專利名稱：通過活化富血小板血漿(prp)誘導(dǎo)組織再生的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過用氯化鈣溶液和I型膠原活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物，以及制備該組合物的方法。更具體地，在本發(fā)明中，所述組合物可以具有含富血小板血漿(PRP)的凝膠型結(jié)構(gòu)(gel-type of formation)，并且可被移植到任何需要組織再生的病區(qū)(lesion)，例如骨缺損治療和傷口愈合(wound healing)，因此，富血小板血漿(PRP)可被活化以誘導(dǎo)來自富血小板血漿(PRP)凝膠的對組織再生有益的生長因子 (growth factor)，從而方便快捷的實(shí)現(xiàn)有效的組織再生。所以，所述方法在大大提高將富血小板血漿(PRP)應(yīng)用到病區(qū)的可靠性并使消費(fèi)者呈現(xiàn)良好形象方面是極其有用的。
背景技術(shù)：
眾所周知，富血小板血漿(PRP)是通過密度梯度離心法從全血中分離出來的自體材料(autologous material)，是相對于少量的血漿濃縮含有大量血小板的無活性物質(zhì)，并且含有高濃度的白細(xì)胞。血管中無活性的血小板循環(huán)通過血管時(shí)保持圓形。已知血小板的生命周期大約為 10天，且相對于ImL的血液，含量大約是2-4X 108。通過血管中含有的物質(zhì)活化富血小板血漿(PRP)中的血小板，然后釋放生長因子(growth factor)和各種活性物質(zhì)(active substance)。所述活性物質(zhì)包括膠原、凝血酶、腺苷二磷酸(ADP)以及腎上腺素。特別地，膠原和凝血酶被認(rèn)為是強(qiáng)力激動(dòng)劑(strong agonist)。如

圖1所示，已知膠原通過將其特定序列粘合至血小板上來誘導(dǎo)血小板的活化。當(dāng)活化因子活化血小板時(shí)，所述血小板由于其α顆粒(alpha granules)的脫顆粒作用(degranulation)而釋放生長因子(growth factor)。所述因子在傷口愈合(wound healing)初期扮演著重要角色。在此，釋放的生長因子(growth factor)包括血小板衍生生長因子(PDGF-AB)、轉(zhuǎn)化生長因子-bl(TGF-bl)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF)等。而且，在體外條件下，富血小板血漿(PRP)釋放細(xì)胞因子等，由此合成成纖維細(xì)胞的DNA。這增加了膠原的產(chǎn)量，從而促使形成膠原結(jié)構(gòu)。但是，在應(yīng)用時(shí)富血小板血漿(PRP)呈液態(tài)，因此很難將所述富血小板血漿(PRP) 注射到傷口中，并且會(huì)存在周圍組織流失(loss of surrounding tissues)的問題。因此， 需要開發(fā)伴隨有物理性能的凝塊凝膠化(clottinggelation)。至于凝膠化，近期主要進(jìn)行了關(guān)于使用凝血酶的研究。然而，有報(bào)道，在使用凝血酶(主要取自牛(bovine-derived))， 也就是取自動(dòng)物的蛋白時(shí)，觀察到了免疫反應(yīng)如狼瘡(lupus)。換言之，凝血酶被認(rèn)為是具有與抗體有關(guān)的臨床問題的因子。凝血酶是血小板活化劑中最有效的成分。然而，在使用凝血酶時(shí)，還需要凝血酶的抗體、凝血酶原、凝血因子V(fact0r V)以及心磷脂。同時(shí)，通過動(dòng)物研究，發(fā)現(xiàn)存在一些臨床問題，如術(shù)后出血和自身免疫綜合征。雖然這些問題很少發(fā)生， 但在研發(fā)過程中不能忽略。凝血酶的使用可能導(dǎo)致受損傷口的擴(kuò)散、異常的凝膠強(qiáng)度等問題。
此外，由于凝血酶-活化凝膠的高收縮性，使在填充傷口空間的外科手術(shù)過程中存在困難。因此，認(rèn)識(shí)到了凝血酶替代材料的重要性。膠原是剛性纖維狀蛋白(rigid fibrous protein)，是哺乳動(dòng)物結(jié)締組織中的主要蛋白成分。它構(gòu)成了蛋白總量的30%以上。膠原賦予組織外形、強(qiáng)度和彈性(shape， strength and flexibility)，并具有各種功能如組織支架(tissue scaffolding)、細(xì)胞粘合、細(xì)胞遷移、血管生成(blood vessel production)、組織形態(tài)生成、組織修復(fù)等。作為血小板強(qiáng)力激動(dòng)劑(strong agonist)的膠原活化血小板，并引起血小板聚集(platelet aggregation)。纖維狀的膠原(fibrillar collagen)比可溶性的膠原(soluble collagen) 更強(qiáng)烈的誘導(dǎo)血小板聚集(platelet aggregation)并支持(supporting)更強(qiáng)烈的血小板粘附(platelet adhesion)。