本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤活性和核酸遞送功能的陽離子化香菇多糖制備方法及其作為基因載體的同時(shí)發(fā)揮免疫學(xué)活性的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤是威脅人類健康和生命的常見疾病之一，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，國際癌癥研究中心預(yù)測未來20年全球新增腫瘤病例會(huì)上升到每年2200萬，腫瘤患者死亡病例將上升到每年1300萬(IARC Science Public Lyon, 2014, 1: 1365)。腫瘤已成為全世界關(guān)注的極其重要的公共衛(wèi)生疾病。目前，臨床用于腫瘤治療的大部分化療藥物，主要通過抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長發(fā)揮其作用，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常細(xì)胞，其昂貴的醫(yī)療費(fèi)用和較大的毒副作用嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為患者及學(xué)者所面臨的共同難題，因而人們一直尋找最優(yōu)化的腫瘤治療方法。

中藥在腫瘤治療方面日益顯現(xiàn)出很大的優(yōu)勢，已成為我國腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色。多糖是中藥研究最深入、最廣泛的抗腫瘤活性成分之一，更是中藥抗腫瘤生理作用的主要物質(zhì)之一，被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑”。與直接殺傷腫瘤細(xì)胞的化療藥物不同，中藥多糖除了具有直接抑制腫瘤細(xì)胞作用之外，更重要是通過其免疫調(diào)節(jié)作用刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活多種免疫細(xì)胞，提高宿主對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性抗原免疫反應(yīng)能力，這也是防治腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的重要條件。趙國華等(藥學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 38: 37)報(bào)道，山藥多糖對(duì)Lewis 肺癌和B16黑色素瘤有最佳的抑制作用。李小定等(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 21: 261)實(shí)驗(yàn)證明，灰樹花多糖既可直接殺傷癌細(xì)胞又可提高機(jī)體的免疫力。謝遵江等(解剖學(xué)報(bào), 2002, 33: 538)發(fā)現(xiàn)人參多糖本身或誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子能增強(qiáng)IL-2對(duì)NK 細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的刺激作用，對(duì)腫瘤有極強(qiáng)的殺傷和抑制作用。中藥抗腫瘤機(jī)制的研究為治療腫瘤提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也開辟了新途徑。

香菇多糖(Lentinan，LNT)是從傳統(tǒng)藥食同源的香菇中分離、提取得到的藥用活性成分。1969年Chihara 等率先從香菇中提取出抗腫瘤活性的多糖，活性成分是它分支結(jié)構(gòu)中的β-(1→3)-D-葡聚糖，它主鏈的葡萄糖基通過β-(1→3)糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈的葡萄糖基由分布的β-(1→6)糖苷鍵連接形成，分子結(jié)構(gòu)中含有大量活性基團(tuán)-OH。臨床上，將香菇多糖與化療藥物聯(lián)用可用于不能手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)性腫瘤的輔助治療(Carbohydrate Polymers, 2012, 88: 966-972)。例如，其與紫杉醇聯(lián)用可激活NLRP3炎性體和ASK1/p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡(Critical Reviews In Food Science and nutrition, 2015, 10: 132)。香菇多糖/S-1聯(lián)合治療胃癌患者，結(jié)果原發(fā)灶明顯縮小，且腹部CT未檢測到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Carbohydrate Polymers, 2016, 137: 52)。研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖本身對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有直接抑制作用，而是激活T細(xì)胞，促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化因子的產(chǎn)生，釋放各種輔助性T細(xì)胞因子，增強(qiáng)宿主腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率，最終達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的。

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展都與基因直接或間接相關(guān)，從基因水平治療腫瘤能夠直接糾正和修復(fù)與腫瘤發(fā)病有關(guān)的基因，有效達(dá)到治療腫瘤的目的。而基因治療腫瘤的成功與否在很大程度上取決于安全、高效的基因傳遞載體。以多糖為骨架，經(jīng)聚乙烯亞胺等改性得到的納米載體不僅具有生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也能高效壓縮核酸并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞(Advanced Drug Delivery Reviews, 2013, 65: 1123-1147)。因此，多糖類納米載體已成為目前基因傳遞載體的研究熱點(diǎn)之一(鄭州大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 4: 457-460)。香菇多糖分子結(jié)構(gòu)中含有大量活性基團(tuán)，通過對(duì)其進(jìn)行陽離子化修飾可實(shí)現(xiàn)基因遞送的功能，并且保留了香菇多糖的生物活性，但是至今未見到有關(guān)陽離子化香菇多糖作為基因傳遞載體的同時(shí)又發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的公開報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種陽離子化香菇多糖的制備方法，可作為基因載體遞送系統(tǒng)并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，有效解決腫瘤治療中的應(yīng)用問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，通過pH敏感型化學(xué)鍵將香菇多糖與低分子量的聚乙烯亞胺連接，香菇多糖分子量為20-800kD，聚乙烯亞胺分子量為600-1200D，聚乙烯亞胺與香菇多糖的摩爾比為1:3-10。具體制備方法是：

