專利名稱：治療人腫瘤細(xì)胞藥替莫唑胺的增效方法
背景技術(shù)：
已發(fā)現(xiàn)替莫唑胺，即8-氨基甲酰基-3-甲基咪唑并[5，1-d]-1，2，3，5-四嗪-4-(3H)-酮，(CCRG81045，NSC362856)有很好的抗腫瘤特性，見Newlands等，Br.J.Cancer，65287(1992)。臨床上，替莫唑胺對星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑素瘤及蕈樣真菌病都有治療作用。其重復(fù)劑量給藥方案效果最佳。
甲基化O6-烷基鳥嘌呤[例如，通過與MTIC(有活性的甲基化替莫唑胺類化合物)反應(yīng)得到的]，被蛋白O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(ATase)修復(fù)。以甲基化試劑(例如Zlotogoski等，Carcinogenesis，583，1984；Gibson等，Cancer Res.，464995 1986)，O6-甲基鳥嘌呤(例如，Dolan等，Biophys.Res.Commun.，132178 1985)或O6-苯甲基鳥嘌呤(O6-BG，Dolan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，875368，1990)預(yù)處理ATase表達(dá)細(xì)胞，表明增加了氯乙基化試劑的細(xì)胞毒作用，而對不表達(dá)ATase的細(xì)胞幾乎觀察不到這種致敏作用。
Moschel.Dolan及Pegg，在美國專利5,091,430中指出ATase活性的暫時(shí)降低正是提高氯乙基化試劑效力所需要的。又如，PCT申請公開WO91/13898指出當(dāng)甲基羅氮芥(Me CCNU)與SF767細(xì)胞系中O6-苯甲基鳥嘌呤結(jié)合時(shí)，其ED50下降了3.8倍。因此，Moschel等指明了當(dāng)一種烷化劑與一種烷基化轉(zhuǎn)移酶的消耗劑聯(lián)合使用時(shí)，其抗腫瘤活性有整體上的提高。
本發(fā)明與早期工作相比取得了驚人的且非顯而易見的進(jìn)步，即通過使用特定劑量給藥方案配以ATase抑制劑，替莫唑胺的化療效果急劇增加(對MAWI細(xì)胞系高達(dá)300倍)。因此，以往對替莫唑胺治療不敏感或只輕度敏感的人細(xì)胞癌癥，現(xiàn)在可用替莫唑胺與ATase抑制劑聯(lián)合加以治療。
綜上所述，本發(fā)明的主要目的是提供組合物和方法以改善和拓寬替莫唑胺作為抗腫瘤劑的治療效果，具體手段是用增效劑，即O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(ATase)的抑制劑進(jìn)行結(jié)合治療。
本發(fā)明的另一目的是提供使用這些組合物及方法的治療方案，以使替莫唑胺對人癌細(xì)胞的毒性適量增加。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供替莫唑胺重復(fù)給藥的治療方案，該方案是通過ATase抑制劑提前或伴隨給藥來增強(qiáng)療效。
本發(fā)明最后的目的是提供一種方法，該方法是通過確定特定人癌細(xì)胞產(chǎn)生的ATase數(shù)量，測定所述細(xì)胞的ATase抑制劑對替莫唑胺毒性的相對增效程度。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(ATase)抑制劑使替莫唑胺對人癌細(xì)胞的毒性增效的方法。進(jìn)一步提供一種適于最佳治療的給藥方案，以及一種確定潛在的對替莫唑胺敏感的人癌細(xì)胞的方法。
附圖的簡要說明

圖1替莫唑胺(■)和CCNU(×)的細(xì)胞毒性(IC50)對下列人腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞ATase水平(以ATase增加為序)的圖ZR-75-1，U87MG，U373，LS174T，LOVO，MCF-7及MAWI。
