本發(fā)明涉及藥物緩釋系統，具體涉及負載有替莫唑胺的緩釋系統及其制備方法和應用。

背景技術：

顱內腫瘤(亦稱腦腫瘤)分為原發(fā)性顱內腫瘤和繼發(fā)性顱內腫瘤。顱內腫瘤的發(fā)病率較高，就全身腫瘤的發(fā)病率而論居第五位(6.31％)，僅低于胃、子宮、乳腺、食道腫瘤。

膠質瘤是顱內最常見的原發(fā)性腫瘤，占顱內腫瘤的40％以上，發(fā)病率超過十萬分之五，是國人最常發(fā)生的十大腫瘤之一。膠質瘤中約70％為膠質母細胞瘤和間變性星形細胞瘤，惡性程度高，治療手段未取得突破性進展。目前膠質瘤的治療手段以手術治療為主，輔以放療、化療、靶向治療等綜合治療措施。但是惡性膠質瘤呈浸潤性生長，腫瘤組織與周圍正常腦組織之間分界不清，手術完全徹底切除腫瘤的可能性較小。大約超過90％的膠質瘤復發(fā)為瘤腔周圍2cm內的復發(fā),這就為控制膠質瘤生長提供了新思路，即“局部用藥”，術后一定時間內維持腫瘤局部一定濃度的治療藥物可能是使腫瘤靜止甚至消失、預防復發(fā)的有效方法。

目前的膠質瘤的化療方法有經靜脈和口服全身化療、介入化療及局部間質內化療,化療藥物主要有卡莫司汀、洛莫司汀、伊立替康、環(huán)磷酰胺、含鉑類藥物等。

替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是一種新型的咪唑四嗪類細胞周期非特異性口服烷化劑藥物，副作用較小，效果好，應用方便，近年來在國內外臨床上使用，為治療膠質瘤帶來了突破。雖然替莫唑胺的生物利用度較高，畢竟口服替莫唑胺是全身用藥，不可避免的會對全身其他臟器造成損傷，比如骨髓抑制等。臨床上，MGMT陰性患者比例還較高，往往需要加大替莫唑胺用量，且化療效果較差，而加大化療藥物劑量不可避免的會引起更多的毒性反應。

局部緩釋給藥可以提高局部藥物濃度，而全身影響較小，對于MGMT陰性患者來說更加有意義。局部緩釋給藥的重點在于緩釋和控釋兩方面，對于載體材料有較高要求。以可降解多聚體為藥物載體進行顱內惡性膠質瘤化療較為成熟的制劑是以PCPP:SA為載體的BCNU緩釋劑型，具有良好的生物相容性和可降解性，無細胞毒性。該緩釋劑采用聚對羧基苯氧丙烷-癸二酸共聚物(PCPP-SA)作為緩釋載體。1996年FDA批準了BCNU-PCPP:SA以商品名稱Gliadel上市，用于復發(fā)膠質瘤的輔助治療。2003年FDA批準了Gliadel用于惡性膠質瘤的首次手術治療，同時也有研究證實了對實驗性腦轉移癌和侵襲性垂體腺瘤的治療效果。但該緩釋劑在應用過程中存在一定缺陷，如細胞貼附力較弱，親水性差，酸性降解產物引起無菌性炎癥，在實驗及臨床應用中觀察到局部腦組織內炎細胞浸潤及腦水腫明顯，此外，在一些實驗過程中發(fā)現，此類降解材料的組織相容性較差，周圍疤痕組織形成明顯,容易影響緩釋藥物的擴散,降解的碎片無法及時吸收，在瘤腔內游動,有導致腦室系統堵塞的危險，這些缺陷限制了其在臨床的應用。

PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)具有良好的組織相容性，能夠控制微球大小、延緩藥物降解、延長藥物釋放時間、靶向釋放、降低藥物毒性和刺激性，是一種較好的緩釋藥物載體。

