本發(fā)明屬臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備富含血小板的血漿的方法，更特別涉及一種以獲得具有高濃度血小板、高血小板回收率等一個或多個方面的優(yōu)點的富血小板血漿的制備方法。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法制備得到的此種制備富血小板血漿PRP，以及由本發(fā)明此種方法制備的富血小板血漿PRP在制備健康產(chǎn)品中的用途。例如，所述的健康產(chǎn)品應(yīng)用于骨科、口腔科、頜面外科、運動醫(yī)學(xué)以及美容醫(yī)學(xué)。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明所制得的富血小板血漿PRP制備凍干粉的方法和所制得的凍干粉。
背景技術(shù)：
富含血小板的血漿，在本領(lǐng)域通常亦可稱為富血小板血漿(Platelet Rich Plasma，PRP)，其是通過離心人或動物自身的全血而得到的含高體積分數(shù)血小板的血漿。自從上世紀80年代David R.Knighton等人發(fā)現(xiàn)血小板細胞能促進血管增生、膠原合成后，人們便致力于將富血小板血漿(PRP)應(yīng)用于臨床，渴望解決修復(fù)能力低下的器官組織的損傷修復(fù)問題。但由于當時PRP制備困難，限制了其在臨床上的推廣。
經(jīng)過幾十年的研究，已探索出幾種較為合適的富血小板血漿制備方法：手工法(一次離心法、二次離心法和三次離心法)及設(shè)備制備法。其中，二次離心法的PRP的提取率最高，在臨床的應(yīng)用也最廣。利用二次離心法制備PRP的原理如下：(1)抽取靜脈血液并將其注入含抗凝劑的試管內(nèi)；(2)第1次離心可將血液分為3層，最底端的部分為約占血液總體積分數(shù)55％的紅細胞；頂端部分為約占總體積分數(shù)40％的貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)，主要是纖維蛋白原等血漿成分；中間層為僅占總體積分數(shù)5％的血小板濃縮物(platelet concentrate，PC)，即俗稱的黃衣層；(3)用移液器吸取PPP和PC以及緊鄰PC的部分紅細胞，并將其注入另一不含抗凝劑的試管中；(2)以一定的速度和時間再次將其離心并將血漿分為3層，最底端是少量剩余的紅細胞，頂端是約占總體積分數(shù)80％的PPP，兩層之間即富集的血小板；(5)用移液器抽取大部分的PPP，并留取足夠的血清來容納懸浮于其中的富集的血小板，得到PRP。另外，PRP中的血小板在體外較脆弱且容易激活，過高的離心速度會使血小板膜破裂降低其生物活性，而較低的離心速度可使血小板活性在制備過程中保持在最低水平，因此離心時速度不宜過快。而且，在不同的離心次數(shù)、離心力和離心時間所制備出的PRP中，血小板的體積分數(shù)以及各種生長因子的量和活性各不相同。
目前雖能制備出成分較為單一、濃度達標的PRP，但其制備技術(shù)仍未完全成熟，大多數(shù)人推崇的二次離心法存在著操作復(fù)雜、過程漫長、產(chǎn)品污染的風(fēng)險。我國某公司上市的PRP設(shè)備存在著PRP中血小板濃度不高的缺陷，而在美國已經(jīng)上市的PRP設(shè)備，其PRP中血紅蛋白濃度未公開，因此可能存在著血小板細胞濃度高但純度不高的缺陷，而且各個上市的PRP設(shè)備，其價格相當昂貴，在臨床應(yīng)用推廣方面受到較大限制，尤其在發(fā)展中國家的應(yīng)用。目前，解決PRP制備問題的方法仍值得進一步探究，以得到一種方便快捷、純度及濃度高、價格低廉的制備方法。
人體的血小板除了可以在止血的時候提供凝聚作用外，血小板中還含有很多與創(chuàng)傷愈合和骨頭再生有關(guān)的多種生長因子。如血小板衍生生長因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor，TGF)，胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)，表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)以及血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)等等，血小板來源的生長因子，對細胞的分化和增殖起著促進作用，這些生長因子相互之間具有協(xié)同響應(yīng)，與其他促進細胞活性的因子相互作用和影響，共同維持著組織環(huán)境的平衡，對傷口愈合、修復(fù)和再生有著重要的作用。
另外，由于PRP可以從患者自身血液中提取，經(jīng)提取富集處理后，可用于相關(guān)疾病的治療，因而來源豐富，取材方便，制備方法簡單而且可以讓身體吸收。自身PRP使用能避免病毒傳播和免疫排斥的問題出現(xiàn)。因此PRP被廣泛應(yīng)用到不同的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。如骨科、口腔科、頜面外科、運動醫(yī)學(xué)以及美容醫(yī)學(xué)。
PRP在目前為止還沒有一個統(tǒng)一的制備方法，PRP的制備原理主要是利用血液中各種成分沉降速度不同，通過離心將血液分層。從而獲取含血小板的血漿，并利用離心原理進一步的濃縮以獲得高濃度的血小板血漿。人體全血中血小板的濃度一般為1～3×105/ml。研究認為濃縮后的PRP血小板濃度應(yīng)為全血血小板濃度的3-4倍。研究也發(fā)現(xiàn)PRP中血小板濃度的提高能有效提高干細胞的增殖和分化能力以及能夠顯著增加成纖維細胞的增殖和I型膠原蛋白的表達。
因此有效的分離和提高PRP中血小板的濃度成為了整個PRP治療方案的關(guān)鍵。
林庶茹等(CN101402940A，中國專利申請?zhí)枺?00810228726.5，發(fā)明名稱：一種小鼠血小板的提取方法)公開了一種小鼠血小板的提取方法，小鼠眶靜脈取血，置于抗凝離心管中，靜置30MIN后離心，800RPM離心10MIN，上清液即為富含血小板的血漿。吸出上清液置于干凈試管中，3500RPM離心10MIN，棄去上清液，管底沉淀物為血小板。向試管中滴加50～100ML質(zhì)量濃度為1％草酸銨溶液，以玻璃棒輕輕攪拌，再加入質(zhì)量濃度為1％草酸銨溶液2～3ML，靜置5MIN，使紅細胞溶解。3500RPM離心10MIN，棄去上清，加入血小板洗滌液并反復(fù)吹打，使成為血小板混懸液，3300RPM離心10MIN，棄去上清，加入少量血小板洗滌液并反復(fù)吹打使之成為混懸液。該血小板將作為抗原免疫豚鼠后，取豚鼠血清給小鼠注射，制備過敏性紫癜模型。此方法操作簡單，可以得到高濃度的血小板，并很好地解決血小板純度不佳的問題。這種針對小鼠血液進行血小板富集的方法雖然據(jù)信可以獲得濃度達1010的血小板，然而該方法未公開其血小板的收率，并且方法在操作上比較繁雜，難以適用于人血的處理。
此外，王悅等(CN 102078644A，中國專利申請?zhí)?01110053979.5，發(fā)明名稱：一種簡便高效的自體富血小板血漿提取裝置及提取方法)中公開了一種簡便高效的自體富血小板血漿提取裝置及提取方法,所提取的自體富血小板血漿中含有多種復(fù)合生長因子,能夠有效地促進組織的修復(fù)。由1個注射器、1個靜脈輸液器連接管、1個靜脈留置針塑料卡片和1個靜脈輸液器針頭組成；注射器用以抽取靜脈血并充當離心管；靜脈輸液器針頭通過靜脈輸液器連接管和注射器出口連接,靜脈輸液器針頭用以皮膚血管穿刺、抽取抗凝劑和激活劑并向人體需要部位注射提取后的自體富血小板血漿；靜脈輸液器連接管可彎曲固定于靜脈留置針塑料卡片中。據(jù)信這種裝置在提升血小板提取的操作性方面是有益的。
