，明膠和免疫球蛋白，氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，谷氨酸，天冬氨酸，甲硫氨酸，精氨酸和賴氨酸，糖和碳水化合物如多糖和單糖，以及糖醇如甘露醇和山梨醇。當制備注射用水溶液時，可以使用包含葡萄糖和其他輔劑如d-山梨醇，d-甘露糖，d-甘露醇和氯化鈉的生理鹽水和等滲溶液；并且適當?shù)脑鋈軇┤绱?例如，乙醇)，多元醇(如丙二醇和peg)，和非離子表面活性劑(如聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯20，泊洛沙姆188和hco-50)可以被組合使用。通過將透明質(zhì)酸酶混合到制劑中，可以皮下施用更大的液體體積(expertopin.drugdeliv.2007jul；4(4):427-40)。此外，注射器可以預裝有本發(fā)明的藥物組合物。溶液制劑可以根據(jù)wo2011/090088中所述的方法制備。

如果需要，本發(fā)明的藥物組合物可以被包封在微膠囊(例如，由羥甲基纖維素，明膠和聚(甲基丙烯酸甲酯)制成的那些)中，或被結(jié)合到膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球，微乳，納米粒和納米膠囊)中(參見，例如，“remington'spharmaceuticalscience16thedition(remington藥物科學第16版)”,osloed.(1980))。用于將藥劑制備成控釋藥劑的方法也是已知的，并且此種方法可以應用于本發(fā)明的藥物組合物(langer等,j.biomed.mater.res.15:267-277(1981)；langer,chemtech.12:98-105(1982)；u.s.專利no.3,773,919；歐洲專利申請公布號ep58,481；sidman等,biopolymers22:547-556(1983)；和ep133,988)。

本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)由任何適當?shù)耐緩绞┯糜诨颊?。例如，其可以以靜脈內(nèi)(通過推注或連續(xù)輸注)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦脊內(nèi)，透皮，皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，舌下，滑膜內(nèi)，口服，吸入，局部或外部連續(xù)輸注方式施用于患者達特定時間長度。靜脈內(nèi)施用或皮下施用是優(yōu)選的。

本文中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻都通過引用結(jié)合的本說明書中。

實施例

下文中，將關(guān)于實施例來具體描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不被視為限于所述實施例。

[實施例1]制備il-6抑制劑

專利文獻wo2010/035769中描述的il-6受體抗體sa237(wo2010/035769中的含有具有wo2010/035769的seqidno:26(本文中的seqidno:3)的序列的重鏈和具有wo2010/035769的seqidno:29(本文中的seqidno:4)的序列的輕鏈的抗體)根據(jù)上述專利文獻中的描述制備。通過專利文獻wo2011/090088中的方法將制備的抗體用于制備用于皮下施用的制劑。

[實施例2]通過向健康的成年男性日本人和高加索人受試者(sa001jp)的單次皮下施用進行檢測

評估在向健康的成年男性日本人和高加索人受試者皮下施用時，sa237的安全性，耐受性，藥代動力學和生物利用度。在該研究中，通過滴注向48名日本個體皮下或靜脈內(nèi)施用sa237，并且向24名高加索個體皮下施用sa237。sa237的單次施用的安全性和耐受性在24例中幾乎都是令人滿意的。60mg和120mg皮下施用的sa237的絕對生物利用度分別為64.6％和69.4％。在施用了sa237的72名受試者中的39名受試者中觀察到發(fā)展出抗-sa237抗體。

[實施例3]通過向日本類風濕性關(guān)節(jié)炎患者(sa-105jp)的多次皮下施用的開放標簽，平行組比較研究

選擇滿足以下標準的患者作為受試者：

(1)根據(jù)1987美國風濕病學學院(americancollegeofrheumatology，acr)標準被診斷為患有類風濕性關(guān)節(jié)炎(ra)；