PLGA的分解產物是乳酸和乙醇酸，乳酸進入三羧酸循環(huán)代謝，以CO₂和H₂O的形式排出體外，乙醇酸以原形從腎臟排出或進入三羧酸循環(huán)代謝，以CO₂和H₂O的形式排出體外。另外可以通過調節(jié)PLA和GA的比例，調節(jié)緩釋系統的降解時間，乳酸的疏水性比甘醇酸更強，因此乳酸含量高的PLGA復合聚合體親水性差，吸收水分少，降解速率慢。PLGA降解的三個步驟：1、鏈隨機剪切，聚合體分子量明顯降低，沒有可溶性單體產物產生；2、分子量和體積迅速降低，可溶性寡聚體和單體形成；3、寡聚體片斷形成可溶性單體，整個聚合體溶解。

對應PLGA降解的三個階段，微球中藥物釋放也可以分為三個時期：(1)從微球表面或孔隙中快速的釋放，突釋現象一般發(fā)生在這一時期；(2)伴隨聚合體降解的緩慢藥物釋放，這一時期是決定緩釋時間長短、維持藥物有效濃度、發(fā)揮藥物療效的主要時期；(3)聚合體蝕解后釋放加快，藥物濃度會出現一個較低的峰值。其中第一階段快速釋放可能就是造成微球突釋現象的原因。親水性藥物與PLGA容易結合，疏水性藥物與PLGA結合較疏散

微球載體是一種微米級尺寸的微粒藥物載體遞送系統。將藥物包封于微粒中，可以調節(jié)釋藥的速度，增加生物膜的透過性、改變在體內的分布、提高生物利用度等。

鑒于目前局部給藥治療顱內腫瘤特別是膠質瘤的藥物系統中存在的多種缺陷，本發(fā)明以PLGA為載體，以替莫唑胺為抗腫瘤藥物，成功合成了TMZ-PLGA緩釋微球，并經過體外細胞及大鼠C6在體的抑瘤研究發(fā)現TMZ-PLGA緩釋微球具有很好的治療顱內腫瘤特別是膠質瘤的作用。

技術實現要素：

本發(fā)明提供一種替莫唑胺緩釋系統，其包括PLGA緩釋微球和包封在所述PLGA緩釋微球內的替莫唑胺，其中所述PLGA緩釋微球由乳酸和羥基乙酸共聚物構成。

在一些實施方案中，PLGA緩釋微球中的乳酸：羥基乙酸的單體比例范圍為10:90～90:10，優(yōu)選25:75～75:25，更優(yōu)選40:60～60:40，例如50:50。

在一些實施方案中，PLGA緩釋微球的分子量范圍為1000～100000；優(yōu)選2000～80000，更優(yōu)選4000～60000，更優(yōu)選10000～50000，更優(yōu)選15000～36000，更優(yōu)選20000～33000。

在一些實施方案中，所述替莫唑胺緩釋系統的包封率大于50％，優(yōu)選大于60％，更優(yōu)選大于70％，更優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，最優(yōu)選大于94％。

在一些實施方案中，所述替莫唑胺緩釋系統的替莫唑胺載藥量為1％～20％，優(yōu)選2.5％～10％，更優(yōu)選5％～7.5％，例如7.5％。

在一些實施方案中，所述替莫唑胺緩釋系統在體內持續(xù)釋放替莫唑胺的時間大于14天。

在一些實施方案中，所述替莫唑胺緩釋系統在體內持續(xù)釋放14天的替莫唑胺殘留量小于10％。

在一些實施方案中，所述替莫唑胺緩釋系統的二氯甲烷殘留量低于1％，優(yōu)選低于0.6％。

本發(fā)明還提供一種制備所述替莫唑胺緩釋系統的方法，包括以下步驟：

1)將替莫唑胺晶體溶于甲醇，將PLGA共聚物溶于二氯甲烷；和

2)將上述兩種溶液混合，得到的有機相在含聚乙烯醇的溶液中攪拌乳化，直至二氯甲烷、甲醇完全揮發(fā)。

在一些實施方案中，攪拌乳化的攪拌速率為200～1500rpm，優(yōu)選350～800rpm。

在一些實施方案中，攪拌乳化過程分為兩步，在第一步中攪拌速率為800～1500rpm，在第二步中攪拌速率為200～350rpm。

在一些實施方案中，可以在攪拌乳化過程中進行加熱或減壓。

在一些實施方案中，可以在攪拌乳化過程中添加助劑，例如乳化劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑等。