因此，為了從血液中富集血小板而得到有臨床治療意義的富血小板血漿，探尋一種操作過程簡單、收率高、富集的血漿中血小板濃度高的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切期待的。另外，將這種富血小板血漿制備成為凍干粉以便于其應(yīng)用也是本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切期待的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是探索一種簡單和高效地分離和濃縮血漿中血小板的方法；特別是本發(fā)明為了從血液中富集血小板而得到有臨床治療意義的富血小板血漿，探尋一種操作過程簡單、收率高、富集的血漿中血小板濃度高的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用梯度離心法進行血小板的濃縮和分離，在特定操作條件下可以以高收率地獲得含濃度高血小板的血漿。本發(fā)明的另一個目的是提供由此富血小板血漿制備成為凍干粉的方法。
為此，本發(fā)明第一方面提供了一種從血液中提取富血小板血漿并制備其凍干粉的方法，其包括以下步驟：
(a)使采集的全血置于含有抗凝劑的容器中，使血液和抗凝劑充分混勻；
(b)使混有抗凝劑的血液置于離心管中，進行第一次離心，使血液基本上分成三層；
(c)將最上層和大部分的中間層抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，混合均勻，進行第二次離心；
(d)棄掉離心管上層的血漿，利用剩余的血漿使沉淀的血小板重新懸浮，即得富血小板血漿(Platelet Rich Plasma，PRP)；
(e)向該富血小板血漿中添加凍干賦形劑，冷凍干燥，即得。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(a)中所述全血是新鮮的全血。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(a)中所述全血是受試個體例如患者或者健康志愿者的全血。由此，本發(fā)明獲得的富血小板血漿可以方便地重新用于該患者以治療相關(guān)疾病，或者用于該健康志愿者的相關(guān)需求。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(a)中抗凝劑選自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)及其鹽(例如乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸鈣鈉)、枸櫞酸鈉、枸櫞酸葡萄糖溶液、或其組合。乙二胺四乙酸或其鹽的典型用量是每0.5～1.5mg用于1ml血液抗凝，例如每0.75～1.25mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管內(nèi)壁，亦可以是配制成適宜濃度的溶液(例如濃度為1～2％)涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用。枸櫞酸鈉的典型用量是每3～5mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管內(nèi)壁，亦可以是配制成適宜濃度的溶液(例如濃度為3～5％)涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用。本領(lǐng)域常用的枸櫞酸葡萄糖溶液的一個典型配方包含：枸櫞酸0.48g、枸櫞酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用該枸櫞酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(a)中所述容器可以是離心管或是采血袋等。如果是離心管并且該離心管容量適合直接離心，則所述步驟(b)中不需要另置于離心管中，而可以直接進行離心。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(a)中還包括在使血液和抗凝劑混均后取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中血液中血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)的過程比照、監(jiān)控。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(b)中經(jīng)第一次離心后是達到使血液基本上分成三層的程度。在一個實施方案中，其中最上層是含血小板的血漿層，中間一層是血塊黃層(Buffy Coat層，其中含有血小板和白細胞)，最底層的是紅細胞層。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2000rpm～3000rpm，例如2200rpm～2800rpm，例如2300rpm～2500rpm，例如約2400rpm。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(b)中離心的時間為1-10min，例如2-8min，例如3-5min，例如約4min。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2300rpm～2500rpm，時間為3-5min。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2400rpm，時間為4min。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中，所述大部分的中間層是指盡量將中間層全部吸出但避免抽取紅細胞。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1000rpm～2000rpm，例如1200rpm～1800rpm，例如1400rpm～1600rpm，例如約1500rpm。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中離心的時間為10-30min，例如15-25min，例如18-22min，例如約20min。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1400rpm～1600rpm，時間為18-22min。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1500rpm，時間為20min。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中所得上層和大部分中間層經(jīng)混勻后，其中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的1-5倍，例如1.5～4倍，例如2～3倍。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中所得上層和大部分中間層經(jīng)混勻后，其中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的2.5-3.5倍，例如2.6～3.1倍。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(c)中還包括在使抽取的最上層和中間層混合均勻后，取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中的血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)的過程比照、監(jiān)控。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(d)中，所述棄掉離心管上層的血漿是指棄掉離心管上層至少2/4的血漿。在一個實施方案中，在步驟(d)中，所述棄掉離心管上層的血漿是指棄掉離心管上層至少3/4的血漿。在此應(yīng)當說明，上層血漿中僅含有低濃度的血小板。