本發(fā)明涉及一種miR-135b抑制劑在治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

骨肉瘤是致殘率和致死率較高的、主要發(fā)生在10-25歲年齡段的原發(fā)性惡性骨腫瘤。上世紀(jì)80年代初，骨肉瘤患者的5年生存率已達(dá)到60％-70％，但近30年沒有得到進(jìn)一步提升。導(dǎo)致骨肉瘤治療失敗的主要原因是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。據(jù)報告，骨肉瘤患者一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)其生存率僅為20-30％。肺轉(zhuǎn)移是骨肉瘤轉(zhuǎn)移的主要方式。在初診患者中有20％的患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中90％為肺轉(zhuǎn)移；接受正規(guī)治療的患者中有50％的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中80％為肺轉(zhuǎn)移型復(fù)發(fā)，提示解決骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)可以進(jìn)一步提高骨肉瘤患者的5年生存率。但目前還沒有方法可以有效的治療骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有了更深入的了解，并依據(jù)腫瘤發(fā)生發(fā)展中涉及的異常分子和基因，設(shè)計和研制針對特定分子和基因靶點的藥物，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，這種方法叫腫瘤分子靶向治療。今年來，腫瘤分子靶向治療已經(jīng)成為腫瘤治療的發(fā)展方向，腫瘤分子靶向藥物的研究和臨床應(yīng)用使腫瘤治療水平提高到一個新的高度。

腫瘤干細(xì)胞是指腫瘤中具有自我更新能力并產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞群，導(dǎo)致腫瘤的耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，是腫瘤靶向治療的一個重要靶點。腫瘤干細(xì)胞由很多因素來調(diào)控；miRNA是其中一個調(diào)控因素。miRNA是指由19-22個核苷酸組成的、非編碼蛋白的RNA，通過對目標(biāo)基因信使RNA的降解和翻譯抑制對細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、死亡等生物過程起著重要的作用。研究表明，人類基因中有1/3的基因直接收到miRNA的調(diào)控，更重要的是最近研究表明包括骨肉瘤在內(nèi)的大部分腫瘤中存在miRNA的異常表達(dá)，而且異常表達(dá)的miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和患者的預(yù)后密切相關(guān)。更重要的是靶向此類異常表達(dá)的miRNA可以有效的抑制腫瘤的進(jìn)展。

miR-135b是一種已知道的微小RNA，其相關(guān)基本信息為：Accession No：MIMAT0000758，基本序列為5`-UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA-3`。已有研究報告表明miR-135b在前列腺癌，肺癌，直腸癌，肝癌和骨肉瘤中異常表達(dá)，且起促癌的作用。然而，其對骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中的影響還未見報道。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)miR-135b可以作為治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的靶點，miR-135b的抑制劑可用于治療骨肉瘤。

已有大量實體瘤相關(guān)研究顯示，腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間在組織特點、蛋白質(zhì)組表達(dá)、細(xì)胞生物學(xué)行為等多個方面存在較多區(qū)別。利用免疫組化和基因測序技術(shù)對骨肉瘤患者原發(fā)病灶組織與轉(zhuǎn)移灶組織進(jìn)行檢測對比，分析發(fā)現(xiàn)，患者原發(fā)病灶與骨轉(zhuǎn)移病灶之間的生物學(xué)信息以及基因表達(dá)具有相似性。但部分轉(zhuǎn)移灶，特別是肺轉(zhuǎn)移灶在組織學(xué)和基因表達(dá)上與原發(fā)病灶具有較大差異。因此在治療時，極有可能出現(xiàn)對原發(fā)病灶有效，而轉(zhuǎn)移病灶無效的情況，反之亦然。在JAFFE等的研究中以阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺(ADM，DDP，MTX，IFO)為主大劑量化療對骨肉瘤原發(fā)疾病取得了74％的5年生存率，但在轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者中明顯療效更低。這也從側(cè)面證明了對原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的治療需要進(jìn)一步的區(qū)分、細(xì)化，才能獲得最佳效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決目前骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)治療困難的問題，提供了一種miR-135b抑制劑在治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的藥物中的用途，所述用途以促進(jìn)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的miR-135b作為治療靶點，利用miR-135b的抑制劑來治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其中miR-135b抑制劑包括miR-135b的antisense或antagomiR或表達(dá)miR-135b antisense的質(zhì)粒。miRNA antagomiR是經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的miRNA抑制劑，與普通的miRNA抑制劑(antisense)相比，antagomiR在動物體內(nèi)具有更高的穩(wěn)定性，其作用時間可長達(dá)數(shù)周。