圖2在pZipneoSV(X)1-轉(zhuǎn)染的(○、■)或phAT-轉(zhuǎn)染的(、▲)XP衍生細(xì)胞系中，當(dāng)存在(■、▲)或不存在(O、)10μM BG時(shí)，替莫唑胺的細(xì)胞毒性。誤差范圍+/-1標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖3MAWI(×)，MCF-7()或U373(≠)人腫瘤細(xì)胞系重復(fù)每日劑量替莫唑胺的細(xì)胞毒性比率圖，只使用替莫唑胺的IC50(-BG)與先用BG孵育的IC50(+BG)的比較。
圖4增大替莫唑胺濃度對下列人腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)Tase水平的影響圖LOVO(□)、MAWI(×)、MCF-7()、U373(≠)。
圖5 4℃時(shí)，14C標(biāo)記的替莫唑胺處理的細(xì)胞對放射標(biāo)記物的攝入圖，MAWI(□)、ZR-75-1(×)。
本發(fā)明的詳細(xì)說明替莫唑胺是適用于治療人體癌癥的抗腫瘤劑，其毒性可通過與增效劑(即O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(ATase)的抑制劑)聯(lián)合使用得以大幅度提高。使用諸如O6-苯甲基鳥嘌呤(BG)的ATase抑制劑尤其可以增加替莫唑胺的毒性，例如對MAWI細(xì)胞系，當(dāng)使用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的給藥方案時(shí)可使其毒性增加至300倍，并且使替莫唑胺能用于以往對其不敏感或只是輕度敏感的人體癌癥的化療。
在許多人腫瘤細(xì)胞系中可以看出，替莫唑胺及羅氮芥(CCNU)的毒性類似，都與ATase含量有關(guān)。替莫唑胺對DNA鳥嘌呤的O6位的甲基化造成細(xì)胞毒損傷。通過對人癌細(xì)胞進(jìn)行其相應(yīng)的ATase產(chǎn)量的篩選，便能確定其對替莫唑胺的敏感性。ATase產(chǎn)生量大的細(xì)胞比ATase產(chǎn)生量小的細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性低。
用單劑量BG預(yù)處理細(xì)胞，替莫唑胺毒性增加幅度較小(＜4倍)替莫唑胺及羅氮芥(CCNU)提高幅度的數(shù)量級相似。在細(xì)胞群落試驗(yàn)中，人ATase cDNA轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞以BG預(yù)處理時(shí)，盡管其ATase蛋白已被除去，但其對替莫唑胺的抗藥性仍比對照組中轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞強(qiáng)。這似乎并非是由于替莫唑胺轉(zhuǎn)運(yùn)的不同，可能只反映了phAT成纖維細(xì)胞ATase的再合成抵消了抑制劑預(yù)處理的效果。
然而，更令人驚奇的是，MAWI細(xì)胞系在預(yù)處理5天后，BG對替莫唑胺毒性顯示了較強(qiáng)的增效(高達(dá)約300倍)。在含有高水平ATase的MCF-7細(xì)胞中也觀察到相近的增大幅度，但在ATase水平低的U373細(xì)胞中只有很小的作用。對MAWI及MCF-7細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果意味著ATase抑制劑的持續(xù)存在導(dǎo)致DNA損傷加劇。
因而本發(fā)明提供了一種通過施用ATase抑制量的ATase抑制劑增加替莫唑胺對人癌細(xì)胞毒性的方法，并且提供了含有替莫唑胺和ATase抑制劑的產(chǎn)品作為聯(lián)合制劑，該制劑可在上述治療人癌細(xì)胞時(shí)，同時(shí)，分別或連續(xù)用藥。