雖然產(chǎn)生這種差異的原因還沒有被證實(shí)，據(jù)設(shè)想，存在纖維狀的膠原(fibrillar collagen)與促進(jìn)活化血小板作用的分子結(jié)合的可能性。I型膠原構(gòu)成哺乳動(dòng)物結(jié)締組織的大部分。同時(shí)，作為天然支架(scaffold)，對I 型膠原在再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)領(lǐng)域的研究最為活躍。由于具有這些優(yōu)點(diǎn)，I型膠原通過替代凝血酶扮演著活化血小板的角色，并能保持外形。然而，目前還沒有通過用氯化鈣溶液和I型膠原活化富血小板血漿(PRP Platelet rich plasma)誘導(dǎo)組織再生的組合物。換言之，目前還沒有很好的凝血酶的替代品。因此，盡管存在很多問題，也只采用凝血酶(主要取自牛)，也就是取自動(dòng)物的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
因此，鑒于上述問題進(jìn)行本發(fā)明，并提供通過活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物及其制備方法。本發(fā)明達(dá)到下列目的。第一，當(dāng)富血小板血漿(PRP)與取自動(dòng)物的蛋白，也就是凝血酶(主要取自牛)一起使用時(shí)，會(huì)引起免疫反應(yīng)和臨床問題，為了改善所述免疫反應(yīng)和臨床問題，采用I型膠原。第二，為了骨缺損治療或傷口愈合(wound healing)，收集少量的全血，然后從全血中分離富血小板血漿(PRP)并與I型膠原混合注射。換言之，采用作為自體材料和很少引起免疫反應(yīng)的去端肽膠原(atelocollagen)的富血小板血漿(PRP)，以消除臨床排異(clinical rejection) 0第三，能夠方便快捷地從外科手術(shù)部位分離富血小板血漿(PRP)，并將其與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射，這樣能夠使嚴(yán)重受傷的病人或遭受反復(fù)手術(shù)的病人獲得有效的組織再生。第四，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合應(yīng)用于需要組織再生的部位時(shí)，I型膠原活化富血小板血漿(PRP)，誘導(dǎo)來自富血小板血漿(PRP)凝膠(gel)對組織再生有益的生長因子(growth factor)。這樣能夠方便快捷的獲得有效的組織再生。特別地，第五，與以凝血酶作為激動(dòng)劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊(clotting)相比，以I型膠原作為激動(dòng)劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊(clotting)能夠釋放相似或更大量的生長因子(growth factor)(根據(jù)生長因子(growth factor)的種類)。這誘導(dǎo)了更有效的組織再生。此外，第六，根據(jù)本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射到需要骨缺損治療或傷口愈合(wound healing)的所有部位，從而獲得有效的組織再生。最后，第七， 因此，本發(fā)明大大提高了將富血小板血漿(PRP)應(yīng)用到病區(qū)的可靠性并使消費(fèi)者呈現(xiàn)良好的形象。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種通過活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物的制備方法，該方法包括下列步驟從全血中分離富血小板血漿(PRP)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與 I型膠原混合。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種通過活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物，該組合物通過上述方法制備。如上所詳述，當(dāng)富血小板血漿(PRP)與取自動(dòng)物的蛋白，也就是凝血酶(主要取自牛)一起使用時(shí)，會(huì)引起免疫反應(yīng)和臨床問題，在本發(fā)明中，為了改善所述免疫反應(yīng)和臨床問題，采用I型膠原。根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案，為了骨缺損治療或傷口愈合(wound healing)，收集少量的全血，然后從所述全血中分離富血小板血漿(PRP)并與I型膠原混合注射。換言之， 采用作為自體材料和很少引起免疫反應(yīng)的去端肽膠原的富血小板血漿(PRP)，以消除臨床排異。