本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種納米脂質(zhì)體及其制備方法。

背景技術(shù)：

目前，全球范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率越來越高，新藥及新型療法層出不窮，但是這些治療手段對(duì)機(jī)體具有非常大的副作用，且大部分惡性腫瘤難以治愈，所以尋求一種特異性、安全、無副作用的癌癥治療手段仍然是全球癌癥治療的一大難題。

研究發(fā)現(xiàn)天然植物抗腫瘤藥物的抗癌療效顯著，且毒副作用小。齊墩果酸是一種天然抗腫瘤藥物，廣泛分布于多種植物，如釀酒葡萄、山楂、大棗等。齊墩果酸具有多種的生物學(xué)以及藥理學(xué)活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和抗炎等。然而由于其親水性低，生物利用度差以及血液半衰期短，至今未廣泛應(yīng)用。納米脂質(zhì)體是目前公認(rèn)的、可提高包載藥物生物利用度的新型載體系統(tǒng)，由于其良好的生物相容性受到社會(huì)廣泛關(guān)注。然而常規(guī)脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)又具有一系列缺陷，如不能控制釋放化療藥物、靶向性不強(qiáng)等。癌癥治療中增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的高效攝取是癌癥治療成功與否的關(guān)鍵步驟，藥物的可控釋放可以提高包載藥物的生物利用度，降低毒副作用。因此，發(fā)明一種多功能脂質(zhì)體，使其可控釋放抗腫瘤藥物，提高腫瘤細(xì)胞藥物攝取率，是目前亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種制備方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、能高效進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換，且對(duì)腫瘤組織或細(xì)胞具有靶向性，提高細(xì)胞對(duì)藥物的攝取率的奧曲肽修飾金球殼納米脂質(zhì)體及其制備方法。

本發(fā)明的方法主要是以齊墩果酸納米脂質(zhì)體為基礎(chǔ)，在其表面結(jié)合一層谷胱甘肽，谷胱甘肽攜帶的巰基修飾到脂質(zhì)體表面，使制備的金納米粒子易與其結(jié)合，在溫和條件下避光孵育，得到光熱轉(zhuǎn)化性能良好且可控釋放藥物的納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體。由于奧曲肽上具有氨基、羥基等基團(tuán)，在一定條件下，將納米金球殼包覆的脂質(zhì)體與奧曲肽水溶液共孵育，使奧曲肽包覆在金球殼表面，得到具有靶向性能、可控釋放、光熱轉(zhuǎn)換、化學(xué)治療的多功能脂質(zhì)體。

本發(fā)明的奧曲肽修飾金球殼納米脂質(zhì)體是一種在齊墩果酸納米脂質(zhì)體表面形成一層致密的納米金球殼，然后在金球殼表面包覆奧曲肽配體的脂質(zhì)體，其粒徑為50-200nm，表面等離子共振吸收波長(zhǎng)為650-950nm。

本發(fā)明的制備方法如下：

(1)制備金球殼納米脂質(zhì)體

①原料：膽固醇、大豆卵磷脂、齊墩果酸、谷胱甘肽，氯化金，奧曲肽；

②按膽固醇：大豆卵磷脂：齊墩果酸按質(zhì)量比1～3:7～14:1的比例，將它們磁力攪拌溶解于無水乙醇中，每毫升無水乙醇加入上述3種混合物18～54mg，形成脂質(zhì)乙醇溶液；按每毫升磷酸緩沖液加入0.3～0.6mg谷胱甘肽的比例，將谷胱甘肽溶解到pH為6.0～7.0的磷酸緩沖液，作為水化介質(zhì)；按脂質(zhì)乙醇溶液與水化介質(zhì)的體積比為1:4～10，將脂質(zhì)乙醇溶液逐滴滴入35～55℃的水化介質(zhì)中，滴加過程中磁力攪拌器緩慢攪拌，得到脂質(zhì)體懸液；攪拌1～2小時(shí)除去無水乙醇，得到齊墩果酸納米脂質(zhì)體；

③在-20℃低溫條件下，將30～80μL濃度為230～270mM的硼氫化鈉(NaBH₄)溶液迅速滴加到濃度為0.1～1.5mM的氯化金溶液中，每毫升氯化金溶液中含5～10μL硼氫化鈉溶液，劇烈搖晃，反應(yīng)1～8min后，得到粒徑在5-10nm的金納米粒子溶液；

④采用晶種生長(zhǎng)法，將步驟③得到的金納米粒子溶液與步驟②制得的齊墩果酸納米脂質(zhì)體以1:1～5的體積比混合，置于搖床，25～30℃，90～140rpm，避光孵育10～25h，即得到金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體。

⑤向步驟④制得的金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體中按體積比1:1～6的比例加入濃度為1～6mM AuCl₃溶液，混合均勻，在室溫條件下，再加入濃度為35～90mM硼氫化鈉溶液，硼氫化鈉溶液與上述混合液的體積比為3～8:100，搖晃均勻，將其置于搖床，25～30℃，90～140rpm，孵育5～15h，即制得納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體。