本發(fā)明利用轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸鏈和miR-135b antisense的骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞建立了負(fù)瘤動物模型，并觀察了miR-135b抑制劑對腫瘤干細(xì)胞致瘤的影響。實驗結(jié)果表明miR-135b抑制劑可以有效抑制腫瘤干細(xì)胞的腫瘤形成。

本發(fā)明還利用具有強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力的骨肉瘤細(xì)胞系建立了低表達(dá)miR-135b的穩(wěn)定細(xì)胞系，并利用此細(xì)胞株建立了骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型。通過尾靜脈注射建立骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型4周以后，將小鼠處死，取出肺觀察了肺表面形成的腫瘤，并通過制作石蠟切片和H&E染色在顯微鏡下評估了骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移程度。實驗結(jié)果表明miR-135b的抑制可以顯著的抑制骨肉瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。

此外，本發(fā)明還利用骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞建立了負(fù)瘤模型，并腹腔注射的方式處理了順鉑和對照antagomiR或miR-135b antagomiR。18天以后停止藥物處理，并繼續(xù)觀察了腫瘤大小的變化。實驗結(jié)果顯示，停藥后經(jīng)過一定時間后順鉑和對照組antagomiR的處理組腫瘤從新開始生長(復(fù)發(fā))，但在順鉑和miR-135b antagomiR處理組并沒有發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象。

本發(fā)明還涉及miR135b抑制劑在制備治療骨肉瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的藥物中的用途，所述的miR-135b抑制劑包括單鏈RNA和表達(dá)此單鏈RNA的質(zhì)粒，單鏈RNA的具體序列為5`-UCACAUAGGAAUGAAAAGCCAUA-3`，所述RNA可以是經(jīng)過修飾的RNA。

其中所述藥物除包含miR-135b抑制劑，還可以包含藥物學(xué)上常見的藥物載體，其中所述載體是注射溶媒、等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、保護(hù)劑等。

所述藥物可以制備成常見的劑型，例如注射劑、顆粒劑、片劑、膠囊、氣霧劑等，所述注射劑可以是溶液型、混選型、或乳劑型，可以通過皮下注射、肌肉注射、靜脈注射或靜脈滴注的方式給藥。

注射溶媒選自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、聚乙二醇等；所述等滲調(diào)節(jié)劑選自氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、碳酸氫鈉、乳酸鈉、甘油等，氯化鈉濃度范圍一般為0.5-0.9％，葡萄糖濃度范圍一般為4-5％，甘油濃度范圍一般為2.25％左右；所述的pH調(diào)節(jié)劑選自乳酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉等，乳酸的濃度范圍一般為0.1％左右，檸檬酸的濃度一般為0.5％左右，磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉的濃度一般為1.7％和0.71％左右，碳酸鈉、碳酸氫鈉的濃度一般為0.06％和0.005％左右；所述穩(wěn)定劑選自肌酐、甘氨酸、肌酐的濃度一般為0.5-0.8％，甘氨酸的濃度一般為1.5-2.25％；所述保護(hù)劑選自乳糖、蔗糖、麥芽糖、人血白蛋白，乳糖的濃度一般為2-5％，蔗糖的濃度一般為2-5％，麥芽糖的濃度一般為2-5％，人血白蛋白濃度一般為0.2-2％。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖所作的對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1.把轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸鏈和miR-135b抑制劑(miR-135b antisense)的骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞接種到裸鼠背部皮下以后，觀察其是否成瘤。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸鏈的腫瘤干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成了腫瘤，但轉(zhuǎn)染miR-135bantisense的腫瘤干細(xì)胞沒有形成腫瘤。

圖2.通過尾靜脈注射的方式利用穩(wěn)定表達(dá)miR-135bantisense的骨肉瘤細(xì)胞及其對照組細(xì)胞建立骨肉瘤肺癌轉(zhuǎn)移模型。注射細(xì)胞4周以后，處死實驗動物取肺，觀察肺表面形成的腫瘤。其中，圖2A顯示骨肉瘤細(xì)胞中的miR-135b表達(dá)。圖2B顯示，抑制miR-135b可以明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。

