本發(fā)明涉及負(fù)載磁共振對(duì)比劑釓噴酸葡胺的固體脂質(zhì)納米粒載體的制備和優(yōu)化及其體外藥物釋放行為、細(xì)胞藥效學(xué)研究、體外MRI檢測(cè)。

背景技術(shù)：

相較于傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查方法如CT、PET、X射線等，MRI具有較高空間分辨率、良好的軟組織對(duì)比度、無電離輻射，且在一定程度上可以顯示生理學(xué)和解剖學(xué)細(xì)節(jié)的優(yōu)越性。但臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)良、惡性腫瘤組織之間，腫瘤組織與正常組織之間，弛豫時(shí)間T1、T2會(huì)互相重疊，信號(hào)強(qiáng)度相差不大，因此有必要應(yīng)用MR對(duì)比劑，提高組織間的圖像對(duì)比，繼而提高M(jìn)RI診斷的敏感性與特異性。應(yīng)用于臨床的MRI造影劑需要滿足條件有：(1)良好水溶性；(2)選擇性滯留在被檢測(cè)部位；(3)弛豫效能高；(4)毒性低。其在消化道應(yīng)用有兩種方法，第一種是通過對(duì)比劑口服(MR小腸成像)和灌腸(MR大腸成像)方法，此方法小病灶檢出率低、且易于腸內(nèi)容物混淆而不易辨別；第二種是通過靜脈注射對(duì)比劑，通過病變與正常腸壁的強(qiáng)化差異顯示病變，此種方法雖檢出效果高于前者，但是無靶向特異性。

目前應(yīng)用較為廣泛的造影劑是釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)，它本身不能被腸道吸收且不產(chǎn)生信號(hào)，需要通過影響體內(nèi)局部組織的水質(zhì)子弛豫時(shí)間與周圍組織形成對(duì)比產(chǎn)生造影作用。而大腸與小腸較強(qiáng)的吸收功能可使很多藥物通過腸道吸收進(jìn)入體內(nèi)，因此設(shè)計(jì)一個(gè)易被腸道吸收的載體包載Gd-DTPA，促進(jìn)腸壁對(duì)Gd-DTPA的吸收并縮短T1弛豫時(shí)間、增強(qiáng)MRI信號(hào)具有重要的意義。

固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles,SLN)是由甘油三酯、復(fù)合甘油酯等天然或合成的脂質(zhì)材料制備，粒徑在50-1000nm之間。SLN具有較高的口服利用度、可降低藥物的腎毒性，此外具有良好穩(wěn)定性、毒性低、包載藥物穩(wěn)定、低毒、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此固體脂質(zhì)納米粒被認(rèn)為 是口服藥物的理想載體。常見Gd-DTPA載入SLN的方法有溶劑擴(kuò)散法、乳化法、高壓乳勻法等，前期的工作中采用溶劑擴(kuò)散法包載Gd-DTPA，包封率達(dá)到55％，但是在釋放實(shí)驗(yàn)中發(fā)生短時(shí)間突釋效應(yīng)，原因在于釓噴酸葡胺是一種親水性藥物，與由脂質(zhì)材料構(gòu)成的SLN親和力弱。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種固體脂質(zhì)磁共振納米粒子及其制備方法和應(yīng)用，該固體脂質(zhì)磁共振納米粒子克服了現(xiàn)有的磁共振對(duì)比劑中Gd-DTPA釋放速度過快的現(xiàn)象。

一種固體脂質(zhì)磁共振納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

(1)將吐溫-80溶于水中得到水相，將司盤-80溶于有機(jī)溶劑中得到有機(jī)相，然后將水相加入到有機(jī)相中，超聲處理得到微乳液；

(2)將釓噴酸葡胺溶解于水中得到水溶液，將十八胺溶解于乙醇中得到乙醇溶液，然后將水溶液和乙醇溶液復(fù)合后除去溶劑得到中間產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)得到的中間產(chǎn)物分散到含有脂質(zhì)材料的溶液中，然后加熱條件下注入到步驟(1)得到的微乳液中，經(jīng)過攪拌、離心和冷凍干燥得到所述的固體脂質(zhì)磁共振納米粒子。