(2)制備奧曲肽修飾的納米金球殼脂質(zhì)體

①將奧曲肽用去離子水溶解，水浴超聲0.5～2min，配制成濃度為1～5mg/mL的奧曲肽溶液；

②用共孵育法，將步驟(1)得到的納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體與步驟①配制的奧曲肽溶液，按體積比1:0.3～1混合均勻，制得脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液；

③將步驟②制備的脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液置于搖床25～30℃，90～140rpm，孵育2～20小時(shí)，得到奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、制備方法在常溫、常壓及溫和條件下完成，所需實(shí)驗(yàn)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，易于控制，重復(fù)性高。

2、制備的金球殼納米脂質(zhì)體具有理想的形貌，粒徑分布在50-200nm之間，不僅通過滲透和滯留增強(qiáng)效應(yīng)更易于在腫瘤部位積累，達(dá)到更好的治療效果，還具有極佳的光熱轉(zhuǎn)換性能，使包載的齊墩果酸實(shí)現(xiàn)可控釋放。

3、在金球殼納米脂質(zhì)體基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)一步修飾腫瘤特異性配體奧曲肽，采用“受體-配體”相互作用基本原理，使其具有靶向性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取率。

4、制備的奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體在奧曲肽特異性配體作用下，可以靶向到達(dá)腫瘤細(xì)胞，近紅外激光照射下能很好的將化學(xué)治療和光熱治療、控制釋放結(jié)合在一起，不僅可以高效進(jìn)行癌癥治療，且無毒副作用，減小了對(duì)正常組織和細(xì)胞的損傷。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制得的齊墩果酸納米脂質(zhì)體透射電子顯微鏡圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制得的金球殼納米脂質(zhì)體透射電子zeta電位圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1制得的奧曲肽修飾金球殼納米脂質(zhì)體粒徑分布圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例2對(duì)比的普通脂質(zhì)體光熱轉(zhuǎn)換結(jié)果圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例2制得的奧曲肽修飾金球殼納米脂質(zhì)體光熱轉(zhuǎn)換結(jié)果圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例3制得的奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體競(jìng)爭(zhēng)抑制性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

將14mg大豆卵磷脂(購自沈陽天峰生物制藥有限公司)、2.0mg膽固醇(購自天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站)和2.0mg齊墩果酸(購自四川什邡市華康藥物原料廠)，溶解于1mL無水乙醇中，通過磁力攪拌得到脂質(zhì)乙醇溶液；將1.2mg谷胱甘肽溶于4mL pH＝6.0磷酸緩沖液中作為水化介質(zhì)，在磁力攪拌下，將1mL脂質(zhì)乙醇溶液勻速逐滴滴入到4mL 35℃的水化介質(zhì)中，得到脂質(zhì)體懸液；然后攪拌1小時(shí)除去脂質(zhì)體懸液中的無水乙醇，得到谷胱甘肽修飾的齊墩果酸納米脂質(zhì)體；

在-20℃低溫條件下，將30μL濃度為240mM的硼氫化鈉(NaBH₄)溶液，迅速滴加到1mL 0.1mM的氯化金溶液中，劇烈搖晃，反應(yīng)1min后，即得到粒徑在5-10nm的金納米粒子溶液，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

將得到的金納米粒子溶液與齊墩果酸納米脂質(zhì)體以1:1的體積比混合，置于搖床，25℃，90rpm，避光孵育10h，即得到金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體；

向金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體中按體積比1:1的比例加入濃度為1mM的AuCl₃溶液，混合均勻，在室溫條件下，再加入濃度為35mM的硼氫化鈉溶液，硼氫化鈉溶液與上述混合液的體積比為3:100，搖晃均勻，將其置于搖床，25℃，90rpm，孵育5h，即制得納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體。

將奧曲肽用去離子水溶解，水浴超聲0.5min，配制成濃度為1mg/mL的奧曲肽溶液；采用共孵育法，將得到的納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體按體積比1:0.3的比例與奧曲肽溶液混合，制得脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液；將脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液置于搖床，25℃，90rpm，孵育2h得到奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體。

應(yīng)用透射電子顯微鏡對(duì)奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體進(jìn)行形貌表征，如圖1所示，奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體呈球形，形貌規(guī)則，在其表面有可觀察到一層致密的納米金球殼。利用激光粒度儀檢測(cè)奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體帶電荷狀態(tài)和粒徑分布情況，如圖2和圖3所示，由于納米金球殼帶負(fù)電荷，奧曲肽帶正電荷，從圖2中可以看出脂質(zhì)體帶正電荷，證明奧曲肽成功修飾到金球殼納米脂質(zhì)體上；從圖3中可以看出奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體粒徑分布在50-200nm左右，證明奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體粒徑均勻，分散性良好。