而且，在本發(fā)明中，能夠方便快捷地從外科手術(shù)部位分離富血小板血漿(PRP)，并將其與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射，這樣能夠使嚴(yán)重受傷的病人或遭受反復(fù)手術(shù)的病人獲得有效的組織再生。而且，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合應(yīng)用于需要組織再生的部位時(shí)，I型膠原活化富血小板血漿(PRP)，誘導(dǎo)來自于富血小板血漿 (PRP)凝膠對組織再生有益的生長因子(growth factor)。這樣能夠方便快捷的獲得有效的組織再生。特別地，在本發(fā)明中，與以凝血酶作為激動(dòng)劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊 (clotting)相比，以I型膠原作為激動(dòng)劑和富血小板血漿(PRP)的凝塊(clotting)能夠釋放相似或更大量的生長因子(growth factor)(根據(jù)生長因子(growth factor)的種類)。 這誘導(dǎo)了更有效的組織再生。此外，將根據(jù)本發(fā)明收集的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原混合注射到需要骨缺損治療或傷口愈合(mnmd healing)的所有部位，從而獲得有效的組織再生。最后，因此，本發(fā)明大大提高了將富血小板血漿(PRP)應(yīng)用到病區(qū)的可靠性并使消費(fèi)者呈現(xiàn)良好的形象。
以下結(jié)合附圖的詳細(xì)說明，將使本發(fā)明的上述和其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)變得更加明顯。圖1是通過血小板和內(nèi)皮下蛋白(Subendothelial proteins)間的相互作用 (interaction)連續(xù)發(fā)生吸附和活化并進(jìn)行聚集(aggregation)的模示圖；圖2是ImL從全血中分離的富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液和I型膠原的混合物的照片，在圖2(a)中，所述氯化鈣溶液的含量為0.25mg/mL，在圖2(b)中，所述氯化鈣溶液的含量為0. ;3mg/mL，在圖2(c)中，所述氯化鈣溶液的含量為0. 5mg/mL ；以及圖3是常規(guī)凝血酶混合物㈧和本發(fā)明I型膠原混合物⑶培養(yǎng)物的照片。
具體實(shí)施方式
下文中，將參照附圖更具體地描述用于實(shí)現(xiàn)上述效果的根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。根據(jù)本發(fā)明，如圖2和3所示的，獲得(configured)通過活化富血小板血漿(PRP) 誘導(dǎo)組織再生的組合物及其制備方法。以下對本發(fā)明的描述中，當(dāng)確定詳細(xì)描述已知功能或結(jié)構(gòu)會(huì)使本發(fā)明的主題不清楚時(shí)，那么將省略引入本文的已知功能或結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述。另外，本發(fā)明中，下文描述的術(shù)語是鑒于其功能而設(shè)置的，是可以根據(jù)操作者的意圖或常規(guī)用途而變化的。因此，應(yīng)根據(jù)本說明書的描述確定其定義。首先，在本發(fā)明中，通過活化富血小板血漿(PRP=Platelet rich plasma)誘導(dǎo)組織再生的組合物通過下列步驟制備從全血中分離富血小板血漿(PRP)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I 型膠原混合。同時(shí)，在本發(fā)明中，所述組合物可有多種應(yīng)用，并可以多種形式制得。而且，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并不限于詳細(xì)描述中提到的具體實(shí)施方式
，且包括在本發(fā)明所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的修改、添加和替換。在下文中，將對制備如上獲得的通過活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物的發(fā)明方法的實(shí)施效果進(jìn)行描述。首先，本發(fā)明方法包括從全血中分離富血小板血漿(PRP =Platelet rich plasma) 的步驟。此處，從全血中分離富血小板血漿(PRP)的步驟包括下列步驟收集IOmL動(dòng)物或病人的全血放入含3. 2%檸檬酸鈉(Sodium citrate)的真空試管中，并先離心所述全 (1750-1900g)3-5 分鐘。