優(yōu)選的ATase抑制劑的給藥方式是在幾天內(nèi)或多日內(nèi)重復(fù)用藥，且在替莫唑胺給藥前施用。重復(fù)劑量可在1、2、3、4或5天時(shí)給藥，4或5天是優(yōu)選的治療周期。
進(jìn)一步和最優(yōu)選的是，在幾天內(nèi)以重復(fù)劑量給患者施用替莫唑胺，在每次替莫唑胺給藥前施用ATase抑制量的ATase抑制劑。這導(dǎo)致替莫唑胺對人癌細(xì)胞的毒性顯著增強(qiáng)，例如，對MAWI細(xì)胞系增大約300倍。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，ATase抑制劑以ATase抑制量給藥，即當(dāng)ATase抑制劑與替莫唑胺伴隨使用時(shí)，給藥量足以致敏體內(nèi)腫瘤細(xì)胞而不引起正常組織的異常致敏。
本發(fā)明ATase抑制劑的用量依治療腫瘤細(xì)胞所需有效劑量而定。恰當(dāng)?shù)膭┝渴鞘贡恢委熌[瘤細(xì)胞中的ATase抑制劑達(dá)到致使ATase喪失活性的濃度，例如，化療前使用的劑量約為1-2000mg/kg，優(yōu)選為約10-800mg/kg 。
替莫唑胺特別適于治療的腫瘤包括癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，尤其適用于星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑素瘤、蕈樣真菌病、尤因瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病及肺和乳腺腫瘤。對于乳腺腫瘤、星形細(xì)胞瘤及結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞，ATase抑制劑特別顯著地提高替莫唑胺的活性。
替莫唑胺的典型劑量范圍按體重每天一般在0.1至200mg/kg之間，優(yōu)選1至20mg/kg，或按體表面積每天約40-400、優(yōu)選約150-300mg/m2。
ATase抑制劑的增效量取決于特定癌細(xì)胞中ATase的常規(guī)存在量。若癌細(xì)胞的ATase水平高，則先行施用ATase抑制劑增效更顯著。
本發(fā)明可使用的ATase抑制劑是已知具有這種活性的那些物質(zhì)，例如O6-烷基鳥嘌呤類如O6-甲基鳥嘌呤，鏈烯基鳥嘌呤類如O6-烯丙基鳥嘌呤，O6-芳基鳥嘌呤類如O6-苯甲基鳥嘌呤及O6-苯甲基化的鳥嘌呤，鳥嘌呤核苷和2′-脫氧鳥嘌呤核苷化合物，這些記載于PCT國際申請WO91/13898(1991年9月19日出版)中。特別適用于本發(fā)明的是O6-苯甲基鳥嘌呤。
ATase抑制劑的具體劑量取決于被治療癌細(xì)胞中常規(guī)的ATase含量、患者的年齡和狀況及所使用的ATase抑制劑的具體種類。
替莫唑胺最優(yōu)選的給藥方式為連續(xù)幾天中使用重復(fù)劑量。本發(fā)明的顯著增效作用由高度優(yōu)選的治療方案實(shí)現(xiàn)，這包括在每劑量替莫唑胺給藥之前或同時(shí)施用ATase抑制劑量的ATase抑制劑。優(yōu)選O6-苯甲基鳥嘌呤作為ATase的抑制劑以每天150-300mgm-2的劑量與替莫唑胺聯(lián)合用藥，所述劑量分成4或5個(gè)單獨(dú)劑量給藥，連續(xù)用藥4或5天(總量750-1500mgm-2)。優(yōu)選每劑量替莫唑胺用藥前2-8小時(shí)施用每劑量ATase抑制劑。這使替莫唑胺的毒性得以最大程度地增強(qiáng)，并對患者的特定腫瘤提供最有效的治療。最優(yōu)選的是，此治療方案在間隔約4周后重復(fù)進(jìn)行。
替莫唑胺和O6-苯甲基鳥嘌呤的另一種用藥方案為連續(xù)方式，其中在不少于4天的期間內(nèi)以每天為基礎(chǔ)施用這兩種藥物，這種聯(lián)合治療可根據(jù)需要而持續(xù)至癥狀緩解。