本發(fā)明還提供一種所述替莫唑胺緩釋系統用于治療顱內腫瘤，例如膠質瘤的應用。

如無具體指明，本發(fā)明中的百分含量均為質量百分含量。

附圖說明

圖1-4是不同分子量的PLGA的直徑的分布圖。

圖5是光學顯微鏡下的緩釋微球。

圖6是電子顯微鏡下的緩釋微球。

圖7是不同載藥量緩釋微球的藥物釋放曲線。

圖8是不同分子量緩釋微球的藥物釋放曲線。

圖9是TMZ-PLGA緩釋微球作用于C6細胞導致的細胞活性變化柱狀圖。

圖10-12是緩釋微球在第1、8、14天的TMZ含量。

圖13是TMZ-PLGA-緩釋微球顱內釋放曲線。

圖14是wistar大鼠c6膠質瘤模型大體形態(tài)。

圖15-19是T1-5組大鼠用藥前后的MRI掃描圖。

圖20是各組大鼠生存曲線(天)(K-M法)。

圖21-22是TMZ-PLGA緩釋微球植入組腫瘤組織的切片圖。

圖23是TMZ-PLGA緩釋微球植入組的PCNA表達圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明進一步詳細說明。

實施例1-替莫唑胺緩釋微球的制備及分析：

(1)用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備替莫唑胺-PLGA緩釋微球：PLGA分子量分別為15000、20000、33000、36000。TMZ晶體溶于甲醇，PLGA聚合體溶于二氯甲烷，兩溶液混合，得到的有機相在含聚乙烯醇的溶液中攪拌乳化，室溫下攪拌(800r/min)，30min后攪拌速度變?yōu)?50r/min，直至二氯甲烷、甲醇完全揮發(fā)。得到的微球以蒸餾水洗，過篩，除去大顆粒，冷凍干燥，隨機封包0℃冷藏。首先用顯微鏡觀察四種緩釋微球的表面形態(tài)特征，繼而用TOSHIBA800S掃描電鏡(見圖5、6)，按公式l計算微球平均直徑：

Vn_i是每5μm跨度范圍內微球數目，d_i是在該范圍內微球粒徑的平均值。

替莫唑胺-PLGA緩釋微球結構穩(wěn)定、大小均勻，微球的載藥量和微球直徑沒有相關性，分子量越大的PLGA在同等制備條件下，制備的微球直徑越大，不同分子量的TMZ-PLGA的直徑見表1，圖1,2,3,4。

PLGA的分子量超過36000時，則微球的尺寸會超過100微米，導致尺寸過大，不利于釋放控制，而且在釋放后期殘留替莫唑胺過多，會導致后期突釋現象；而分子量低于15000時，則微球尺寸會過小，導致前期突釋現象突出，不利于平緩釋放藥物。

表1不同分子量的PLGA的LA/GA比值、微球直徑和包封率

(2)載藥量和包封率的測定：采用高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算載藥量和包封率(見表1)。微球的載藥量＝：(微球中藥物含量/微球重量)*100％，包封率＝(微球中藥物含量/投藥量)*100％。