圖3.從骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移動物模型中取出肺，進(jìn)行固定，H&E染色，可見處理抑制miR-135b可以明顯抑制骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。

圖4.利用腫瘤干細(xì)胞建立骨肉瘤的裸鼠負(fù)瘤模型，并通過腹腔注射的方式處理了磷酸緩沖鹽溶液(untreated)或順鉑和陰性對照antogomiR(CDDP)或順鉑和miR-135b antagomiR(CDDP-miR-135b-in)。18天以后，停止藥物處理并觀察了24天。結(jié)果顯示，磷酸緩沖鹽溶液處理組的腫瘤在整個實驗期內(nèi)處于生長狀態(tài)；順鉑加miR-135b antagomiR處理組的腫瘤生長在藥物處理期內(nèi)處于負(fù)生長狀態(tài)、在停藥后處于停止生長狀態(tài)；順鉑加對照antagomiR的處理組的腫瘤在停藥12天以后開始從新生長。

圖5.從裸鼠負(fù)荷瘤模型中取出腫瘤以后，為了觀察抑制miR-135b對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，利用Ki67抗體進(jìn)行了免疫組化。結(jié)果顯示，抑制miR-135b可以明顯抑制腫瘤的增殖。

附圖中相同或相似的附圖標(biāo)記代表相同或相似的部件。

具體實施方式

下文的公開提供了許多不同的實施例或例子用來實現(xiàn)本發(fā)明的不同結(jié)構(gòu)。為了簡化本發(fā)明的公開，下文中對特定例子的部件和設(shè)置進(jìn)行描述。此外，本發(fā)明可以在不同例子中重復(fù)參考數(shù)字和/或字母。這種重復(fù)是為了簡化和清楚的目的，其本身不指示所討論各種實施例和/或設(shè)置之間的關(guān)系。應(yīng)當(dāng)注意，在附圖中所圖示的部件不一定按比例繪制。本發(fā)明省略了對公知組件和處理技術(shù)及工藝的描述以避免不必要地限制本發(fā)明。

實施例1：miR-135b antisense的處理顯著抑制骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞在動物中的腫瘤形成

(1)利用腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD133的抗體，通過流式的方法從骨肉瘤細(xì)胞Saos-2中篩選CD133高表達(dá)的腫瘤干細(xì)胞。

(2)上述篩選的CD133高表達(dá)的腫瘤干細(xì)胞分為兩個組，其中一組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸鏈(對照組)；另一組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-135b antisense(處理組)。

(3)轉(zhuǎn)染12小時以后，把被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到5只6周齡的母裸鼠背部皮下(1×10⁵個細(xì)胞/只小鼠)。對照細(xì)胞接種到裸鼠的背部右側(cè)；處理組細(xì)胞接種到裸鼠背部的左側(cè)，并觀察了2個月。接種細(xì)胞兩個月以后發(fā)現(xiàn)對照組(右側(cè))全部形成了腫瘤，但轉(zhuǎn)染miR-135b antisense的細(xì)胞沒有形成腫瘤(左側(cè))(圖1)。

實施例2：miR-135b antisense顯著抑制骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移

(1)為了構(gòu)建骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移動物模型首先建立了低表達(dá)miR-135b的穩(wěn)定骨肉瘤細(xì)胞系。

在六孔板中以1×10⁶細(xì)胞/孔的密度接種LM5骨肉瘤細(xì)胞。細(xì)胞鋪板第二天，把表達(dá)miR-135b antisense的質(zhì)粒或表達(dá)非特異性核苷酸單鏈的對照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時以后開始穩(wěn)定細(xì)胞的篩選。細(xì)胞用2ug/ml嘌呤霉素每三天處理一次，共處理3次。篩選第十二天，收部分細(xì)胞，提RNA檢測miR-135b的表達(dá)量。確定miR-135b低表達(dá)以后(圖2A)，利用此系穩(wěn)定細(xì)胞建立骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移動物模型。