此外，特定人癌細(xì)胞的ATase生成量可以用作一種篩選方法，用以確定替莫唑胺對所述細(xì)胞毒性的增效作用。在優(yōu)選的方法中，例如，通過Lee等在Cancer Res.，51619(1991)中提供的方法，檢測特定細(xì)胞系的ATase含量，并確定對替莫唑胺潛在的敏感性。這就能在治療方案中使替莫唑胺和ATase抑制劑恰當(dāng)?shù)亟Y(jié)合施用。
用本發(fā)明所述化合物制備藥物組合物所用的惰性可藥用載體可以是固體或液體。固體劑型包括粉末、片劑、分散顆粒劑、膠囊劑、扁囊劑及栓劑。粉末和片劑可含約5-70％的活性成分。適合的固體載體是現(xiàn)有技術(shù)已知的，例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、糖、乳糖。片劑、粉末、扁囊劑及膠囊劑可作為適于口服的固體劑型。
制備栓劑時(shí)，首先將低熔點(diǎn)的臘如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔化，并通過攪拌使活性成分均勻地分散在其中。再將熔融的均勻混合物注入適當(dāng)尺寸的模子中，使其自然冷卻固化。
液體劑型包括溶液劑、混懸劑和乳劑?？梢蕴峒暗氖牵绶悄c道注射用的水溶液或水-丙二醇溶液劑。
在使用前即刻轉(zhuǎn)化成液體制劑、用以口服或非腸道給藥的固體劑型也包括在內(nèi)。所述的液體制劑包括溶液劑、混懸劑和乳劑。
本發(fā)明的化合物也可透皮給藥。透皮給藥的組合物可以是霜?jiǎng)?、洗劑、氣霧劑和/或乳劑，也可將其包含在一種透皮膏藥的基質(zhì)中或藥物貯庫中，這是本技術(shù)領(lǐng)域達(dá)此目的的慣用手段。
優(yōu)選單位劑量形式的藥物制劑。其中，制劑被細(xì)分成包括適量活性成分(例如達(dá)到所需目的的有效量)的單位劑量。
單位劑量制劑中活性化合物的量可在約0.1mg至1000mg之間變化或調(diào)整，依特定需要更優(yōu)選約1mg至500mg。
所用的實(shí)際劑量可依據(jù)病人的需要及被治病癥的嚴(yán)重程度而變化。確定具體情況所用的適合劑量是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。為方便起見，若需要，則每天的總藥量可以分成幾部分給藥。
替莫唑胺可按常規(guī)技術(shù)給藥，如Wasserman等在Cancer，361258-1268(1975)中所述。如果合適，以每天40-400mgm-2、優(yōu)選每天150-300mgm-2的劑量口服給藥，以1～5個(gè)劑量、優(yōu)選4-5個(gè)劑量，經(jīng)過連續(xù)1-5天，優(yōu)選連續(xù)4-5天給藥。此方案最為優(yōu)選。以日劑量25-250mgm-2靜脈注射給藥對于連續(xù)給藥治療方案來說是優(yōu)選的。重復(fù)劑量方案可采用口服給藥方式。
ATase抑制劑可在施用替莫唑胺之前或同時(shí)給藥。如需要，則ATase抑制劑和替莫唑胺可以結(jié)合成一個(gè)單位劑量形式以便于病人用藥。這種結(jié)合劑量形式可以是上述任何一種劑型，但如前所述，優(yōu)選口服或靜脈注射形式。
替莫唑胺和ATase抑制劑可包裝成藥盒。其中，針對特定用藥途徑，替莫唑胺和ATase抑制劑分別制成特定劑型，并附有用藥量說明。在口服制劑的典型實(shí)施例中，此藥盒中的替莫唑胺和ATase抑制劑的口服劑型可分別裝在泡囊包裝(blister package)內(nèi)。
任何對劑量的必需調(diào)整很容易滿足個(gè)別病人的化療要求，而此調(diào)整應(yīng)由熟練技術(shù)人員完成。
通過下列制備實(shí)施例舉例說明本發(fā)明，但這不能被當(dāng)做對本發(fā)明所公開范圍的限制。