(3)體外緩釋的研究：將不同載藥量(2.5％、5％、7.5％及10％)TMZ-PLGA緩釋微球放入PBS溶液中，分別于1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、240h、360h，480h取出樣品，用高效液相色譜法測出不同時段2.5％、5％、7.5％及10％TMZ-PLGA緩釋微球剩余的TMZ量，計算TMZ釋放量，繪制體外釋放曲線(見圖7、8)。結果顯示TMZ-PLGA緩釋微球可以持續(xù)釋放2周以上，在2周時緩釋微球TMZ剩余量仍有10％，根據文獻報道，符合間質內化療所要求的時限。雖然本實驗優(yōu)化生產手段，盡可能降低微球突釋現象，但是釋放曲線顯示TMZ-PLGA緩釋微球可以持續(xù)有效釋放2周以上，符合間質內化療所要求的周期。二氯甲烷殘留量測定結果：樣品二氯甲烷殘留量為5.70‰，低于國外文獻報道的3％，達到了顱內應用的要求。

根據上述實驗結果，可見載藥量越高，則前期釋放藥物越多導致顯著突釋現象。因此，載藥量以不超過10％為宜，優(yōu)選不超過7.5％。如果載藥量低于2.5％，則導致藥物釋放不足，需要較多的載體，而載體含量過多容易發(fā)生不良反應，因而不利于實現治療效果。

因此，本發(fā)明首次發(fā)現了替莫唑胺緩釋微球系統中，PLGA聚合物分子量和微球載藥量與替莫唑胺藥物緩釋釋放之間的關系，通過適當地選擇PLGA的分子量和微球的載藥量可以較好地平衡替莫唑胺的緩釋和控釋，使得本發(fā)明所制備的微球具有包封率高、載藥量適中、穩(wěn)定性高、突釋現象不明顯、聚集不明顯、分散性好、體外釋放速度穩(wěn)定等優(yōu)勢。

實施例2-TMZ-PLGA緩釋微球對C6膠質瘤細胞的作用研究。

(1)細胞的培養(yǎng)：用移液槍將膠質瘤C6細胞移至培養(yǎng)瓶內，加入2.5ml含10％小牛血清的EMDM培養(yǎng)基，放入CO₂細胞培養(yǎng)箱內。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)。觀察細胞生長面積占培養(yǎng)瓶底90％以上時進行傳代。清除培養(yǎng)瓶內殘留培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶1ml，利用倒置相差顯微鏡觀察，發(fā)現C6細胞變圓、透亮，立即加入2ml含10％小牛血清的新鮮培養(yǎng)基。用移液槍將細胞從培養(yǎng)瓶底吹落。將1瓶細胞懸液平均分到3個培養(yǎng)瓶中，再分別加入2ml10％小牛血清的新鮮培養(yǎng)基，最后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)細胞活性的測定：將已培養(yǎng)的膠質瘤C6細胞移至96孔板：按照每孔10000個細胞，200μL培養(yǎng)基，即細胞密度為5*10⁴個/m1，每板共7*10個孔。將樣品分為二組：試驗組(替莫唑胺-PLGA緩釋微球，按載藥量分為2.5％、5％、7.5％及10％組，每孔加入0.5mg樣品)和空白對照組(單純PLGA)。MTT法檢測第1、2、3d的膠質瘤C6細胞的細胞活性(見表2，圖9)。結果顯示不同載藥量的TMZ-PLGA緩釋微球均能降低細胞活性，載藥量7.5％和10％的兩組效果優(yōu)于2.5％、5％兩組，7.5％與10％組結果接近，但7.5％的突釋現象較輕，因此初步判斷載藥量在7.5％左右時，微球能夠達到預期的療效。

表2TMZ-PLGA緩釋微球作用于C6細胞導致的細胞活性變化(％，n＝3)