在現(xiàn)有的納米粒制備過程中，由于脂質(zhì)材料具有兩親性，當(dāng)包載水溶性的順磁性對(duì)比劑釓噴酸葡胺時(shí)對(duì)藥物的包封率不高并且會(huì)產(chǎn)生藥物的突釋現(xiàn)象。本發(fā)明采用微乳液溶劑擴(kuò)散法制備固體脂質(zhì)磁共振納米粒子，首先通過十八胺與Gd-DTPA復(fù)合，加入亞微乳，再進(jìn)行冷凍干燥，提高了固體脂質(zhì)磁共振納米粒子中水溶性藥物的包載效率，并且有效地避免了突釋現(xiàn)象。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述的吐溫-80與水的用量比為1.8～2.5g：100mL；

所述的司盤-80與有機(jī)溶劑的用量比為1.5～2.0g：100mL。

步驟(1)中，所述的有機(jī)溶劑為室溫下與水互不混溶的溶劑，例如烴類溶劑或酯類溶劑，作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述的有機(jī)溶劑為正戊烷、正己烷和環(huán)己烷中的至少一種。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述的水溶液中釓噴酸葡胺的質(zhì)量百分比濃度為7.8％；

所述的乙醇溶液，溶液中十八胺的質(zhì)量百分比濃度為0.6％；

復(fù)合的溫度為60℃，復(fù)合的時(shí)間為30min。

作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述的脂質(zhì)材料選用單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、硬脂酸、三硬脂酸甘油酯中的一種或多種組合；

負(fù)載釓噴酸葡胺的載藥量為4％～35％(質(zhì)量百分比濃度)，優(yōu)選為25％～27.5％。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，步驟(3)中，所述的脂質(zhì)材料由重量比為85～95：5～15的單硬脂酸甘油酯和卵磷脂組成。

步驟(3)中，用于溶解脂質(zhì)材料的溶劑的親和力小于水的親和力，作為優(yōu)選，所選用的溶劑為正戊烷、正己烷和環(huán)己烷中的至少一種。

步驟(3)中，冷凍干燥時(shí)加入海藻糖作為凍干保護(hù)劑，以海藻糖為凍干保護(hù)劑可以延長(zhǎng)固體脂質(zhì)納米粒對(duì)Gd-DTPA的釋放時(shí)間。

本發(fā)明還提供了一種固體脂質(zhì)磁共振納米粒子，由所述的制備方法制備得到。得到的固體脂質(zhì)磁共振納米粒子的粒徑為100-300nm。

本發(fā)明還提供了一種所述的固體脂質(zhì)磁共振納米粒子在MRI檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明還提高了負(fù)載磁共振對(duì)比劑Gd-DTPA的固體脂質(zhì)納米粒在體外藥效學(xué)應(yīng)用。通過上述步驟方案制備的固體脂質(zhì)納米粒設(shè)置不同濃度組測(cè)得材料與藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的IC50值均較處方改進(jìn)前降低，材料的IC50值為183.2814ug/ml，計(jì)算藥物的IC50值為45.82ug/ml。此外，當(dāng)固體脂質(zhì)納米粒的濃度在0.5mg/ml時(shí)，在磁共振成像呈現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)。

本發(fā)明中，釓噴酸葡胺、十八胺、卵磷脂和單硬脂酸甘油酯的最優(yōu)質(zhì)量比為32.8：10：5.2：47.2，此時(shí)，得到的納米粒子中釓噴酸葡胺負(fù)載量達(dá)到或接近質(zhì)量百分比39％。

同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的固體脂質(zhì)磁共振納米粒子不僅可以解決藥物的突釋問題，而且體外藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞存活率高，毒性??；同時(shí)體外核磁共振試驗(yàn)結(jié)果表明，檢測(cè)效果進(jìn)一步提高。