實(shí)施例1材料和方法材料組織培養(yǎng)基購自1CN Biomedicals Ltd.(High Wycombe，UK)、胎牛血清購自Gibco Ltd.(Paisley，UK)。O6-苯甲基鳥嘌呤(BG)由Dr.R.C.Moschel(NCI-Frederick Cancer Research& Development Center，F(xiàn)rederick，Maryland，USA)無償提供，替莫唑胺及它的氯乙基類似物咪托唑胺(8-氨基甲?；?3-(2-氯乙基)咪唑并(5，1-d)-1，2，3，5-四嗪-4-(3H)-酮)由May and Baker Ltd.(Dagenhan，UK)合成并以DMSO的溶液形式貯存于-70℃。其它一切化學(xué)藥品購自Sigma ChemicalCo.Ltd.(Poole，UK)。
細(xì)胞毒性研究細(xì)胞系在DMEM及10％胎牛血清、25mM HEPES、谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素中以單細(xì)胞層常規(guī)生長。細(xì)胞毒性試驗(yàn)在富含HEPES的培養(yǎng)基中，在5％CO2氣氛中進(jìn)行。在96孔板上每孔植750-1000個(gè)細(xì)胞，過夜孵育，用或不用33μM BG處理2小時(shí)。在上述培養(yǎng)基中加入替莫唑胺或CCNU 1小時(shí)，DMSO最終濃度不能超過1％。細(xì)胞在新鮮的培養(yǎng)基上再生長7天，用NCI硫氰化胺試驗(yàn)測定蛋白含量，(見Skehan等，J.Natl.Cancer Inst.，821107(1990))；生長研究表明試驗(yàn)過程中細(xì)胞以對數(shù)相生長，替莫唑胺重復(fù)給藥方案中，細(xì)胞被連續(xù)處理24小時(shí)，每天都換新鮮培養(yǎng)基。測定試驗(yàn)至少重復(fù)一次。
人ATase cDNA轉(zhuǎn)染的或?qū)φ盏腦P細(xì)胞[Fan等，NucleicAcid Res.，185723(1990)]在MEM中生長，每孔植1000個(gè)細(xì)胞。孵育3小時(shí)后，馬上將替莫唑胺稀釋到MEM中，加入上述培養(yǎng)基中后再孵育5天。按Morten等在Carcinogenesis，13483(1992)中描述的方法測其存活量。在BG實(shí)驗(yàn)中，將300個(gè)細(xì)胞植在9cm板上一式三份，使其保持5小時(shí)。BG(10μM，于MEM中)在用替莫唑胺處理前3小時(shí)加入，替莫唑胺須立即稀釋到含10μM BG的MEM中。7天后，對細(xì)胞群落進(jìn)行吉母薩染色并計(jì)數(shù)。
O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶測定本試驗(yàn)依Lee等在Cancer Res.，51619(1991)中所述的方法進(jìn)行。于是，將不同量的細(xì)胞提取物與DNA一起孵育，此DNA含有甲基基團(tuán)以[3H]標(biāo)記的O6-甲基鳥嘌呤，優(yōu)選在37℃、在含總?cè)莘e300μl，濃度為1mg/ml胎牛血清白蛋白的緩沖液1中孵育2小時(shí)。孵育后，將胎牛血清白蛋白(100μl，在緩沖液1中的濃度為10mg/ml的溶液)及高氯酸(100μl，4M溶液)快速順序加入。再加入1M高氯酸2ml，混合物在75℃加熱40分鐘，將DNA降解為可溶性酸性物質(zhì)，含有甲基化ATase的蛋白質(zhì)通過離心收集，用4ml 1M高氯酸洗滌后，再懸于300μl 0.01M NaOH溶液中，然后溶于3ml閃爍水液中(Ecoscint ANational Diagnostics)，并且計(jì)數(shù)。細(xì)胞蛋白含量通過BioRad蛋白檢測試劑盒測定，用胎牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，ATase活性以每mg提取物細(xì)胞總蛋白中轉(zhuǎn)移到蛋白上的甲基(fmol)表示。