(3)TMZ-PLGA緩釋微球的抑瘤作用：細胞培養(yǎng)并傳代后，將樣品分為二組：實驗組、空白對照組。試驗組：加入替莫唑胺-PLGA緩釋微球，按載藥量分為2.5％、5％、7.5％及10％組；空白對照組：單純PLGA，(其中一半樣品用多參數流式細胞儀分析細胞凋亡率)。結果顯示2.5％、5％、7.5％及10％TMZ-PLGA緩釋微球作用于膠質瘤C6細胞后流式細胞儀檢測證實各個實驗組均對C6細胞有殺滅作用，并且隨載藥量增加效果增強。2.5％組與7.5％組、5％組與7.5％組、2.5％組與10％組、5％組與10％組有明顯的統計學差異，7.5％組與10％組無明顯的統計學差異。證實在一定范圍內載藥量越高，抑制膠質瘤細胞生長的作用越大。

(4)TMZ-PLGA緩釋微球對C6膠質瘤細胞凋亡作用的研究：2.5％、5％、7.5％及10％TMZ-PLGA緩釋微球作用后8h、1d、2d、3d、4d、7d、14d流式細胞儀檢測結果(見表3)，對照組細胞凋亡率3.02±0.24，試驗組不同載藥率TMZ-PLGA緩釋微球作用于C6細胞誘導的細胞凋亡率幾乎均高于對照組(P<0.05)(見表3)。

表3TMZ-PLGA緩釋微球作用于C6細胞誘導的細胞凋亡率(％，n＝3)

實施例3-TMZ-PLGA緩釋微球的體內釋放及其對大鼠C6膠質瘤的作用研究。

(1)TMZ-PLGA緩釋微球體內釋放研究：將7.5％的TMZ-PLGA緩釋微球置于大鼠顱腦表面硬膜下，分別于1、2、3、5、8、11、14、18天后取出片劑，采用高壓液相色譜儀分別測出不同TMZ藥物濃度下對應的峰值面積，計算出藥物濃度及微球中剩余TMZ含量，推算出TMZ釋放量(參見圖10-12)。對于TMZ藥物濃度的檢測，出峰時間約5min，相對穩(wěn)定(如圖10,11,12)。以藥物釋放率(P％)對藥物時間(t)進行直線回歸得出回歸方程為P＝4.2932t+30.5916，r2＝0.9111，繪制出TMZ-PLGA緩釋微球的大鼠顱內釋放曲線(如圖13)。從TMZ-PLGA緩釋微球顱內釋放曲線說明藥物緩釋系統釋放率百分數于4天時達50％以上，14天以后釋放率達到90％，但仍有10％的藥量持續(xù)釋放。為了保證緩釋藥物的療效，必須使得緩釋藥物能在有效濃度下持續(xù)釋放2周及2周以上。本實驗結果說明TMZ-PLGA緩釋微球在大鼠顱內可以釋放達14天以上，同時前期實驗證實TMZ-PLGA緩釋微球于體外釋放可達14天以上，滿足了TMZ-PLGA具備藥物顱內外緩釋作用的基本要求。

(2)大鼠C6膠質瘤模型的復制：圖14是wistar大鼠c6膠質瘤模型大體形態(tài)。使用立體定位儀并根據Batker法中的描述確定大鼠尾狀核位置，微量注射器抽取細胞濃度為1×106/10ul C6膠質瘤細胞懸液10ul緩慢注入大鼠尾狀核位置，進針深度為距硬膜6.0mm，回退1.0mm。7天后使用3.0T核磁共振行大鼠頭顱MRI掃描，掃描序列均為T1像、T2像及增強掃描。實驗大鼠批次為7次，共制備大鼠膠質瘤模型60只。MRI顯示52只于右側尾狀核頭處出現異常信號，計算判斷出大鼠成瘤率達86.7％，膠質瘤模型成瘤情況滿意，可以滿足實驗需求。(載瘤大鼠的成瘤率＝：(成瘤個數/總數)×100％)。