1）將50-150mg香菇多糖溶解于8-10ml去離子水或二甲基亞砜中，在23-27℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下與100-450mg活化試劑A避光反應(yīng)4-48h，將反應(yīng)液透析2-3d，或者在50℃與100-450mg活化試劑B反應(yīng)4-24h，得活化的香菇多糖；所述的活化試劑A為高碘酸鉀、乙二胺、含有3-5%乙二胺的磷酸鹽緩沖液、羰基二咪唑、三乙胺的一種或兩種以上，活化試劑B為馬來酸酐、琥珀酸酐、4-二甲胺基吡啶、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、 N-羥基琥珀酰亞胺的一種或兩種以上；

2）將100-300mg聚乙烯亞胺溶于2-6ml體積濃度為3.7% 的鹽酸或二甲基亞砜中，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下接枝到活化的香菇多糖上，或者直接將100-300mg聚乙烯亞胺接枝到活化的香菇多糖上，在23-27℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)24-72h，于超純水中透析2-3d，冷凍干燥，得聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。

本發(fā)明的制備工藝簡便，原料來源較為廣泛，成本低廉，極具開發(fā)和應(yīng)用前景，制備得到的陽離子化香菇多糖形態(tài)均一，粒徑在200 nm左右，分布均勻，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物相容性良好，能夠高效負(fù)載核酸并遞送至腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因治療與免疫治療聯(lián)合的抗腫瘤作用。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，所使用實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)公司購買。

實(shí)施例1

本發(fā)明在具體實(shí)施中，該陽離子化香菇多糖可以是，1）將100 mg香菇多糖溶于10 mL去離子水中，邊攪拌邊加入150mg高碘酸鉀，在25℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下避光反應(yīng)48h，再滴入含有200μL乙二胺的5mL磷酸鹽緩沖液，于1h內(nèi)滴加完畢，氮?dú)獗Ｗo(hù)下避光攪拌36 h，將反應(yīng)液于超純水中透析3d，得活化的香菇多糖反應(yīng)液；

2）再向活化的香菇多糖反應(yīng)液中逐滴加入含有250mg聚乙烯亞胺的2mL體積濃度為3.7%的鹽酸，在25℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光攪拌72 h，于超純水中透析2d，冷凍干燥，得聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。

實(shí)施例2

本發(fā)明在具體實(shí)施中，該陽離子香菇多糖還可以是，1）將100mg香菇多糖溶于8mL二甲基亞砜中，然后加入30mg羰基二咪唑和100μL三乙胺，在26℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下避光攪拌4h，得活化的香菇多糖反應(yīng)液；

2）再向活化的香菇多糖反應(yīng)液中逐滴加入含有100mg聚乙烯亞胺的6mL二甲基亞砜（DMSO）溶液，在23℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光攪拌24h，于超純水中透析2d，冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。

實(shí)施例3

本發(fā)明在具體實(shí)施中，該陽離子香菇多糖還可以是，1）將100 mg香菇多糖溶于10 mL二甲基亞砜中，依次加入10mg 4-二甲胺基吡啶和400mg馬來酸酐，50℃下攪拌24h，再依次加入10mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和5mg N-羥基琥珀酰亞胺攪拌反應(yīng)4h，得活化的香菇多糖反應(yīng)液；

2）再向活化的香菇多糖反應(yīng)液中加入300mg聚乙烯亞胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光攪拌48h，于超純水中透析2d，冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。

實(shí)施例4

本發(fā)明在具體實(shí)施中，該陽離子化香菇多糖還可以是，1）將100 mg香菇多糖溶于10mL二甲亞砜中，依次加入10mg 4-二甲胺基吡啶和400mg琥珀酸酐，50℃下攪拌24h，再依次加入10mg l-乙基(3一二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和50mgN-羥基琥珀酸亞胺攪拌反應(yīng)4h，得活化的香菇多糖反應(yīng)液；

2）再向活化的香菇多糖反應(yīng)液中加入300mg聚乙烯亞胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光攪拌48h，將反應(yīng)液于超純水中透析3d，冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。

本發(fā)明制備的陽離子化香菇多糖經(jīng)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，均能取得較好的結(jié)果，達(dá)到滿意的技術(shù)效果，有關(guān)試驗(yàn)資料如下：

實(shí)驗(yàn)一：將不同質(zhì)量的陽離子化香菇多糖溶于20μL去離子水中，加入2μg質(zhì)粒eGFP，室溫孵育30 min，進(jìn)行0.7 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)加入陽離子化香菇多糖與質(zhì)粒eGFP質(zhì)量比為16:1時(shí)，質(zhì)粒eGFP條帶完全滯留在孔道中，這說明當(dāng)陽離子香菇多糖可以完全負(fù)載核酸。將不同質(zhì)量比的陽離子化香菇多糖與質(zhì)粒eGFP復(fù)合物進(jìn)行粒徑和電位的檢測，隨著香菇多糖比例增加，復(fù)合粒徑會(huì)逐漸變小，說明質(zhì)粒eGFP已完全被多糖結(jié)合并形成致密的復(fù)合物。當(dāng)質(zhì)量比增加電位則繼續(xù)增大，到一定值時(shí)電位在0左右，說明當(dāng)陽離子香菇多糖通過正負(fù)電荷相互作用完全負(fù)載核酸，這與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果相符。