(2)建立骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型。將4×10⁵個低表達(dá)miR-135b的LM5骨肉瘤穩(wěn)定細(xì)胞系及其對照組細(xì)胞通過尾靜脈注射到6周玲母裸鼠體內(nèi)(8只裸鼠/組)；4周以后把裸鼠處死，取肺，在顯微鏡下數(shù)肺表面形成的腫瘤數(shù)，并固定、切片、H&E染色。結(jié)果顯示，抑制miR-135b顯著的減少了骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移(圖2B和圖3)。

實施例3：miR-135b antagomiR顯著抑制腫瘤干細(xì)胞引起的骨肉瘤復(fù)發(fā)。建立裸鼠負(fù)荷瘤模型：利用腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD133的抗體通過流式的方法從Saos-2骨肉瘤細(xì)胞中選出CD133高表達(dá)的腫瘤干細(xì)胞，并把此細(xì)胞接種到18只6周齡母裸鼠背部皮下(1×10⁵個細(xì)胞/只小鼠)。兩周以后按照腫瘤大小把裸鼠分為三個處理組，并通過腹腔注射的方法處理藥物。第一組注射了磷酸緩沖鹽溶液(100ul)(untreated)；第二組動物注射了順鉑(5mg/Kg體重)和10uM陰性對照核苷酸鏈(CDDP)；處理組動物注射了順鉑和10uM miR-135b antagomiR(CDDP-miR-135b-in)。藥物處理每三天一次，共處理了6次；腫瘤大小每三天測量一次。藥物處理結(jié)束以后再觀察了24天。實驗結(jié)果顯示，藥物處理結(jié)束12天后，處理對照核苷酸鏈和順鉑的對照組動物的腫瘤開始重新生長，但處理miR-135bantagomiR和順鉑的處理組動物的腫瘤仍處于停止生長狀態(tài)(圖4)。近一步，細(xì)胞增殖標(biāo)志物蛋白Ki67的免疫組化結(jié)果顯示miR-135antagomiR處理顯著的抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖(圖5)。免疫組化的具體方法如下：

免疫組化：藥物處理4次以后，從每個處理組選3只動物處死，取出腫瘤組織用多聚甲醛固定做石蠟切片、免疫組化。(將石蠟切片放于60℃的烘烤箱中烘烤2-3個小時；二甲苯浸泡10分鐘；二甲苯浸泡10分鐘；二甲苯浸泡10分鐘；90％乙醇浸泡10分鐘；80％乙醇浸泡10分鐘；自來水洗2分鐘；蒸餾水洗1分鐘；3％的H₂O₂中孵育10分鐘；PBS清洗2次，5分鐘/次；擦干玻片，滴加一抗，于4℃冰箱過夜；第二天取出，PBS清洗2次，5分鐘/次；滴加二抗，37℃孵育25-30分鐘；PBS清洗2次，5分鐘/次；滴加DAB顯色；充分水洗，終止顯色；蘇木素顯色液體中浸泡1分鐘，并沖洗；鹽酸酒精沖洗；飽和碳酸鋰沖洗；95％酒精1分鐘；無水酒精1分鐘；無水酒精2分鐘；取出片子吹干；滴加封片油封片。

雖然關(guān)于示例實施例及其優(yōu)點已經(jīng)詳細(xì)說明，應(yīng)當(dāng)理解在不脫離本發(fā)明的精神和所附權(quán)利要求限定的保護(hù)范圍的情況下，可以對這些實施例進(jìn)行各種變化、替換和修改。對于其他例子，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易理解在保持本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)的同時，工藝步驟的次序可以變化。

此外，本發(fā)明的應(yīng)用范圍不局限于說明書中描述的特定實施例的工藝、機(jī)構(gòu)、制造、物質(zhì)組成、手段、方法及步驟。從本發(fā)明的公開內(nèi)容，作為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地理解，對于目前已存在或者以后即將開發(fā)出的工藝、機(jī)構(gòu)、制造、物質(zhì)組成、手段、方法或步驟，其中它們執(zhí)行與本發(fā)明描述的對應(yīng)實施例大體相同的功能或者獲得大體相同的結(jié)果，依照本發(fā)明可以對它們進(jìn)行應(yīng)用。因此，本發(fā)明所附權(quán)利要求旨在將這些工藝、機(jī)構(gòu)、制造、物質(zhì)組成、手段、方法或步驟包含在其保護(hù)范圍內(nèi)。