然后，經(jīng)過離心，收集含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)。將收集的含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)通過鈍針 (blunt needle)轉(zhuǎn)移到新的真空試管中，并再次進(jìn)行離心(4500_5000g) 4-6分鐘。然后，通過鈍針(blunt needle)收集濃縮于底層(從試管底部到約為ImL的高度)的富血小板血漿(PRP)。此外，本發(fā)明方法包括將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合的步驟。此處，將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合的步驟中，通過三相連接器 (Connecta)將大約ImL從全血分離富血小板血漿(PRP)步驟中收集的富血小板血漿(PRP) 與濃度為0. 30-0. 55mg/mL的氯化鈣溶液進(jìn)行一次混合。另外，本發(fā)明方法包括將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合的步驟，由此來制備通過活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物。此處，將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合的步驟包括將所述I型膠原放置在室溫下的步驟。然后，通過三相連接器(Cormecta)連接將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與濃度為20-50mg/mL的不透明的I型膠原混合四次。接下來，將用注射器收取的所述富血小板血漿(PRP)和I型膠原的混合物注射到需要組織再生的所有部位，例如骨缺損治療和傷口愈合(wound healing)。所述I型膠原優(yōu)選具有20-50mg/mL的濃度。此外，所述I型膠原優(yōu)選在室溫下放置15-30分鐘。下面將對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行描述。[實(shí)施例1]首先，準(zhǔn)備用于富血小板血漿(PRP)分離的試劑盒如下。1)含有3. 2%檸檬酸鈉的真空試管2)真空試管夾3)真空試管針4)真空試管(普通型)5) 3mL 注射器6)鈍針(Blunt needle)從上述工具可以推導(dǎo)出富血小板血漿(PRP)的分離方法。首先，1)收集IOmL病人的全血放入含有3. 2%檸檬酸鈉的真空試管中。2)將真空試管中收取的全血離心(1750-1900g)3-5分鐘。此處，將離心機(jī)的重力加速度和時(shí)間設(shè)置成將全血分離為血細(xì)胞、血沉棕黃層(軟膜=Buffy coat)和血漿的最適狀態(tài)。3)在打開所述真空試管的蓋之后，用帶有鈍針(Blunt needle)的注射器收集含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)并轉(zhuǎn)移到新的真空試管(普通型)中。4)將轉(zhuǎn)移到新真空試管的含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的血漿離心 (4500-5000g) 4-6分鐘。此處，將離心機(jī)的重力加速度和時(shí)間設(shè)置成使血漿中的富血小板血漿(PRP)濃縮的最適狀態(tài)。5)在打開所述真空試管的蓋之后，用帶有鈍針(Blunt needle)的注射器收集濃縮于試管底層(從試管底部到約為ImL的高度)的富血小板血漿(PRP)。6)為了確定從IOmL全血中分離ImL血小板的分離效率，使血小板(Platelet)特異性表面標(biāo)識(shí)(Surface maker)(即CD41)和白細(xì)胞(Leukocyte)特異性表面標(biāo)識(shí)(Surface maker)(即CD45)進(jìn)行反應(yīng)。然后，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Flow cytometry)測量特定細(xì)胞 (expressing cells)的數(shù)量。結(jié)果，分離的富血小板血漿(PRP)中血小板(Platelet)的數(shù)量比基準(zhǔn)(Baselines)高5. 8_7. 6倍。在臨床所需建議中，每6mL體積的全血中需要的數(shù)量比基準(zhǔn)高4. 0-6. 0倍(約1000000個(gè)血小板/mL)。因此，所述富血小板血漿(PRP)的分離方法滿足了所述建議。另外，白細(xì)胞的數(shù)量比基準(zhǔn)高2. 8-4. 2倍。因此，在應(yīng)用所述富血小板血漿(PRP)時(shí)，預(yù)期能獲得抗病毒(antiviral effect)的效果。另外，如下表所示，將全血離心(第1次1750_1900g，3-5分鐘；第2次 4500-5000g, 4-6分鐘)兩次以分離出ImL的富血小板血漿(PRP)。