標(biāo)記的替莫唑胺的細(xì)胞攝取8-氨基甲?；?3-[14C]甲基咪唑并[5，1-d]-1，2，3，5-四嗪-4-(3H)-酮(特異活性26.3mCi/m mole)由Dr.John Slack(Aston Molecules Ltd.，Birmingham，UK)無償提供。細(xì)胞懸液(5×106ml)在4℃平衡，用200μM標(biāo)記藥物處理。將106個(gè)細(xì)胞注入埃芬諾夫(eppendorf)管中，離心通過250μl油混合物(41“三合一”/Dow Corning硅油)。吸出水層，用300μl生理鹽水溫和地洗滌油層。離心后將兩層皆吸出，將細(xì)胞沉淀物溶于組織增溶解劑如Protoso1(氫氧化銨的甲苯溶液)，再加入含Optiphase(95-99％二異丙基萘)的閃爍杯中。
細(xì)胞毒性研究結(jié)果數(shù)據(jù)見表1
表1單劑量細(xì)胞毒性

<p>在組織培養(yǎng)過程中，細(xì)胞先接觸+/-O6-苯甲基鳥嘌呤(BG)再接觸單劑量的替莫唑胺或CCNU。
1. IC50[-BG]/IC50[+BG]2. 本結(jié)果通過Wasserman等在Int.J.Radiat.Oncol.Biol.
Phys.，15699(1988)描述的MTT試驗(yàn)獲得。
3. 括號(hào)中的數(shù)據(jù)為瞇托唑胺。
按表1數(shù)據(jù)做的圖1說明，腫瘤細(xì)胞系對替莫唑胺(相關(guān)系數(shù)r＝0.87)或CCNU(相關(guān)系數(shù)r＝0.92)的敏感性(通過50％生長濃度或IC50測量)與其ATase含量有內(nèi)在的關(guān)系。兩線幾乎平行，只是相同摩爾濃度的CCNU毒性大約高出5倍。MCF-7細(xì)胞系是個(gè)例外，其對替莫唑胺中度敏感而ATase活性卻相對較高。用非毒性劑量的BG預(yù)處理的細(xì)胞系對替莫唑胺和CCNU的敏感性分別提高至3.5倍和6倍以上。
對照XP細(xì)胞(用pZipneoSV(X)1轉(zhuǎn)染的著色性干皮病細(xì)胞)(Fan等，Nucleic Acids Res.，185723，1990)，其ATase水平僅可檢測到，而對替莫唑胺或CCNU相關(guān)制劑咪托唑胺的敏感性卻比人ATase cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞高4-5倍(見表1)。在用細(xì)胞群落形成測定替莫唑胺細(xì)胞毒性中(見圖2)，對人ATase轉(zhuǎn)染的XP細(xì)胞和對腫瘤細(xì)胞，BG預(yù)處理的增效程度相近，但是對不表達(dá)ATase的對照XP細(xì)胞卻無可測出的作用。雖然BG損傷前者細(xì)胞的ATase活性(見下)，但其對替莫唑胺的抗藥性卻比對照組pZip轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞更強(qiáng)。
重復(fù)劑量方案的數(shù)據(jù)在表II中列出。
表2重復(fù)劑量替莫唑胺細(xì)胞毒性[IC50(μm)]

組織培養(yǎng)的細(xì)胞先與+/-O6-苯甲基鳥嘌呤(BG)接觸，再與重復(fù)日劑量的替莫唑胺接觸。
重復(fù)劑量方案顯示出對于MAWI及MCF-7細(xì)胞，BG對替莫唑胺的毒性有急劇的增效作用(參見圖3)。
24小時(shí)劑量處理5次后，MAWI細(xì)胞系在BG存在時(shí)對替莫唑胺的敏感性增加了300倍以上。在每個(gè)細(xì)胞系中，多劑量的替莫唑胺本身并不比24小時(shí)單劑量更有毒性。在對ATase水平低的U373細(xì)胞進(jìn)行的相似試驗(yàn)中，在24小時(shí)劑量4次給藥后，BG僅增效3倍。
烷基轉(zhuǎn)移酶水平MAWI細(xì)胞系及人ATase cDNA轉(zhuǎn)染XP成纖維細(xì)胞開始時(shí)的ATase含量很高，所用BG濃度迅速下降至無法檢出的水平，HLPC分析表明37℃時(shí)組織培養(yǎng)基中BG至少在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定存在。