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(d)中，棄掉離心管上層的血漿后，可以利用下部剩下的(約2/4，或者更優(yōu)選的約1/4)血漿重新使沉淀下來的血小板懸浮，由此可以獲取本發(fā)明所述富血小板血漿(PRP)。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(d)所得富血小板血漿(PRP)中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的5-10倍，例如6～8倍，例如6～7倍，例如6.1～6.8倍。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(d)所得富血小板血漿(PRP)中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的8-10倍，例如8.8～9.2倍。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(d)中還包括在獲得富血小板血漿(PRP)后，取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中的血小板的數(shù)量。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中在所述抗凝劑中還補充添加了氯化鎂和酒石酸鉀鈉兩種試劑，以其用于每1ml血液抗凝計兩種試劑用量分別是50μg和100μg。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述兩種試劑是在配制抗凝劑時添加到抗凝劑溶液中的。
本發(fā)明由此獲得的富血小板血漿(PRP)具有濃度高的特點，并且血小板回收率高。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，步驟(d)所得富血小板血漿中包含1～3×109/ml濃度的血小板；例如其中包含1.5～2.5×109/ml濃度的血小板。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述凍干賦形劑選自甘露醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇、麥芽糖、右旋糖苷及其組合。在一個實施方案中，所述凍干賦形劑是以水溶液的形式與所述富血小板血漿混合的。在一個實施方案中，所述凍干賦形劑是以水溶液的形式與所述富血小板血漿混合的，在混合液中凍干賦形劑的濃度為0.5～2.5％，例如0.5～1.5％。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中步驟(e)中，使所述富血小板血漿與凍干賦形劑水溶液以1:0.5～2.5的體積比(例如1:0.5～1.5的體積比，例如1:0.6～1.2的體積比)混合均勻，再進行冷凍干燥。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述凍干賦形劑是海藻糖或麥芽糖。
根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案的方法，其中所述凍干賦形劑是海藻糖或麥芽糖，并且隨該凍干賦形劑還一起添加了乙酸鈉。在一個實施方案中，所述乙酸鈉在富血小板血漿與凍干賦形劑的混合液中的濃度為0.01～0.05％，例如0.01～0.02％。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，在使用上述特定賦形劑并且同時使用乙酸鈉時，本發(fā)明所得凍干粉中的相關(guān)活性細胞因子呈現(xiàn)顯著更高的穩(wěn)定性。
進一步的，本發(fā)明第二方面提供了一種包含富血小板血漿的凍干粉，其中包括富血小板血漿、凍干賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中所述凍干賦形劑選自甘露醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇、麥芽糖、右旋糖苷及其組合。在一個實施方案中，所述凍干賦形劑是以水溶液的形式與所述富血小板血漿混合的。在一個實施方案中，所述凍干賦形劑是以水溶液的形式與所述富血小板血漿混合的，在混合液中凍干賦形劑的濃度為0.5～2.5％，例如0.5～1.5％。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(e)中，使所述富血小板血漿與凍干賦形劑水溶液以1:0.5～2.5的體積比(例如1:0.5～1.5的體積比，例如1:0.6～1.2的體積比)混合均勻，再進行冷凍干燥。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中所述凍干賦形劑是海藻糖或麥芽糖。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中所述凍干賦形劑是海藻糖或麥芽糖，并且隨該凍干賦形劑還一起添加了乙酸鈉。在一個實施方案中，所述乙酸鈉在富血小板血漿與凍干賦形劑的混合液中的濃度為0.01～0.05％，例如0.01～0.02％。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其基本上是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述的方法制得的。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其是通過包括以下步驟的方法制備得到的：
(a)使采集的全血置于含有抗凝劑的容器中，使血液和抗凝劑充分混勻；
(b)使混有抗凝劑的血液置于離心管中，進行第一次離心，使血液基本上分成三層；
(c)將最上層和大部分的中間層抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，混合均勻，進行第二次離心；
(d)棄掉離心管上層的血漿，利用剩余的血漿使沉淀的血小板重新懸浮，即得富血小板血漿(Platelet Rich Plasma，PRP)；
(e)向該富血小板血漿中添加凍干賦形劑，冷凍干燥，即得。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(a)中所述全血是新鮮的全血。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(a)中所述全血是受試個體例如患者或者健康志愿者的全血。由此，本發(fā)明獲得的富血小板血漿可以方便地重新用于該患者以治療相關(guān)疾病，或者用于該健康志愿者的相關(guān)需求。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(a)中抗凝劑選自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)及其鹽(例如乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸鈣鈉)、枸櫞酸鈉、枸櫞酸葡萄糖溶液、或其組合。乙二胺四乙酸或其鹽的典型用量是每0.5～1.5mg用于1ml血液抗凝，例如每0.75～1.25mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管內(nèi)壁，亦可以是配制成適宜濃度的溶液(例如濃度為1～2％)涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用。枸櫞酸鈉的典型用量是每3～5mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管內(nèi)壁，亦可以是配制成適宜濃度的溶液(例如濃度為3～5％)涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用。本領(lǐng)域常用的枸櫞酸葡萄糖溶液的一個典型配方包含：枸櫞酸0.48g、枸櫞酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用該枸櫞酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(a)中所述容器可以是離心管或是采血袋等。