附圖說明

圖1A為實(shí)施例1中制備的負(fù)載Gd-DTPA脂質(zhì)納米粒的透射電鏡圖片，放大倍數(shù)為100000倍，左：SLN-1改進(jìn)前處方，右：SLN-2改進(jìn)后處方；圖1B為SLN-2的粒徑分析圖。

圖2為實(shí)施例4中以MCF-7作為模型細(xì)胞，負(fù)載Gd-DTPA的脂質(zhì)納米粒的細(xì)胞毒性分析圖，SLN-1、2分別為改進(jìn)前、后處方。

圖3為實(shí)施例3中SLN包載Gd-DTPA隨時(shí)間釋放曲線，SLN-1、2分別指改進(jìn)前、后處方。

圖4A為實(shí)施例4中以MCF-7作為模型細(xì)胞，負(fù)載Gd-DTPA的脂質(zhì)納米粒SLN-2的細(xì)胞攝取-時(shí)間依賴性熒光圖片；圖4B為SLN-2細(xì)胞攝取-濃度依賴性熒光圖片。

圖5為實(shí)施例4中細(xì)胞攝取-濃度依賴性流式圖片，5A為SLN-1改進(jìn)前處方，5B為SLN-2改進(jìn)后處方。

圖6為實(shí)施例5中MRI檢測(cè)負(fù)載Gd-DTPA的脂質(zhì)納米粒SLN-2磁共振響應(yīng)靈敏性，1-6號(hào)為SLN濃度分別為0mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、12mg/mL，7號(hào)為Gd-DTPA 2mg/mL。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：負(fù)載Gd-DTPA的固體脂質(zhì)納米粒的制備

(1)首先稱取54mg吐溫-80溶于3ml水，組成水相，600mg司盤-80溶于30ml正己烷，組成有機(jī)相，在400rpm的室溫?cái)嚢钘l件下，將水相加入有機(jī)相，探頭超聲制得亞微乳；

(2)然后稱取62.6mg釓噴酸葡胺溶解于水中得到水溶液，將18mg十八胺溶解在3ml乙醇中得到乙醇溶液，然后將兩者于60℃下復(fù)合30min，并于60℃真空旋蒸除去溶劑得到中間產(chǎn)物；

(3)步驟(2)制備的中間產(chǎn)物加入3ml乙醇、90mg單甘脂和10mg卵磷脂混合物，60℃加熱條件下注入步驟(1)制備的亞微乳液中，室溫?cái)嚢?min；之后于20000rpm離心20min，正己烷離心沉淀2次，終加入250mg海藻糖作為凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥，從而得到固體脂質(zhì)納米粒。

實(shí)施例2：負(fù)載Gd-DTPA的固體脂質(zhì)納米粒的理化性質(zhì)考察

取上述制備的固體脂質(zhì)納米粒，以超純水作為復(fù)溶劑，以0.01mg/ml濃度，使用3000HS粒度及表面電位分析儀測(cè)定其粒徑。

采用間接法測(cè)定固體脂質(zhì)納米粒中Gd-DTPA的包封率。熒光分光光度法(Ex＝495nm,Em＝514nm,Slit＝5nm)測(cè)定熒光值，計(jì)算溶液中游離 Gd-DTPA的量，按(1)式計(jì)算熒光嫁接物包封率：

Gd-DTPA包封率＝(Wo-W游離)/Wo*100％ (1)