孵育3小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)替莫唑胺引起(U373、MCF-7、LOVO及MAWI細(xì)胞系的ATase含量降低。用藥濃度為50-100μM時(shí)每個(gè)細(xì)胞系的ATase含量各降低了50％(見圖4)，但MCF-7和結(jié)腸直腸細(xì)胞系(LOVO和MAWI)之間的單劑量替莫唑胺的細(xì)胞毒性有3-4倍的差別。雖然ATase水平已接近試驗(yàn)的檢測極限，但仍可發(fā)現(xiàn)更敏感的U373細(xì)胞系有類似的降低現(xiàn)象。
為了排除替莫唑胺轉(zhuǎn)運(yùn)的不同的可能性，通過最敏感及最有抗藥性的細(xì)胞系(分別是ZR-75-1和MAWI)研究細(xì)胞對[14C]標(biāo)記化合物的攝取情況。圖5的結(jié)果表明，4℃時(shí)攝取速度最快，兩細(xì)胞系皆在5分鐘內(nèi)完成攝取。當(dāng)校準(zhǔn)蛋白濃度時(shí)，兩細(xì)胞系中都發(fā)現(xiàn)有相似的藥物含量。4℃的快速攝取與替莫唑胺的被動(dòng)擴(kuò)散是一致的，這最早見于兩個(gè)淋巴細(xì)胞系，參見Bull等，Biochem.Pharmacol.，363215(1987)。
實(shí)施例2口服制劑 mg/膠囊替莫唑胺 100乳糖、美國藥典213微晶纖維素 30十二烷基硫酸鈉 20玉米淀粉 25硬脂酸鎂2將替莫唑胺、乳糖、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉和玉米淀粉一起混合。過80號(hào)篩。加入硬脂酸鎂、混合并裝入適當(dāng)型號(hào)的兩片明膠膠囊中。
實(shí)施例3口服制劑 mg/膠囊O6-苯甲基鳥嘌呤 100乳糖、美國藥典 213微晶纖維素 30十二烷基硫酸鈉 20玉米淀粉25硬脂酸鎂 2將O6-苯甲基鳥嘌呤、乳糖、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉及玉米淀粉混合。過80號(hào)篩。加入硬脂酸鎂、混合后加到合適型號(hào)的兩片明膠膠囊中。
實(shí)施例4口服制劑 mg/膠囊替莫唑胺 100O6-苯甲基鳥嘌呤 100乳糖、美國藥典 213微晶纖維素 30十二烷基硫酸鈉 20玉米淀粉25硬脂酸鎂 2將替莫唑胺、O6-苯甲基鳥嘌呤、乳糖、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉及玉米淀粉混合。過80號(hào)篩。加入硬脂酸鎂、混合后裝到合適型號(hào)的兩片明膠膠囊中。
實(shí)施例5靜脈注射制劑 mg/ml替莫唑胺100亞硫酸氫鈉，美國藥典3.2依地酸二鈉，美國藥典0.1注射用水，加至適量 1.0ml實(shí)施例6靜脈注射制劑mg/ml替莫唑胺100O6-苯甲基鳥嘌呤100亞硫酸氫鈉，美國藥典3.2依地酸二鈉，美國藥典0.1注射用水，加至適量 1.0ml在不背離本發(fā)明的宗旨或?qū)嵸|(zhì)特征的前提下，本發(fā)明也可以用其它藥物劑型實(shí)施或以其它途徑完成，因而本公開應(yīng)視為對各方面的說明而非限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后面的權(quán)利要求書給出，并且在等同的含意和范圍內(nèi)的所有變化，都包括其中。
權(quán)利要求
1.一種使替莫唑胺對人癌細(xì)胞的毒性增效的方法，其特征是對需要此治療的病人使用ATase抑制量的ATase抑制劑及有效劑量的替莫唑胺。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述ATase抑制劑在施用所述替莫唑胺前給藥。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述ATase抑制劑選自如下化合物O6-烷基鳥嘌呤、O6-鏈烯基鳥嘌呤、O6-芳基鳥嘌呤及O6-苯甲基化鳥嘌呤、鳥嘌呤核苷和2′-脫氧鳥嘌呤核苷。