如果是離心管并且該離心管容量適合直接離心，則所述步驟(b)中不需要另置于離心管中，而可以直接進行離心。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(a)中還包括在使血液和抗凝劑混均后取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中血液中血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)的過程比照、監(jiān)控。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(b)中經(jīng)第一次離心后是達到使血液基本上分成三層的程度。在一個實施方案中，其中最上層是含血小板的血漿層，中間一層是血塊黃層(Buffy Coat層，其中含有血小板和白細胞)，最底層的是紅細胞層。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2000rpm～3000rpm，例如2200rpm～2800rpm，例如2300rpm～2500rpm，例如約2400rpm。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(b)中離心的時間為1-10min，例如2-8min，例如3-5min，例如約4min。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2300rpm～2500rpm，時間為3-5min。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2400rpm，時間為4min。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中，所述大部分的中間層是指盡量將中間層全部吸出但避免抽取紅細胞。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1000rpm～2000rpm，例如1200rpm～1800rpm，例如1400rpm～1600rpm，例如約1500rpm。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中離心的時間為10-30min，例如15-25min，例如18-22min，例如約20min。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1400rpm～1600rpm，時間為18-22min。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1500rpm，時間為20min。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中所得上層和大部分中間層經(jīng)混勻后，其中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的1-5倍，例如1.5～4倍，例如2～3倍。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中所得上層和大部分中間層經(jīng)混勻后，其中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的2.5-3.5倍，例如2.6～3.1倍。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(c)中還包括在使抽取的最上層和中間層混合均勻后，取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中的血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)的過程比照、監(jiān)控。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(d)中，所述棄掉離心管上層的血漿是指棄掉離心管上層至少2/4的血漿。在一個實施方案中，在步驟(d)中，所述棄掉離心管上層的血漿是指棄掉離心管上層至少3/4的血漿。在此應(yīng)當說明，上層血漿中僅含有低濃度的血小板。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(d)中，棄掉離心管上層的血漿后，可以利用下部剩下的(約2/4，或者更優(yōu)選的約1/4)血漿重新使沉淀下來的血小板懸浮，由此可以獲取本發(fā)明所述富血小板血漿(PRP)。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(d)所得富血小板血漿(PRP)中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的5-10倍，例如6～8倍，例如6～7倍，例如6.1～6.8倍。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(d)所得富血小板血漿(PRP)中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的8-10倍，例如8.8～9.2倍。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(d)中還包括在獲得富血小板血漿(PRP)后，取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中的血小板的數(shù)量。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中在所述抗凝劑中還補充添加了氯化鎂和酒石酸鉀鈉兩種試劑，以其用于每1ml血液抗凝計兩種試劑用量分別是50μg和100μg。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中所述兩種試劑是在配制抗凝劑時添加到抗凝劑溶液中的。
根據(jù)本發(fā)明第二方面任一實施方案的凍干粉，其中步驟(d)所得富血小板血漿中包含1～3×109/ml濃度的血小板；例如其中包含1.5～2.5×109/ml濃度的血小板。
眾所周知的，富血小板血漿PRP可以用于制備健康產(chǎn)品。例如，所述的健康產(chǎn)品應(yīng)用于骨科、口腔科、頜面外科、運動醫(yī)學(xué)以及美容醫(yī)學(xué)。
因此，本發(fā)明第三方面提供了富血小板血漿PRP在制備健康產(chǎn)品中的用途。例如，所述的健康產(chǎn)品應(yīng)用于骨科、口腔科、頜面外科、運動醫(yī)學(xué)以及美容醫(yī)學(xué)。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中所述健康產(chǎn)品是凍干粉。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中所述凍干粉基本上是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述的方法制得的。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中所述凍干粉是通過包括以下步驟的方法制備得到的：
(a)使采集的全血置于含有抗凝劑的容器中，使血液和抗凝劑充分混勻；
(b)使混有抗凝劑的血液置于離心管中，進行第一次離心，使血液基本上分成三層；
(c)將最上層和大部分的中間層抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，混合均勻，進行第二次離心；
(d)棄掉離心管上層的血漿，利用剩余的血漿使沉淀的血小板重新懸浮，即得富血小板血漿(Platelet Rich Plasma，PRP)；