實(shí)驗(yàn)二：肝癌細(xì)胞HepG2在含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基和37 ℃、5% CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)。按照1.5×10⁵個(gè)/孔接種于6孔板培養(yǎng)16 h，將FAM標(biāo)記的小干擾RNA(siPD-L1)加入培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染4 h后，流式細(xì)胞儀測定攝取量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽離子香菇多糖負(fù)載siPD-L1的攝取量為96.2%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽離子香菇多糖能夠?qū)⒑怂徇f送至細(xì)胞內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)三：乳腺癌細(xì)胞MCF-7在含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基和37 ℃、5% CO₂條件下常規(guī)培養(yǎng)，按照5×10³個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng)16 h，將不同質(zhì)量的陽離子香菇多糖加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后用四甲基偶氮哩鹽比色法測定細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0-640 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著陽離子香菇多糖含量的增加，細(xì)胞存活率略有增加，試驗(yàn)結(jié)果表明陽離子香菇多糖具有良好的生物相容性。

實(shí)驗(yàn)四：取雌性的昆明小鼠15只，每組5只隨機(jī)分三組：空白對(duì)照組(NC)、香菇多糖組(LNT)、陽離子化香菇多糖組(LNT-PEI)，分別通過尾靜脈注射生理鹽水、香菇多糖溶液（給藥量為12 mg/kg）、陽離子化香菇多糖溶液（給藥量為12 mg/kg）。每2 d給藥一次，共給藥7次。實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠生活狀態(tài)，檢測小鼠體重變化。最后一次給藥結(jié)束后的第二天處死小鼠，取各組小鼠臟器，以及腹腔巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤活性考察。結(jié)果顯示，與NC組相比，LNT組和LNT-PEI組小鼠的體重變化和臟器指數(shù)均沒有明顯差異。體外抗腫瘤活性考察結(jié)果顯示，LNT組和LNT-PEI組脾細(xì)胞抑制率分別為20.74%、25.57%，巨噬細(xì)胞細(xì)胞抑制率分別為10.17%、18.12%。RT-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比LNT組和LNT-PEI組的脾臟、胸腺的IL-2、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達(dá)量均有所增加。說明陽離子化香菇多糖保持了香菇多糖自身的免疫學(xué)活性，在體內(nèi)仍可以發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用。

在上述實(shí)驗(yàn)中，所用到的細(xì)胞株，質(zhì)粒，小干擾RNA為：

1、細(xì)胞株：肝癌細(xì)胞HepG2，乳腺癌細(xì)胞MCF-7，均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

2、質(zhì)粒：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒eGFP(GenBank登陸號(hào)X83959)，購自BD Biosciences Clontech公司。

3、小干擾RNA（siPD-L1）：

正義鏈，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；

反義鏈，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

本發(fā)明陽離子化香菇多糖作為基因傳遞載體在腫瘤預(yù)防與治療中的應(yīng)用，還包括將陽離子化香菇多糖與抗腫瘤基因治療藥物混合后進(jìn)行體外、體內(nèi)抗腫瘤的生物學(xué)評(píng)價(jià)。

所述抗腫瘤基因治療藥物有：裝載有治療基因的質(zhì)粒DNA、裝載有治療基因的病毒載體DNA、反義寡核苷酸、小干擾RNA中的一種或幾種。

所述的腫瘤細(xì)胞為鼠源或人源的各種實(shí)體瘤細(xì)胞，包括乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、舌癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、陰莖癌細(xì)胞、翠丸癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、惡性黑色素瘤細(xì)胞中的一種。

所述的腫瘤為人器官表面或內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、舌癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、陰莖癌、翠丸癌、皮膚癌、白血病、惡性黑色素瘤中的一種。

由上述表明，本發(fā)明的陽離子化香菇多糖制備方法經(jīng)反復(fù)多次試驗(yàn)均取得較為滿意的技術(shù)效果。本發(fā)明通過將聚乙烯亞胺接枝到香菇多糖，作為核酸傳遞載體的同時(shí)保持了香菇多糖免疫活性，本發(fā)明中的陽離子香菇多糖合成原料來源廣泛，制備條件容易滿足，制備成本低，兼?zhèn)漭^好的水溶性，穩(wěn)定的物理以及化學(xué)性質(zhì)，較強(qiáng)的核酸負(fù)載能力，陽離子化香菇多糖作為一種良好的基因傳遞載體的同時(shí)保持香菇多糖自身的免疫學(xué)活性，開辟了基因治療與免疫治療聯(lián)合抗腫瘤新途徑、新方法，具有巨大的醫(yī)用價(jià)值和社會(huì)效益。