4.權(quán)利要求1的方法，其中ATase抑制劑是O6-苯甲基鳥嘌呤。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述抑制劑的用藥量按病人體重計(jì)為約1-2000mg/kg
6.權(quán)利要求1的方法，其中ATase抑制劑的用藥量按病人體重計(jì)為10-800mg/kg
7.權(quán)利要求6的方法，其中替莫唑胺用藥量按每天體表面積計(jì)為150-300mgm-2。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述ATase抑制劑及所述替莫唑胺在連續(xù)幾天內(nèi)分劑量用藥。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在施用替莫唑胺之前按病人體重以10-800mg/kg的劑量施用所述ATase抑制劑，而替莫唑胺的用藥量按體表面積計(jì)為每天150-300mgm-2，所述ATase抑制劑和所述替莫唑胺在連續(xù)幾天內(nèi)分劑量給藥。
10.權(quán)利要求9的方法，其中ATase抑制劑是O6-芐基鳥嘌呤。
11.權(quán)利要求10的方法，其中替莫唑胺總用藥量至少分成四個(gè)單獨(dú)劑量，至少連續(xù)施用4天。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述ATase抑制劑在施用所述替莫唑胺之前2至8小時(shí)給藥。
13.權(quán)利要求1的方法，其中人癌細(xì)胞是乳腺癌腫瘤細(xì)胞、星形細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞、直腸結(jié)腸腫瘤細(xì)胞、黑素瘤腫瘤細(xì)胞、蕈樣真菌病腫瘤細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞。
14.用ATase抑制劑制備治療人癌細(xì)胞的藥物組合物的用途，所述治療采用聯(lián)合治療方式，其中包括先施用所述ATase抑制劑，然后施用替莫唑胺。
15.用替莫唑胺制備治療人癌細(xì)胞的藥物組合物的用途，所述治療采用聯(lián)合治療方式，其中包括先施用所述ATase抑制劑然后施用替莫唑胺。
16.ATase抑制劑和替莫唑胺用于治療需此治療病人的癌細(xì)胞。
17.用ATase抑制劑和替莫唑胺制備用于治療需此治療的病人癌細(xì)胞的藥物的用途。
18.一種用于治療需此治療的病人癌細(xì)胞的藥物組合物，其中含有有效量的ATase抑制劑和有效量的替莫唑胺。
19.一種用于治療需此治療的病人癌細(xì)胞的藥盒，其中包括替莫唑胺的藥物劑型以及獨(dú)立的ATase抑制劑藥物劑型。
20.藥物組合物的制備方法，包括將替莫唑胺和ATase抑制劑與一種或多種可藥用的載體混合。
21.一種可同時(shí)、分別或連續(xù)施用、用于治療需此治療的病人癌細(xì)胞的產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有聯(lián)合制劑形式的替莫唑胺和ATase抑制劑。
22.一種用于篩選ATase抑制劑使替莫唑胺毒性增效的人癌細(xì)胞的方法，該方法包括測定所述細(xì)胞ATase含量；并確定提前使用ATase抑制劑是否足以降低此含量。
全文摘要
通過預(yù)先施用ATase抑制劑，即O
文檔編號(hào)A61K31/708GK1117711SQ9419117
公開日1996年2月28日 申請日期1994年1月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月14日
發(fā)明者J·C·貝爾, A·A·弗里曼, E·S·紐蘭斯, A·J·沃特森, J·A·拉弗蒂, G·P·馬吉森 申請人:癌癥研究行動(dòng)技術(shù)有限公司