Gd-DTPA載藥量按照(2)式計(jì)算：

Gd-DTPA載藥量＝(加入藥物*包封率)/(加入藥物*包封率+載體材料用量)*100％

圖1為處方負(fù)載Gd-DTPA的固體脂質(zhì)納米粒的透射電鏡圖片。

Gd-DTPA是一種水溶性極好的釓離子螯合物，采用一般的溶劑擴(kuò)散法制備固體脂質(zhì)納米粒，由于藥物與脂質(zhì)材料的親脂性弱而極易向水中滲漏，很難將其有效地包裹于脂質(zhì)納米粒中；而采用本發(fā)明提供的方法，通過控制十八胺與Gd-DTPA的投料比，以提高脂質(zhì)材料與藥物的親和力，增加SLN的水溶性，延長(zhǎng)藥物的釋放時(shí)間，降低細(xì)胞毒性，同時(shí)可以增強(qiáng)體外MRI檢測(cè)的靈敏性。

實(shí)施例3：負(fù)載Gd-DTPA的固體脂質(zhì)納米粒的體外藥物釋放行為研究

分別移取一定體積的SLN溶液，置于透析袋(MWCO 3.5KDa)后放入裝有25ml釋放介質(zhì)(pH 7.2PBS)的釋放管中。在37℃、65rpm恒溫震蕩下進(jìn)行體外釋放，在特定時(shí)間點(diǎn)(0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h及72h)取樣，同時(shí)更換全部釋放介質(zhì)。用熒光分光光度法測(cè)定樣品中的藥物濃度(Ex＝275nm，Em＝313nm，狹縫＝5nm，工作電壓＝700V)，計(jì)算藥物的累計(jì)釋放累積釋放量及累計(jì)釋放百分率。結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例4：負(fù)載Gd-DTPA的固體脂質(zhì)納米粒的體外藥效學(xué)考察

采用噻唑蘭法(MTT)定量考察固體脂質(zhì)納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。首先，按照0.8-1×10⁴個(gè)數(shù)/mL細(xì)胞液的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)96孔細(xì)胞板，置于37℃5％細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。其次，配制一系列不同濃度的聚合物溶液，每孔加入聚合物溶液的體積是200μL，平行5個(gè)復(fù)孔，稀釋介質(zhì)是無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基，所需考察聚合物的濃度依次為0，50，100，200，400，500，600，800，單位是μg/mL。接著，從培養(yǎng)箱中取出96孔細(xì)胞板，吸去培養(yǎng)液，每孔用100μL PBS緩沖溶液沖洗一次，再吸去磷酸鹽緩沖溶液，將一系列不同濃度的聚合物溶液依次加入到細(xì)胞板中，置于37℃5％細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48小時(shí)。然后，從培養(yǎng)箱中取出96 孔細(xì)胞板，每孔加入20μLCCK-8，再繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育1-3h后取出細(xì)胞板，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在490nm處的吸光度值。每個(gè)樣品平行測(cè)試5次，取平均值作圖(空白作為對(duì)照組)。細(xì)胞存活率(百分比)是以待測(cè)樣的吸光度值相比正常細(xì)胞的吸光度值來表示。

FITC標(biāo)記SLN，Hoechst 33342染色細(xì)胞核。首先，按照5×10⁴個(gè)/mL細(xì)胞液的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)24孔細(xì)胞板，置于37℃5％細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。其次，分別按照不同時(shí)間點(diǎn)0.5h、1h、4h、8h、12h、24h加至每孔；以及不同濃度50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml加至每孔并在攝取4h收集細(xì)胞，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀比較SLN-1與SLN-2的攝取差異，結(jié)果如圖4、5所示，載體從0.5h開始便有攝取，并且隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)攝取隨之增加；濃度依賴性攝取實(shí)驗(yàn)中對(duì)于不同濃度SLN-2的細(xì)胞攝取量多于SLN-1。

實(shí)施例5：負(fù)載Gd-DTPA的固體脂質(zhì)納米粒的體外MRI檢測(cè)

設(shè)置系列不同濃度載有Gd-DTPA的SLN，置于溫度20℃，場(chǎng)強(qiáng)3.0T。TR500，ER15的磁場(chǎng)強(qiáng)度下，同時(shí)以水和Gd-DTPA作為陰性和陽性對(duì)照，得到的結(jié)果如圖6所示。