(e)向該富血小板血漿中添加凍干賦形劑，冷凍干燥，即得。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(a)中所述全血是新鮮的全血。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(a)中所述全血是受試個體例如患者或者健康志愿者的全血。由此，本發(fā)明獲得的富血小板血漿可以方便地重新用于該患者以治療相關(guān)疾病，或者用于該健康志愿者的相關(guān)需求。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(a)中抗凝劑選自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)及其鹽(例如乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸鈣鈉)、枸櫞酸鈉、枸櫞酸葡萄糖溶液、或其組合。乙二胺四乙酸或其鹽的典型用量是每0.5～1.5mg用于1ml血液抗凝，例如每0.75～1.25mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管內(nèi)壁，亦可以是配制成適宜濃度的溶液(例如濃度為1～2％)涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用。枸櫞酸鈉的典型用量是每3～5mg用于1ml血液抗凝，可以是干粉直接涂在抗凝管內(nèi)壁，亦可以是配制成適宜濃度的溶液(例如濃度為3～5％)涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用。本領(lǐng)域常用的枸櫞酸葡萄糖溶液的一個典型配方包含：枸櫞酸0.48g、枸櫞酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用該枸櫞酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(a)中所述容器可以是離心管或是采血袋等。如果是離心管并且該離心管容量適合直接離心，則所述步驟(b)中不需要另置于離心管中，而可以直接進行離心。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(a)中還包括在使血液和抗凝劑混均后取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中血液中血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)的過程比照、監(jiān)控。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(b)中經(jīng)第一次離心后是達到使血液基本上分成三層的程度。在一個實施方案中，其中最上層是含血小板的血漿層，中間一層是血塊黃層(Buffy Coat層，其中含有血小板和白細胞)，最底層的是紅細胞層。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2000rpm～3000rpm，例如2200rpm～2800rpm，例如2300rpm～2500rpm，例如約2400rpm。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(b)中離心的時間為1-10min，例如2-8min，例如3-5min，例如約4min。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2300rpm～2500rpm，時間為3-5min。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(b)中離心的轉(zhuǎn)速為2400rpm，時間為4min。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中，所述大部分的中間層是指盡量將中間層全部吸出但避免抽取紅細胞。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1000rpm～2000rpm，例如1200rpm～1800rpm，例如1400rpm～1600rpm，例如約1500rpm。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中離心的時間為10-30min，例如15-25min，例如18-22min，例如約20min。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1400rpm～1600rpm，時間為18-22min。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中離心的轉(zhuǎn)速為1500rpm，時間為20min。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中所得上層和大部分中間層經(jīng)混勻后，其中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的1-5倍，例如1.5～4倍，例如2～3倍。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中所得上層和大部分中間層經(jīng)混勻后，其中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的2.5-3.5倍，例如2.6～3.1倍。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(c)中還包括在使抽取的最上層和中間層混合均勻后，取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中的血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)的過程比照、監(jiān)控。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(d)中，所述棄掉離心管上層的血漿是指棄掉離心管上層至少2/4的血漿。在一個實施方案中，在步驟(d)中，所述棄掉離心管上層的血漿是指棄掉離心管上層至少3/4的血漿。在此應(yīng)當說明，上層血漿中僅含有低濃度的血小板。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(d)中，棄掉離心管上層的血漿后，可以利用下部剩下的(約2/4，或者更優(yōu)選的約1/4)血漿重新使沉淀下來的血小板懸浮，由此可以獲取本發(fā)明所述富血小板血漿(PRP)。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(d)所得富血小板血漿(PRP)中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的5-10倍，例如6～8倍，例如6～7倍，例如6.1～6.8倍。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(d)所得富血小板血漿(PRP)中血小板的濃度是分離前全血中血小板濃度的8-10倍，例如8.8～9.2倍。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(d)中還包括在獲得富血小板血漿(PRP)后，取適量(例如少于500ul，例如約100ul)用于測定其中的血小板的數(shù)量。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中在所述抗凝劑中還補充添加了氯化鎂和酒石酸鉀鈉兩種試劑，以其用于每1ml血液抗凝計兩種試劑用量分別是50μg和100μg。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中所述兩種試劑是在配制抗凝劑時添加到抗凝劑溶液中的。