(2)6個月以上的ra疾病持續(xù)時間；

(3)在開始施用研究藥用產(chǎn)品(imp)前兩周內(nèi)進行的測試中顯示高于實驗室參比范圍的上限的c反應蛋白(crp)水平；

(4)知情同意時年齡為20歲以上；

(5)本人在知情同意表上簽名；

(6)在開始施用imp前16周或之后未接受甲氨蝶呤(mtx)治療；

(7)在開始施用imp前12周或之后(或者如果已經(jīng)進行了標準考來烯胺(cholestyramine)治療或利用活性炭的藥物去除，則在開始施用研究藥劑前4周或之后)未接受來氟米特(leflunomide)治療；

(8)在開始施用研究藥劑前4周或之后未接受利用dmard或除上述以外的免疫抑制劑的治療；并且

(9)在開始施用研究藥劑前2周或之后未接受超過10mg/天的潑尼松龍(prednisolone)當量的治療。

根據(jù)集中登記法將受試者隨機分成三組(a、b、c組)，并且進行開放標簽、平行組比較研究(參見表1)。隨機化通過體重分級。該臨床研究包括主要評估期、延長期和隨訪期。

在主要評估期中，在第0周，第2周和第4周施用120mg的sa237；并且從第8周至第16周以四周為間隔，向a、b、c組分別施用120mg，60mg和30mg的sa237。之后，基本上，分別觀察a、b、c組至第32周，第28周和第24周，預期在所述時間各組中的血清sa237濃度為不可檢測的水平(觀察包括抗-sa237抗體測量)。

在延長期中，在第0周，第2周和第4周施用120mg的sa237；并且從第8周至第20周以四周為間隔施用120mg的sa237，并繼續(xù)觀察至第32周。

試驗藥物的形式為裝有1.0ml溶液的小瓶，所述溶液含120mg的sa237。所述溶液含有l(wèi)-組氨酸，l-精氨酸，l-天冬氨酸和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇作為添加劑，并被調(diào)節(jié)至ph5.5至6.5。基本上，所述藥物被皮下施用至腹部區(qū)域。

[表1]

病例數(shù)

在藥物動力學和藥效學評估中，并且在重復施用sa237至ra患者的效力(在完整分析設(shè)定(fas)中)和安全性的檢查中，進行每種分析的各個11個病例的組(總計33例)中的受試者的背景是：年齡為59.0至65.0歲(各組的中值范圍；下文同樣適用)并且體重為50.30至57.90kg。各組中女性的百分比是高的，并且在a組中為81.8％(9/11例)，在b組中為90.9％(10/11例)，并且在c組中為63.6％(7/11例)。接受研究藥劑直至主要評估期結(jié)束的受試者在a組中為10/11例(90.9％)，在b組中為10/11例(90.9％)，并且在c組中為9/11例(81.8％)；并且整個期間(主要評估期和延長期)都可以被觀察的受試者在a組中為10/11例(90.9％)，在b組中為7/11例(63.6％)，并且在c組中為7/11例(63.6％)。

(1)藥代動力學

評估方法：根據(jù)表2和3進行觀察和測試。當沒有特別指明時，評估在施用研究藥劑前進行。即使限定的主要評估期沒有達到完成，當在延長期的初始施用的當天或之后進行評估時，隨后的對主要評估期的觀察和測試被確定是不必要的。測試期被如下限定。

主要評估期：原則上，對于a、b、c組，觀察和測試期始自研究藥劑施用的第一天，并且分別至第32周，第28周和第24周，預期在所述時間血清sa237濃度被消除。然而，當血清sa237濃度被確認為不可檢測的水平并且延長期中的施用在上述期間結(jié)束前開始時，主要評估期將被設(shè)定為延長期中的首次施用前直至觀察和測試的期間。

延長期：在完成主要評估期后，始自延長期中的首次施用，并且直至延長期的第24周的觀察和測試。

后觀察期：從延長期的第24周的觀察和測試完成開始并且直至第32周。

[表2]

觀察和檢查時間安排(主要評估期)

[表3]

觀察和檢查時間安排(延長期和隨訪期)

結(jié)果：指示該研究中的藥代動力學的圖表顯示在圖1中。在a組的主要評估期中并且在延長期中，從第4周起，血清sa237濃度的波谷水平大致不變。另一方面，在主要評估期期間，從第8周起，b組和c組中的血清sa237濃度下降。因為主要評估期和延長期未顯示血清sa237濃度和auc0-2w(至第8周)的顯著差異，所以當中斷sa237施用并且在之后繼續(xù)時，藥代動力學不改變。

(2)藥效學評估

結(jié)果：來自該研究中的藥效學評估的圖表顯示在圖2和3中。在a組中，在主要評估期期間從第8周至第20周，并且在延長期期間從第8周至第24周，其中血清sa237濃度保持在恒定水平，并且血清sil-6r濃度也被保持在大致恒定的水平。另一方面，在b和c組中，在主要評估期期間，從第8周起，作為il-6抑制的pd標志物的sil-6r血清濃度隨sa237濃度下降而下降。

在主要評估期期間，從第4周至第20周，在a組中的將近一半的受試者中，作為il-6抑制的pd標志物的crp低于量化的下限(0.005mg/dl)，并且平均值也保持較低，約為0.01mg/dl。所述值從第16周起(在b組中)以及從第8周起(在c組中)增加至0.1mg/dl以上。crp標準化(0.3mg/dl以下)的百分比也顯示與平均值的變化類似的趨勢。各組在第4周的百分比為81.8％至90.9％；并且之后，當將第20周的百分比與第8周的百分比相比時，a組未顯示自100％變化，b組顯示從81.8％至80.0％的變化并且是大致相同的，并且c組顯示從90.9％下降至33.3％。在大多數(shù)受試者和時間點中，只要血清sa237濃度是可量化的(0.2μg/ml)，則認為crp自基線下降。

(3)效力

評估方法：das28(改進的基于28個關(guān)節(jié)計數(shù)的疾病活躍度評分)是評估類風濕性關(guān)節(jié)炎活躍度的指示，其使用28個關(guān)節(jié)中的觸痛關(guān)節(jié)計數(shù)(tjc)和腫脹關(guān)節(jié)計數(shù)(sjc)，esr以及“患者全面評估(patientglobalassessment)”由以下等式計算。檢查從開始施用直至觀察的最后一天das28的變化。計算各組和各期的概要統(tǒng)計數(shù)字(平均值，標準差，中值，最小值和最大值)。此外，計算臨床緩解率。

針對das28進行檢查的28個關(guān)節(jié)

acr20％、50％、70％改善標準(acr20、acr50、acr70)評估如下。

acr改善標準

結(jié)果：主要評估期中das28評分的時程(其指示該檢查中的效力)顯示在下表4中。

[表4]

das28顯示第8周的改善。在主要評估期中在開始施用不同劑量(在第8周)后，a顯示das28的進一步改善，b組未顯示明顯變化，而c組顯示回到基線評分的趨勢。

在第8周，在每組中，根據(jù)acr標準的20％改善的頻率為70.0％至81.8％，50％改善的頻率為40.0％至50.0％，并且70％改善的頻率為18.2％至30.0％。與第8周相比，在第20周，20％改善頻率在a和b組中被保持，但在c組中降低。與第8周的值相比，在第20周，在a組中，50％和70％改善頻率分別增至72.7％(8/11例)和54.5％(6/11例)；然而，b和c組中沒有觀察到明顯變化。