實(shí)施例2

將25mg大豆卵磷脂(購自沈陽天峰生物制藥有限公司)、5mg膽固醇(購自天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站)和2.5mg齊墩果酸(購自四川什邡市華康藥物原料廠)，溶解于1mL無水乙醇中，通過磁力攪拌得到脂質(zhì)乙醇溶液；將3.5mg谷胱甘肽溶于7mL pH＝6.5磷酸緩沖液中作為水化介質(zhì)，在磁力攪拌下，將1mL脂質(zhì)乙醇溶液勻速逐滴滴入到7mL 45℃的水化介質(zhì)中，得到脂質(zhì)體懸液；然后攪拌1.5小時(shí)除去脂質(zhì)體懸液中的無水乙醇，得到谷胱甘肽修飾的齊墩果酸納米脂質(zhì)體；

在-20℃低溫條件下，將50μL濃度為250mM的硼氫化鈉(NaBH₄)溶液，迅速滴加到1mL 0.7mM的氯化金溶液中，劇烈搖晃，反應(yīng)4min后，即得到粒徑在5-10nm的金納米粒子溶液，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

將得到的金納米粒子溶液與齊墩果酸納米脂質(zhì)體以1:3的體積比混合，置于搖床，28℃，110rpm，避光孵育15h，即得到金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體。

向金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體中按體積比1:3的比例加入濃度為3mM的AuCl₃溶液，混合均勻，在室溫條件下，再加入濃度為55mM硼氫化鈉溶液，硼氫化鈉溶液與上述混合液的體積比為5:100，搖晃均勻，將其置于搖床，28℃，110rpm，孵育10h，即制得納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體；

將奧曲肽用去離子水溶解，水浴超聲1.0min，配制成濃度為3mg/mL的奧曲肽溶液；采用共孵育法，將得到的納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體按體積比1:0.5的比例與奧曲肽溶液混合，制得脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液；將脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液置于搖床，28℃，110rpm，孵育10h得到奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體。

利用近紅外激光器(808nm,1.5W)檢測(cè)奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體光熱效果，如圖4和圖5所示，從圖4中可以看出普通脂質(zhì)體在激光照射10分鐘后，溫度變化不大，升高3℃左右，圖5為奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體，在照射10分鐘后，溫度升高到69.9℃，在此溫度下可以殺死癌細(xì)胞，證明金球殼包覆脂質(zhì)體后具有光熱效果，且光熱轉(zhuǎn)換性能良好。

實(shí)施例3

將42mg大豆卵磷脂(購自沈陽天峰生物制藥有限公司)、9.0mg膽固醇(購自天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站)和3.0mg齊墩果酸(購自四川什邡市華康藥物原料廠)，溶解于1mL無水乙醇中，通過磁力攪拌得到脂質(zhì)乙醇溶液；將6.0mg谷胱甘肽溶于10mL pH＝7.0磷酸緩沖液中作為水化介質(zhì)，在磁力攪拌下，將1mL脂質(zhì)乙醇溶液勻速逐滴滴入到10mL 55℃的水化介質(zhì)中，得到脂質(zhì)體懸液；然后攪拌2小時(shí)除去脂質(zhì)體懸液中的無水乙醇，得到谷胱甘肽修飾的齊墩果酸納米脂質(zhì)體；

在-20℃低溫條件下，將80μL濃度為270mM的硼氫化鈉(NaBH₄)溶液，迅速滴加到1mL 1.5mM的氯化金溶液中，劇烈搖晃，反應(yīng)8min后，即得到粒徑在5-10nm的金納米粒子溶液，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

將得到的金納米粒子溶液與齊墩果酸納米脂質(zhì)體以1:5的體積比混合，置于搖床，30℃，140rpm，避光孵育25h，即得到金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體。

向金納米粒子包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體中按體積比1:6的比例加入濃度為6mM的AuCl₃溶液，混合均勻，在室溫條件下，再加入濃度為90mM的硼氫化鈉溶液，硼氫化鈉溶液與上述混合液的體積比為8:100，搖晃均勻，將其置于搖床，30℃，140rpm，孵育15h，即制得納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體。

將奧曲肽用去離子水溶解，水浴超聲2min，配制成濃度為5mg/mL的奧曲肽溶液；采用共孵育法，將得到的納米金球殼包覆的齊墩果酸脂質(zhì)體按體積比1:1的比例與奧曲肽溶液混合，制得脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液；將脂質(zhì)體/奧曲肽混懸液置于搖床，30℃，140rpm，孵育20h得到奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體。

利用MTT法通過競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體靶向細(xì)胞能力，如圖6所示，可以看出奧曲肽修飾脂質(zhì)體后可以顯著提高細(xì)胞毒性，加入競(jìng)爭(zhēng)抑制劑奧曲肽后，奧曲肽修飾脂質(zhì)體與普通脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞毒性沒有差異，證明奧曲肽修飾的金球殼納米脂質(zhì)體具有靶向性，可以抗腫瘤藥物的治療效果。