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(d)所得富血小板血漿中包含1～3×109/ml濃度的血小板；例如其中包含1.5～2.5×109/ml濃度的血小板。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中所述凍干賦形劑選自甘露醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇、麥芽糖、右旋糖苷及其組合。在一個實施方案中，所述凍干賦形劑是以水溶液的形式與所述富血小板血漿混合的。在一個實施方案中，所述凍干賦形劑是以水溶液的形式與所述富血小板血漿混合的，在混合液中凍干賦形劑的濃度為0.5～2.5％，例如0.5～1.5％。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中步驟(e)中，使所述富血小板血漿與凍干賦形劑水溶液以1:0.5～2.5的體積比(例如1:0.5～1.5的體積比，例如1:0.6～1.2的體積比)混合均勻，再進行冷凍干燥。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中所述凍干賦形劑是海藻糖或麥芽糖。
根據(jù)本發(fā)明第三方面任一實施方案的用途，其中所述凍干賦形劑是海藻糖或麥芽糖，并且隨該凍干賦形劑還一起添加了乙酸鈉。在一個實施方案中，所述乙酸鈉在富血小板血漿與凍干賦形劑的混合液中的濃度為0.01～0.05％，例如0.01～0.02％。
本發(fā)明任一方面或該任一方面的任一實施方案所具有的任一技術(shù)特征同樣適用其它任一實施方案或其它任一方面的任一實施方案，只要它們不會相互矛盾，當然在相互之間適用時，必要的話可對相應(yīng)特征作適當修飾。下面對本發(fā)明的各個方面和特點作進一步的描述。
本發(fā)明所引述的所有文獻，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準。
在本發(fā)明一個實施方案中，所述的全血是人的全血。
本發(fā)明制備得到的凍干粉，其一種示例性的使用方法是：凍干粉可避光存放于4度至25度環(huán)境，未開封的凍干粉可保存6個月；每瓶凍干粉可以配備一支4ml的溶媒(超純水或透明質(zhì)酸溶液)，在使用時可以用配備的吸頭將溶媒滴至凍干粉瓶，充分溶解后即可涂抹至臉部皮膚；凍干粉用溶媒溶解后可以在4度冰箱內(nèi)保存，可以在7天內(nèi)使用完畢。
在本發(fā)明中，提供了一種采用特定處置條件進行血小板富集的方法。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，使用本發(fā)明的處置條件，其中所用的器具是可以作適當變動的，例如其中的離心裝置。例如可以使用王悅等(CN 102078644A，中國專利申請?zhí)?01110053979.5，發(fā)明名稱：一種簡便高效的自體富血小板血漿提取裝置及提取方法)中所用的由注射器、靜脈輸液器連接管、靜脈留置針塑料卡片和靜脈輸液器針頭組成的裝置，該文獻所記載的裝置可以用于本發(fā)明方法，并使本發(fā)明方法在保持操作過程的潔凈度中是有益的。
出人意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在研究梯度離心法進行血小板的濃縮和分離的過程中，獲得了一種操作過程簡單、收率高、富集的血漿中血小板濃度高的方法。還出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用特定的賦形劑并配合特定的試劑制備得到的凍干粉具有出人意料的穩(wěn)定性。
具體實施方式
通過下面的實施例可以對本發(fā)明進行進一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細的描述。
下文具體實例中，當提及時使用的抗凝劑，乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸二鉀是配制成濃度為1～2％的溶液涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用，每0.8mg用于1ml血液抗凝；枸櫞酸鈉是配制成濃度為4％的溶液涂在抗凝管內(nèi)壁待干燥后使用，每4mg用于1ml血液抗凝；枸櫞酸葡萄糖溶液的配方包含：枸櫞酸0.48g、枸櫞酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml，每1ml血液抗凝通常使用該枸櫞酸葡萄糖溶液0.18ml。
以下實施例1～5和實施例11～15使用的賦形劑溶液中，包括賦形劑海藻糖和乙酸鈉，二者濃度分別為2％和0.03％；其在與富血小板血漿以體積比1：1混合后，所得混合液中賦形劑濃度為1％、乙酸鈉濃度為0.015％；分別測定這10種凍干粉中的三種細胞因子(即FGF(成纖維細胞生長因子)、TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、PDGF(血小板衍生生長因子))的量(pg/瓶，作為0月量)，再分別測定這些凍干粉在25℃室溫處放置3個月后上述三種細胞因子的量(pg/瓶，作為3月量)，對于每一批凍干粉，計算其中某細胞因子3月時的量相當于其0月時的量的百分數(shù)，該百分數(shù)稱為某細胞因子殘余百分數(shù)。結(jié)果顯示實施例1～5和實施例11～15所得10個凍干粉樣品，F(xiàn)GF殘余百分數(shù)在96.3～99.6％范圍內(nèi)，TGF-β1殘余百分數(shù)在97.5～99.2％范圍內(nèi)，PDGF殘余百分數(shù)在96.8～99.4％范圍內(nèi)，顯示這些凍干粉中的特征細胞因子具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。參照實施例1～5和實施例11～15的補充試驗中，但是在步驟(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液改為以體積比1：0.5或者1：1.5的比例混合，制得的凍干粉，同樣進行上述3個月的試驗，發(fā)現(xiàn)三種細胞因子的殘余百分數(shù)均大于96％。參照實施例1～5和實施例11～15的補充試驗中，但是采用的賦形劑改為麥芽糖時，制得的凍干粉，同樣進行上述3個月的試驗，發(fā)現(xiàn)三種細胞因子的殘余百分數(shù)均大于96％。參照實施例1～5和實施例11～15的補充試驗中，但是采用的賦形劑改為甘露醇、蔗糖、乳糖、山梨醇、或右旋糖苷時，制得的凍干粉，同樣進行上述3個月的試驗，發(fā)現(xiàn)三種細胞因子的殘余百分數(shù)均在64～81％范圍內(nèi)。參照實施例1～5和實施例11～15的補充試驗中，但是在賦形劑溶液中不添加乙酸鈉時，制得的凍干粉，同樣進行上述3個月的試驗，發(fā)現(xiàn)三種細胞因子的殘余百分數(shù)均在67～79％范圍內(nèi)。參照實施例1～5和實施例11～15的補充試驗中，但是在賦形劑溶液中不添加賦形劑而只是用乙酸鈉溶液稀釋富血小板血漿時，制得的凍干粉，同樣進行上述3個月的試驗，發(fā)現(xiàn)三種細胞因子的殘余百分數(shù)均在54～73％范圍內(nèi)。
本發(fā)明的各實施例中，在進行冷凍干燥時，是照如下工藝進行處理的：
(1)將由富血小板血漿和賦形劑溶液配制成的混合液分瓶分裝到凍干瓶中，每瓶中包含的血小板數(shù)量為5×108個，將加入混合液的凍干瓶蓋上凍干用的膠塞，膠塞不能完全閉合，需露出透氣孔才能放在凍干擱板上，關(guān)緊凍干箱門，檢查真空旋鈕指在close，壓蓋旋鈕指在raise，真空泵油的液位處于一半以上，凍干程序設(shè)置正常，真空泵值設(shè)置正常，然后按run開啟程序；
(2)凍干過程分為兩步，第一步為冷凍干燥，第二步為解析干燥，具體程序設(shè)置為：
(a)預(yù)冷凍：3.5h(凍干機程序里有預(yù)冷凍溫度，無需自己設(shè)定，預(yù)冷凍無需開啟真空泵)——>冷凍干燥a：-40度2h，(真空泵會在程序下自動開啟，真空度值為0.014mbar)——>冷凍干燥b：-22度12h(主要的干燥步驟)——>0度2h(作為冷凍干燥到解析干燥的過渡)；
(b)解析干燥：35度解析2-5h(2h的解析干燥就已經(jīng)足夠，時間超出對于凍干結(jié)果并無影響)；解析干燥完成之后按下stop關(guān)閉程序，旋轉(zhuǎn)壓蓋旋鈕至lower，對凍干瓶進行壓蓋；壓蓋完成后，旋轉(zhuǎn)真空旋鈕至open，直至箱門可以打開；取出凍干瓶；按下deforst按鈕，進行加熱除霜，待deforst程序自動結(jié)束，指示燈熄滅后，取出冷阱下的積水盤，洗凈擦干，放入凍干箱；關(guān)閉凍干機；給每瓶凍干粉扎鋁蓋，放入包裝盒。
實施例1：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂靡叶匪囊宜?。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2400rpm離心4分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1500rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：250×106/ml，全血體積為10ml?？傃“鍞?shù)量為2.5×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：570×106/ml(濃縮2.28倍)，血漿體積為4ml。總血小板數(shù)量為2.26×109?；厥章蕿?0.4％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1680×106/ml(濃縮6.72倍，此倍數(shù)是指，所得富血小板血漿中的血小板濃度是分離前全血中血小板濃度的倍數(shù)，其在本發(fā)明中可稱為最終富集倍數(shù))，血漿體積為1.2ml，得到富血小板血漿。總血小板數(shù)量為2.016×109。最終回收率為80.6％(此最終回收率是指，所得富血小板血漿中的血小板數(shù)量是分離前全血中血小板數(shù)量的百分數(shù))。
實施例2：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂靡叶匪囊宜岫c。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2400rpm離心4分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1500rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：170×106/ml，全血體積為10ml?？傃“鍞?shù)量為1.7×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：448×106/ml(濃縮2.64倍)，血漿體積為3.4ml?？傃“鍞?shù)量為1.52×109?；厥章蕿?9.4％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1160×106/ml(濃縮6.82倍)，血漿體積為1.2ml，得到富血小板血漿?？傃“鍞?shù)量為1.39×109。最終回收率為81.8％。
實施例3：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂描蹤此崞咸烟侨芤?。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2400rpm離心4分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1500rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1∶1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：210×106/ml，全血體積為10ml。總血小板數(shù)量為2.1×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：540×106/ml(濃縮2.57倍)，血漿體積為3.5ml?？傃“鍞?shù)量為1.89×109?；厥章蕿?0％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1360×106/ml(濃縮6.48倍)，血漿體積為1.2ml，得到富血小板血漿?？傃“鍞?shù)量為1.63×109。最終回收率為77.6％。
實施例4：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂描蹤此徕c。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2300rpm離心5分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1600rpm離心18分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：200×106/ml，全血體積為10ml?？傃“鍞?shù)量為2×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：510×106/ml(濃縮2.55倍)，血漿體積為3.5ml。總血小板數(shù)量為1.78×109?；厥章蕿?9.2％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1220×106/ml(濃縮6.1倍)，血漿體積為1.2ml，得到富血小板血漿?？傃“鍞?shù)量為1.46×109。最終回收率為73.2％。
實施例5：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂靡叶匪囊宜岫?。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2500rpm離心3分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1400rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：270×106/ml，全血體積為10ml。總血小板數(shù)量為2.7×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：610×106/ml(濃縮2.26倍)，血漿體積為4ml?？傃“鍞?shù)量為2.44×109?；厥章蕿?0.4％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1830×106/ml(濃縮6.78倍)，血漿體積為1.2ml，得到富血小板血漿?？傃“鍞?shù)量為2.2×109。最終回收率為81.3％。
以上實施例1～5的結(jié)果顯示，血小板的最終富集倍數(shù)為6.1～6.8范圍內(nèi)，血小板最終回收率在73～82％范圍內(nèi)。本發(fā)明在以下實施例11～15中，各實例中分別向其中的抗凝劑中補充添加了氯化鎂和酒石酸鉀鈉兩種試劑，各抗凝劑中添加兩種試劑的量以其用于每1ml血液抗凝計分別是50μg和100μg，在配制抗凝劑時添加到抗凝劑溶液中。實施例11～15的結(jié)果顯示，血小板的最終富集倍數(shù)在8.92～9.14范圍內(nèi)，血小板最終回收率在91.9～93.6％范圍內(nèi)，兩項重要的提取效果指標均明顯地高于實施例1～5未加兩種試劑時的結(jié)果。但是，在補充試驗中發(fā)現(xiàn)，如果實施例11～15的抗凝劑中僅僅是補充添加氯化鎂和酒石酸鉀鈉中的任一種試劑，則最終富集倍數(shù)均在5.8～6.7范圍內(nèi)，血小板最終回收率均在68～84％范圍內(nèi)，明顯地低于補充添加兩種試劑時的效果。另外，在參照實施例11～15的補充試驗中，當乙二胺四乙酸或其鹽的用量在每0.5～1.5mg范圍內(nèi)用于1ml血液抗凝、或者當枸櫞酸鈉的用量在每3～5mg范圍內(nèi)用于1ml血液抗凝、或者當每1ml血液抗凝使用枸櫞酸葡萄糖溶液0.15～0.2ml范圍內(nèi)時，血小板的最終富集倍數(shù)均在8.9～9.2范圍內(nèi)，血小板最終回收率均在91～934％范圍內(nèi)。表明抗凝劑用量在這些范圍時均是適用的。
實施例11：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管。抗凝劑使用乙二胺四乙酸。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2400rpm離心4分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1500rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：250×106/ml，全血體積為10ml?？傃“鍞?shù)量為2.5×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：640×106/ml(濃縮2.56倍)，血漿體積為3.8ml?？傃“鍞?shù)量為2.43×109?；厥章蕿?7.3％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：2230×106/ml(濃縮8.92倍)，血漿體積為1.05ml，得到富血小板血漿。總血小板數(shù)量為2.34×109。最終回收率為93.6％。
實施例12：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂靡叶匪囊宜岫c。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2400rpm離心4分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1500rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1∶1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：170×106/ml，全血體積為10ml?？傃“鍞?shù)量為1.7×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：515×106/ml(濃縮3.03倍)，血漿體積為3.2ml?？傃“鍞?shù)量為1.65×109?；厥章蕿?7.0％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1495×106/ml(濃縮8.79倍)，血漿體積為1.05ml，得到富血小板血漿?？傃“鍞?shù)量為1.57×109。最終回收率為92.4％。
實施例13：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂描蹤此崞咸烟侨芤骸?/p>
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2400rpm離心4分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1500rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：210×106/ml，全血體積為10ml?？傃“鍞?shù)量為2.1×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：650×106/ml(濃縮3.1倍)，血漿體積為3.15ml?？傃“鍞?shù)量為2.05×109。回收率為97.5％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1920×106/ml(濃縮9.14倍)，血漿體積為1.02ml，得到富血小板血漿?？傃“鍞?shù)量為1.96×109。最終回收率為93.3％。
實施例14：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管。抗凝劑使用枸櫞酸鈉。
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2300rpm離心5分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1600rpm離心18分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：200×106/ml，全血體積為10ml。總血小板數(shù)量為2×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：606×106/ml(濃縮3.03倍)，血漿體積為3.22ml?？傃“鍞?shù)量為1.95×109?；厥章蕿?7.6％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：1778×106/ml(濃縮8.89倍)，血漿體積為1.04ml，得到富血小板血漿?？傃“鍞?shù)量為1.85×109。最終回收率為92.5％。
實施例15：提取富血小板血漿(PRP)并制備其凍干粉
(1)把受試者的全血采集到含有抗凝劑的容器里，容器是可進行離心的采血抗凝管?？鼓齽┦褂靡叶匪囊宜岫洝?/p>
(2)將血液和抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)凝血。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(3)把血液分配到離心管(15毫升)。
(4)把離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速2500rpm離心3分鐘。
(5)離心后的血液應(yīng)分為三層：最底層的是紅細胞，最上層的是含血小板血漿，中間一層是BuffyCoat，含有血小板和白細胞。
(6)利用移液器把最上層的血漿和大部分的buffy coat抽出并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，盡量避免抽取紅細胞。提取100微升以計算血小板數(shù)量。
(7)把含有血漿和buffy coat混合物的離心管放進離心機，以轉(zhuǎn)速1400rpm離心20分鐘。
(8)把3/4的低濃度血小板血漿(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血漿重懸沉淀下來的血小板，獲得富血小板血漿(PRP)。
(9)抽取100微升PRP以進行血小板計數(shù)。
(10)將步驟(8)所得富血小板血漿與賦形劑溶液混合(體積比1：1)均勻，進行冷凍干燥。
提取富血小板血漿操作中的試驗數(shù)據(jù)計算：
(1)分離前全血中血小板濃度：270×106/ml，全血體積為10ml?？傃“鍞?shù)量為2.7×109。
(2)第一次離心后血漿中血小板濃度：796×106/ml(濃縮2.95倍)，血漿體積為3.3ml?？傃“鍞?shù)量為2.63×109?；厥章蕿?7.4％。
(3)第二次離心后血漿中(PRP)血小板濃度：2435×106/ml(濃縮9.02倍)，血漿體積為1.02ml，得到富血小板血漿。總血小板數(shù)量為2.48×109。最終回收率為91.9％。
用本實施例15方法，針對三個客戶(客戶A、客戶B、客戶C)的血樣制備所得富血小板血漿，測定其中三種細胞因子(即FGF(成纖維細胞生長因子)、TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、PDGF(血小板衍生生長因子))的量(pg/ml)，結(jié)果見表1。
表1：富血小板血漿中三種細胞因子的測定結(jié)果
以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。