(3)TMZ-PLGA緩釋微球對大鼠C6膠質瘤的抑瘤作用：將載瘤大鼠隨機分為五組：將50只大鼠隨機分為5組，T1組：TMZ-PLGA緩釋微球植入組(劑量為20mg)，T2組：TMZ植入組(劑量為1.5mg)，T3組：PLGA植入組，T4組：TMZ口服組(總口服劑量為100mg/只)，T5組：空白對照組(植入生理鹽水)。大鼠口服TMZ劑量設置為500mg/kg/只，可以達到較強治療效果，此外，本實驗采用20mg緩釋片劑作為研究單元，可以在顱內穩(wěn)定釋放14天以上，據相關文獻報道對緩釋藥物的要求，符合局部間質內緩釋劑用藥要求。將C6膠質瘤藥瘤鼠種瘤處植入不同藥物術后7天及16天進行MRI掃描(見圖15-19)，采用3Dslicer技術計算給藥前后腫瘤體積(見表4)，各組間進行方差分析：T1組與其余各組相比較，p值均小于0.05,均具有統計學意義，說明替莫唑胺緩釋微球植入組可以明顯抑制腫瘤體積的增長。T2組和T5組、T4組和T5組比較p值也小于0.05，具有統計學意義，可以認為局部植入替莫唑胺或口服替莫唑胺可以一定程度上延緩腫瘤的增長。同時計算各組載瘤大鼠中位生存時間及平均生存時間(見表5),載瘤大鼠生存情況觀察：TMZ-PLGA緩釋微球植入組(T1組)于25天時開始死亡，最長存活時間為47天，TMZ植入組(T2組)于21天時開始死亡，最長存活時間為31天，PLGA植入組(T3組)于19天時開始死亡，最長存活時間為30天，TMZ口服組(T4)于23天時開始死亡，最長存活時間為35天，空白植入組(T5)于18天時開始出現死亡，最長存活時間為30天。根據大鼠的生存時間，采用乘積極限法(K-M)描繪生存曲線(如圖20)，各組大鼠生存率的比較采用時序檢驗(log-rank檢驗)，差異具有統計學意義(χ2＝15.093，P＝0.0045<0.05)。綜上可知TMZ-PLGA緩釋微球植入顱腦局部間質可以顯著提高荷瘤大鼠生存率，延長其生存期，具有顱內抗Wistar大鼠C6膠質瘤作用。

表4各組大鼠顱內腫瘤體積比較(mm³)

表5各組大鼠生存期

(4)載瘤大鼠腫瘤病理學研究：載瘤大鼠成瘤后斷頭取腦，置入4％多聚甲醛固定(濃度：4％，溫度：4℃)24h，經梯度酒精脫水、浸蠟、石蠟包埋后切片，片厚6μm。進行hematoxylin-eosin staining(HE)染色，并進行免疫組化(SABC法)檢測。腫瘤HE染色顯示：大鼠腫瘤組織細胞密集、增殖活躍，細胞核存在明顯異型性，細胞核增大濃染，部分腫瘤可見出血、壞死(如圖21、22)。

(5)TMZ-PLGA緩釋治療大鼠C6膠質瘤PCNA基因的探討：PCNA是存在于細胞核中一種多肽，于分裂細胞中呈高表達狀態(tài)，可以作為腫瘤或正常組織處于分裂增殖過程中的標致，間接反映腫瘤細胞增殖代謝水平，用于評估顱內膠質瘤的惡性程度[36-38]，即PCNA指數越高，腫瘤細胞增殖代謝越旺盛，腫瘤生長速度約快，膠質瘤患者生存期越短，腫瘤的惡性程度越高。PCNA免疫組化顯示腫瘤細胞核呈棕色(如圖23)，各組大鼠腫瘤標記指數(Pl＝陽性細胞數/1000xl00％)平均數分別為59.4％、68.7％、71.1％、69.3％、70.3％。各組間進行方差分析：T1組與其余各組差異均具有統計學意義，各組間PCNA差異無統計學意義，證明替莫唑胺緩釋微球植入組較其他各組可以顯著降低腫瘤PCNA的表達，可能與T1組大鼠膠質瘤較好的預后、生存期的提高有關。

所屬領域的普通技術人員應當理解：以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。