一種一次離心法制備富血小板血漿的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于富血小板血漿制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種以一次離心法制備富血小板血漿（PRP）的方法。所述方法僅利用一部高速自動離心機(jī)，采用一次離心法，整個過程僅需一次移液（吸取分界層血漿），以達(dá)到方便快捷、污染風(fēng)險(xiǎn)低的目的。而且，利用本發(fā)明所述方法制備得到的富血小板血漿中血小板細(xì)胞濃度均值達(dá)1029.875×109/L；PRP中血紅蛋白量為20.26g/L，可以很好的滿足臨床需要。
【專利說明】一種一次離心法制備富血小板血漿的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及富血小板血漿的制備方法，具體地，涉及一種一次離心法制備富血小板血漿的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]富血小板血衆(zhòng)(platelet-rich plasma, PRP)是通過離心人或動物自身的全血而得到的含高體積分?jǐn)?shù)血小板的血漿。自從上世紀(jì)80年代DAVID R.KNIGHTON等人發(fā)現(xiàn)血小板細(xì)胞能促進(jìn)血管增生、膠原合成后，人們便致力于將富血小板血漿(PRP)應(yīng)用于臨床，渴望解決修復(fù)能力低下的器官組織的損傷修復(fù)問題。但由于當(dāng)時PRP制備困難，限制了其在臨床上的推廣。
[0003]經(jīng)過幾十年的研究，已探索出幾種較為合適的富血小板血漿制備方法:手工法(一次離心法、二次離心法和三次離心法)及設(shè)備制備法。其中，二次離心法的PRP的提取率最高，在臨床的應(yīng)用也最廣。利用二次離心法制備PRP的原理如下:(I)抽取靜脈血液并將其注入含抗凝劑的試管內(nèi)；(2)第I次離心可將血液分為3層，最底端的部分為約占血液總體積分?jǐn)?shù)55%的紅細(xì)胞；頂端部分為約占總體積分?jǐn)?shù)40%的貧血小板血漿(platelet-poorplasma, PPP)，主要是纖維蛋白原等血漿成分；中間層為僅占總體積分?jǐn)?shù)5%的血小板濃縮物(platelet concentrate, PC)，即俗稱的黃衣層；(3)用移液器吸取PPP和PC以及緊鄰PC的部分紅細(xì)胞，并將其注入另一不含抗凝劑的試管中；(2)以一定的速度和時間再次將其離心并將血漿分為3層，最底端是少量剩余的紅細(xì)胞，頂端是約占總體積分?jǐn)?shù)80%的PPP，兩層之間即富集的血小板；(5)用移液器抽取大部分的PPP，并留取足夠的血清來容納懸浮于其中的富集的血小板，得到PRP。另外，PRP中的血小板在體外較脆弱且容易激活，過高的離心速度會使血小板膜破裂降低其生物活性，而較低的離心速度可使血小板活性在制備過程中保持在最低水平，因此離心時速度不宜過快。而且，在不同的離心次數(shù)、離心力和離心時間所制備出的PRP中，血小板的體積分?jǐn)?shù)以及各種生長因子的量和活性各不相同。
[0004]目前雖能制備出成分較為單一、濃度達(dá)標(biāo)的PRP，但其制備技術(shù)仍未完全成熟，大多數(shù)人推崇的二次離心法存在著操作復(fù)雜、過程漫長、產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)。我國威高公司即將上市的PRP設(shè)備存在著PRP中血小板濃度不高的缺陷，而在美國已經(jīng)上市的PRP設(shè)備，其PRP中血紅蛋白濃度未公開，因此可能存在著血小板細(xì)胞濃度高但純度不高的缺陷，而且各個上市的PRP設(shè)備，其價格相當(dāng)昂貴，在臨床應(yīng)用推廣方面受到較大限制，尤其在發(fā)展中國家的應(yīng)用。目前，解決PRP制備問題的方法仍值得進(jìn)一步探究，以得到一種方便快捷、純度及濃度高、價格低廉的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題克服目前傳統(tