本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及聚多巴胺包覆的金納米棒材料及其制備方法，以及在構(gòu)建腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療平臺(tái)中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

成像引導(dǎo)是一項(xiàng)發(fā)展迅速的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)和治療技術(shù)，是未來實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的一項(xiàng)重要的手段。在成像引導(dǎo)的腫瘤治療技術(shù)中，光熱治療由于其高效性、微創(chuàng)性以及對(duì)周圍組織低損傷性的優(yōu)勢(shì)，受到了越來越多的關(guān)注。近年來，隨著多種同時(shí)具有光熱轉(zhuǎn)化效率以及高成像靈敏度的多功能納米材料被不斷合成，人們發(fā)展了多種不同的成像引導(dǎo)的腫瘤光熱治療技術(shù)。由于成像和光熱治療需要不同的激光進(jìn)行激發(fā)，所以這些成像引導(dǎo)的腫瘤光熱治療技術(shù)往往需要多種儀器的聯(lián)合使用才能完成，不僅步驟繁瑣，而且降低了腫瘤治療的特異性，限制了其在臨床中的應(yīng)用。

金納米棒在近紅外區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，并且具有良好的光熱轉(zhuǎn)化效率，是光熱治療中常用的一種納米材料。此外，金納米棒還具有很多獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，作為顯影劑廣泛地應(yīng)用于多種模式的腫瘤成像中，例如近紅外光成像、核磁成像、CT成像以及拉曼成像。在這些成像模式中，拉曼成像，特別是表面增強(qiáng)拉曼（SERS）成像，因?yàn)榫哂袠O高的靈敏度、良好的光穩(wěn)定性以及多目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的能力，被認(rèn)為是一種理想的腫瘤成像檢測(cè)手段。值得注意的是，金納米棒在近紅外光的激發(fā)下可以同時(shí)產(chǎn)生光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)以及拉曼增強(qiáng)效應(yīng)。金納米棒在近紅外激發(fā)光下的這種獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)為開發(fā)腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療一體化平臺(tái)提供了可能。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）是金納米棒材料的合成過程中一種常用的模板劑分子。然而，CTAB分子具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，在金納米棒應(yīng)用于生物實(shí)驗(yàn)之前必須去除。聚多巴胺是多巴胺單體分子在堿性條件下自聚合的一種聚合物大分子，具有良好的生物相容性，在生理鹽溶液中具有良好的穩(wěn)定性，其表面的鄰苯二酚集團(tuán)在弱堿性條件下可以轉(zhuǎn)變?yōu)轷?，通過醌基同蛋白末端的氨基或巰基的偶聯(lián)作用，可以將抗體等蛋白分子連接到聚多巴胺表面。在這個(gè)過程中不需要加入任何其他的活化分子，可以最大限度的保持抗體分子的生物活性。

為了實(shí)現(xiàn)腫瘤的特異性檢測(cè)以及有效治療，本發(fā)明設(shè)計(jì)了基于聚多巴胺包覆的金納米棒的腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療一體化平臺(tái)，簡(jiǎn)化了腫瘤檢測(cè)和治療的步驟，提高了腫瘤檢測(cè)和治療的特異性和效果，進(jìn)一步減少了對(duì)健康組織的損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該一體化平臺(tái)具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種聚多巴胺包覆的金納米棒材料及其制備方法，以及在構(gòu)建腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療平臺(tái)中應(yīng)用。

本發(fā)明提出的聚多巴胺包覆的金納米棒的制備方法，具體步驟如下：

（1）金納米種子的合成：在室溫下，將1-10mL氯金酸溶液（0.5-1mM）同1-10mL CTAB溶液（0.2-0.5 M）充分混勻，隨后加入0.5-1mL預(yù)冷的硼氫化鈉溶液（0.01-0.05 M），28-37℃避光反應(yīng)2-5小時(shí)，得到棕色的金納米種子溶液；

（2）金納米棒（長(zhǎng)寬比3-5）的合成：將1-10mL氯金酸溶液（1-2 mM）同1-10mLCTAB溶液（0.2-0.5M）充分混勻，加入0.1-0.5 mL硝酸銀溶液（5-20mM）充分混勻，加入0.05-0.1 mL抗壞血酸溶液（0.1-0.2 M，現(xiàn)用現(xiàn)配）充分混勻，加入0.01-0.02 mL步驟（1）中合成的金納米種子溶液，充分混勻后28-37 ℃反應(yīng)過夜，得到長(zhǎng)寬比為3-5的金納米棒材料，8000-10000rpm離心，用水洗滌2-3遍；

（3）金納米棒表面聚多巴胺包覆：將洗滌后的金納米棒材料重溶于Tris緩沖溶液中（10-20mM，pH8.0-10.0），加入0.01-0.02 mL對(duì)巰基苯硼酸溶液（10-20 mM），震蕩反應(yīng)1-2小時(shí)，隨后加入0.05-0.02mL多巴胺溶液（1-2 mg/mL），28-37℃震蕩反應(yīng)過夜，得到聚多巴胺包覆的金納米棒材料；

（4）抗體的修飾：采用醌基共價(jià)偶聯(lián)的方法將上皮細(xì)胞粘附分子抗體（anti-EpCAM）修飾于金納米棒材料表面，將聚多巴胺包覆的金納米棒材料重溶于PBS緩沖溶液中（0.02-0.05 mMmM），加入0.02-0.05mL抗體溶液，25-37 ℃偶聯(lián)12-20 h，即將抗體修飾到金納米棒材料表面，并用牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行封端，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的特異性標(biāo)記。

本發(fā)明合成的金納米棒材料，聚多巴胺的修飾可以有效地包覆金納米棒表面的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）分子，進(jìn)而提高了金納米棒材料的生物相容性和穩(wěn)定性，該聚多巴胺包覆的金納米棒材料在近紅外激光（785nm）的激發(fā)下，同時(shí)具有良好的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)與光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)，在聚多巴胺表面修飾抗體之后，材料可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的特異性標(biāo)記。

正因?yàn)樯鲜鼋鸺{米棒材料具有特異的性能，所以可用于構(gòu)建腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療平臺(tái)，該平臺(tái)包括：

細(xì)胞培養(yǎng)基，用于孵育細(xì)胞；

抗體修飾的聚多巴胺包覆的金納米棒溶液，用于在近紅外激光（785nm）的激發(fā)下，表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)與光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)，并用作腫瘤靶細(xì)胞特異性標(biāo)記；

拉曼顯微鏡載物臺(tái)，用于放置細(xì)胞培養(yǎng)器皿；

裝備有近紅外激光（785nm）的拉曼成像顯微鏡，其中，拉曼成像顯微鏡用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速拉曼掃描，并利用對(duì)巰基苯硼酸的特征拉曼信號(hào)峰（1080cm^-1）的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行成像，成像結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞的位置；近紅外激光（785nm）用于照射腫瘤細(xì)胞，利用金納米棒的光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)使材料升溫，壞死腫瘤細(xì)胞。

上述構(gòu)建的腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療平臺(tái)，具體使用方法如下：

（1）材料與細(xì)胞孵育：首先在玻底培養(yǎng)皿中加入10⁵-10⁶/mL的細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。取10-30 μL抗體修飾的聚多巴胺包覆的金納米棒溶液，加入培養(yǎng)皿中，37℃條件下輕微震蕩孵育1-2 h, 棄去上層培養(yǎng)基，用PBS洗滌三次后，并加入100 -200uL的PBS；

（2）腫瘤拉曼成像：將玻底培養(yǎng)皿放置于拉曼顯微鏡載物臺(tái)上，調(diào)整焦距使細(xì)胞可以清晰的顯現(xiàn)在視野中，選擇合適的激發(fā)光（785nm）并調(diào)整相應(yīng)的測(cè)試參數(shù)，利用拉曼顯微鏡點(diǎn)掃描的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速拉曼掃描，利用對(duì)巰基苯硼酸的特征拉曼信號(hào)峰（1080cm^-1）的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行成像，成像結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞的位置；

（3）光熱殺傷：根據(jù)拉曼成像結(jié)果，將激光定點(diǎn)到腫瘤細(xì)胞表面（1-2分鐘/每個(gè)細(xì)胞），延長(zhǎng)對(duì)靶細(xì)胞的激光照射時(shí)間（4-5分鐘/每個(gè)細(xì)胞），利用金納米棒的光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)使材料升溫，進(jìn)而引起細(xì)胞壞死，達(dá)到腫瘤細(xì)胞光熱殺傷的效果。

本發(fā)明提供的基于聚多巴胺包覆的金納米棒的腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療一體化平臺(tái)，利用近紅外激光（785nm）作為激發(fā)光，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行快速的點(diǎn)掃描（1-2分鐘每個(gè)細(xì)胞），通過拉曼成像圖可以快速準(zhǔn)確地辨別出腫瘤細(xì)胞的具體位置。隨后，利用近紅外激光（785nm）定點(diǎn)照射腫瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)照射時(shí)間（4-5分鐘每個(gè)細(xì)胞），通過金納米棒的光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的實(shí)時(shí)光熱殺傷。由于金納米棒的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)和光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)都可以在近紅外激光（785nm）的激發(fā)下產(chǎn)生，因此只需要一臺(tái)裝備有近紅外激光（785nm）的拉曼成像顯微鏡，根據(jù)拉曼成像結(jié)果可以準(zhǔn)確辨別出腫瘤靶細(xì)胞，隨后僅需要延長(zhǎng)激發(fā)光對(duì)腫瘤細(xì)胞的照射時(shí)間，便可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的光熱殺傷。

本發(fā)明的主要優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)便高效，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性檢測(cè)以及實(shí)時(shí)光熱治療，避免了因腫瘤檢測(cè)和治療儀器不同而導(dǎo)致的繁瑣步驟，進(jìn)一步減少對(duì)健康細(xì)胞的損傷，可以提高腫瘤細(xì)胞治療的有效性和特異性。

附圖說明

圖1聚多巴胺包覆的金納米棒透射電鏡圖。其中，A為低倍鏡下金納米棒電鏡圖；B為高倍鏡下金納米棒電鏡圖；C為低倍鏡下聚多巴胺包覆的金納米棒電鏡圖；D為高倍鏡下聚多巴胺包覆的金納米棒電鏡圖。

圖2聚多巴胺包覆的金納米棒材料在紅外激發(fā)照射下的升溫曲線圖。

圖3金納米棒與聚多巴胺包覆的金納米棒材料的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)對(duì)比。

圖4金納米棒與聚多巴胺包覆的金納米棒材料生物相容性對(duì)比。

圖5金納米棒與聚多巴胺包覆的金納米棒材料在PBS溶液中的穩(wěn)定性對(duì)比。

圖6聚多巴胺包覆的金納米棒材料對(duì)前列腺癌靶細(xì)胞（DU145）以及對(duì)照細(xì)胞（U251）的標(biāo)記以及拉曼成像。其中，A為明場(chǎng)顯微鏡下DU145細(xì)胞；B為DU145細(xì)胞的拉曼成像圖；C為明場(chǎng)顯微鏡下U251細(xì)胞；D為U251細(xì)胞的拉曼成像圖。

圖7聚多巴胺包覆的金納米棒材料對(duì)前列腺腫瘤組織的標(biāo)記以及拉曼成像。其中，A左側(cè)為未經(jīng)HE染色的腫瘤組織切片，其中虛線方框部分為拉曼成像掃描的區(qū)域，右側(cè)為拉曼成像圖；B為HE染色后的腫瘤組織切片，其中虛線方框部分為拉曼成像掃描的區(qū)域，右側(cè)為拉曼成像區(qū)域的HE染色圖像。

圖8聚多巴胺包覆的金納米棒材料對(duì)前列腺癌靶細(xì)胞（DU145）以及對(duì)照細(xì)胞（U251）的光熱殺傷結(jié)果。

圖9聚多巴胺包覆的金納米棒材料對(duì)前列腺癌靶細(xì)胞（DU145）的標(biāo)記、拉曼成像以及光熱殺傷。其中，A為拉曼掃描前的DU145細(xì)胞明場(chǎng)圖；B為DU145細(xì)胞的拉曼成像圖；C為臺(tái)盼藍(lán)染料對(duì)成像后DU145細(xì)胞進(jìn)行染色的結(jié)果；D為臺(tái)盼藍(lán)染料對(duì)長(zhǎng)時(shí)間激發(fā)光照射后的DU145細(xì)胞進(jìn)行染色的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：抗體修飾的聚多巴胺包覆的金納米棒材料合成

在室溫下，將5mL氯金酸溶液（0.5 mM）同5mLCTAB溶液（0.2 M）充分混勻，隨后加入0.6mL預(yù)冷的硼氫化鈉溶液（0.01 M），28℃避光反應(yīng)2小時(shí)，得到棕色的金納米種子溶液。將5mL氯金酸溶液（1 mM）同5mLCTAB溶液（0.2 M）充分混勻，加入0.12mL硝酸銀溶液（10mM）充分混勻，加入0.055mL抗壞血酸溶液（0.1M，現(xiàn)用現(xiàn)配）充分混勻，加入0.012mL步驟（1）中合成的金納米種子溶液，充分混勻后28℃反應(yīng)過夜，得到長(zhǎng)寬比為3.8的金納米棒材料，8000rpm離心，用水洗滌兩遍。將洗滌后的金納米棒材料重溶于Tris緩沖溶液中（10mM，pH8.0），加入0.01mL對(duì)巰基苯硼酸溶液（10mM），震蕩反應(yīng)1小時(shí)，隨后加入0.05-0.02mL多巴胺溶液（1mg/mL），37℃震蕩反應(yīng)過夜，得到聚多巴胺包覆的金納米棒材料。采用醌基共價(jià)偶聯(lián)的方法將上皮細(xì)胞粘附分子抗體（anti-EpCAM）修飾于金納米棒材料表面，將聚多巴胺包覆的金納米棒材料重溶于PBS緩沖溶液中（0.02mM），加入0.02mL抗體溶液，25-37 ℃偶聯(lián)12-20 h后即可將抗體修飾到金納米棒材料表面，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的特異性標(biāo)記。

實(shí)施例2：基于聚多巴胺包覆的金納米棒的腫瘤細(xì)胞拉曼成像檢測(cè)與實(shí)時(shí)光熱治療一體化平臺(tái)在前列腺癌細(xì)胞（DU145）拉曼成像和光熱治療中的應(yīng)用。

首先在玻底培養(yǎng)皿中加入約10⁵/mL的細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。取10-30 μL抗體修飾的聚多巴胺包覆的金納米棒溶液，加入培養(yǎng)皿中，37℃條件下輕微震蕩孵育1-2 h, 棄去上層培養(yǎng)基，用PBS洗滌三次后，并加入100 uL的PBS。

將玻底培養(yǎng)皿放置于拉曼顯微鏡載物臺(tái)上，調(diào)整焦距使細(xì)胞可以清晰的顯現(xiàn)在視野中，選擇合適的激發(fā)光（785nm）并調(diào)整相應(yīng)的測(cè)試參數(shù)，利用拉曼顯微鏡點(diǎn)掃描的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速拉曼掃描，利用對(duì)巰基苯硼酸的特征拉曼信號(hào)峰（1080cm^-1）的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行成像，成像結(jié)果顯示了腫瘤細(xì)胞的位置。

根據(jù)拉曼成像結(jié)果，將激發(fā)光定點(diǎn)到腫瘤細(xì)胞表面，延長(zhǎng)對(duì)靶細(xì)胞的激光照射時(shí)間，利用金納米棒的光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)使材料升溫，進(jìn)而引起細(xì)胞壞死，達(dá)到腫瘤細(xì)胞光熱殺傷的效果。