然后，使血小板 (Platelet)特異性表面標(biāo)識(shí)(Surface maker)(即CD41)和白細(xì)胞(Leukocyte)特異性表面標(biāo)識(shí)(Surface maker)(即CD45)進(jìn)行反應(yīng)。然后，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Flow cytometry) 測量特定細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果，分離的富血小板血漿(PRP)中血小板(Platelet)的數(shù)量比基準(zhǔn)(Baselines)高5. 8-7. 6倍，且白細(xì)胞的數(shù)量比基準(zhǔn)高2. 8-4. 2倍。
表 權(quán)利要求
1.一種通過活化富血小板血漿(PRP =Platelet rich plasma)誘導(dǎo)組織再生的組合物的制備方法，該方法包括以下步驟從全血中分離富血小板血漿(PRP)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并且將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述從全血中分離富血小板血漿(PRP)的步驟包括下列步驟收集IOmL動(dòng)物或病人的全血放入含3. 2%檸檬酸鈉(Sodium citrate)的真空試管中， 并先離心收集的全血(1750-1900g)3-5分鐘；經(jīng)過所述離心，收集含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)；將收集的含有血沉棕黃層(軟膜Buffy coat)的上層清液(血漿層)通過鈍針(Blunt needle)轉(zhuǎn)移到新的真空試管中，并再次進(jìn)行離心(4500_5000g) 4_6分鐘；然后通過鈍針(Blunt needle)收集濃縮于底層(從試管底部到約為ImL的高度)的富血小板血漿(PRP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合的步驟中，通過三相連接器(Cormecta)將大約ImL從全血分離富血小板血漿(PRP)步驟中收集的富血小板血漿(PRP)與濃度為0. 30-0. 55mg/mL的氯化鈣溶液進(jìn)行一次混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與I型膠原混合的步驟包括下列步驟將所述I型膠原放置在室溫下；通過三相連接器(Cormecta)連接將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與濃度為20-50mg/mL不透明狀態(tài)的I型膠原混合四次；接下來將用注射器收取的所述富血小板血漿(PRP)和I型膠原的混合物注射到需要組織再生的所有部位，例如骨缺損治療和傷口愈合(wound healing)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述I型膠原具有20-50mg/mL的濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述I型膠原在室溫下放置15-30分鐘。
7.一種通過活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物，其特征在于，該組合物通過權(quán)利要求1所述的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過用氯化鈣溶液和Ⅰ型膠原的活化富血小板血漿(PRP)誘導(dǎo)組織再生的組合物及其制備方法。該方法包括以下步驟從全血中分離富血小板血漿(PRPPlatelet rich plasma)(下文稱作為“PRP”)；將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液混合；并將所述富血小板血漿(PRP)與氯化鈣溶液的混合物與Ⅰ型膠原混合。本發(fā)明公開的組合物可以具有含富血小板血漿(PRP)的凝膠型結(jié)構(gòu)，并且可被移植到任何需要組織再生的病區(qū)，例如骨缺損的治療和傷口愈合(wound healing)，因此，富血小板血漿(PRP)可被活化以誘導(dǎo)來自富血小板血漿(PRP)凝膠中的對組織再生有益的生長因子(growth factor)，從而方便快捷的實(shí)現(xiàn)有效的組織再生。所以，本發(fā)明公開的方法在大大提高將富血小板血漿(PRP)應(yīng)用到病區(qū)的可靠性并使消費(fèi)者呈現(xiàn)良好形象方面是極其有用的。
文檔編號(hào)A61F2/00GK102573943SQ200980162094
公開日2012年7月11日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者張?jiān)诘? 張晶皓, 樸株姬, 樸炫信, 李賽春, 柳志喆, 金勛, 金壯勛 申請人:世元世龍技術(shù)株式會(huì)社