(4)抗體陽性例中的免疫原性和藥代動力學，藥效學評估，效力和安全性

在b組和c組的各一個單個病例(即，總計33例中的2例)中檢測抗-sa237抗體。在這兩例中，在檢測出抗-sa237抗體后在延長期期間血清sa237濃度低于量化的下限，并且從檢出所述抗體時起，由于sa237施用所致的可溶性il-6受體(sil-6r)濃度的增加和crp濃度的下降沒有被觀察到，并且das28、cdai和sdai增加。在檢出所述抗體后，在這兩例中的一例中觀察到不良事件，即輕度糖尿病。該不良事件并非變態(tài)反應，而是并發(fā)癥的惡化。在檢出所述抗體后在將sa237重復施用于這兩名患者中沒有觀察到安全性問題。

(5)結(jié)論

當以2周的間隔三次將120mg的sa237施用于ra患者，并且之后從第8周起以4周的間隔進行三次120mg施用時，從第4周至最后一次施用后四周保持穩(wěn)定的血清藥物濃度。這導致高血清sil-6r濃度和低crp，以及包括das28在內(nèi)的所有效力評估項目的穩(wěn)定改善。整個臨床研究的抗-sa237抗體的發(fā)生率為6.1％(2/33例)，并且在檢出抗-sa237抗體時，發(fā)現(xiàn)在檢出抗-sa237抗體后血清sa237濃度下降，但是沒有觀察到安全性問題并且免疫原性被認為是可接受的。因此，該施用方案中不存在安全性的擔憂。

工業(yè)實用性

本發(fā)明的藥物組合物或方案可以解決抗-藥物抗體產(chǎn)生的免疫原性問題，減小副作用，并且提供在使患者負擔情況更小的情況下呈現(xiàn)更高療效的藥物組合物，因為其不使患者暴露于高劑量。

序列表

<110>中外制藥株式會社

<120>用于治療il-6相關(guān)疾病的組合物

<130>c1-a1503p

<141>2016-02-26

<150>jp2015-037933

<151>2015-02-27

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>119

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<221>peptide

<222>(1)..(119)

<223>人工合成的多肽序列

<400>1

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysalavalserglyhisserileserhisasp

202530

hisalatrpsertrpvalargglnproproglygluglyleuglutrp

354045

ileglypheilesertyrserglyilethrasntyrasnproserleu

505560

glnglyargvalthrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargserleualaargthrthralametasptyrtrpglyglugly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

<210>2

<211>107

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<221>peptide

<222>(1)..(107)

<223>人工合成的多肽序列

<400>2

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspservalthrilethrcysglnalaserthraspileserserhis

202530

leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprogluleuleuile

354045

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505560

serglyserglythraspphethrphethrileserserleugluala

65707580

gluaspalaalathrtyrtyrcysglyglnglyasnargleuprotyr

859095

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100105

<210>3

<211>443

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<221>peptide

<222>(1)..(443)

<223>人工合成的多肽序列

<400>3

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysalavalserglyhisserileserhisasp

202530

hisalatrpsertrpvalargglnproproglygluglyleuglutrp

354045

ileglypheilesertyrserglyilethrasntyrasnproserleu

505560

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65707580

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130135140

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145150155160

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165170175

glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser

180185190

serasnpheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislyspro

195200205

serasnthrlysvalasplysthrvalgluarglyssercysvalglu

210215220

cysproprocysproalaproprovalalaglyproservalpheleu

225230235240

pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu

245250255

valthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalgln

260265270

pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys

275280285

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290295300

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325330335

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420425430

histyrthrglnlysserleuserleuserpro

435440

<210>4

<211>214

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<221>peptide

<222>(1)..(214)

<223>人工合成的多肽序列

<400>4

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspservalthrilethrcysglnalaserthraspileserserhis

202530

leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprogluleuleuile

354045

tyrtyrglyserhisleuleuserglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrphethrileserserleugluala

65707580

gluaspalaalathrtyrtyrcysglyglnglyasnargleuprotyr

859095

thrpheglyglnglythrlysvalgluilegluargthrvalalaala

100105110

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115120125

thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala

130135140

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145150155160

gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser

165170175

serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr

180185190

alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser

195200205

pheasnargglyglucys

210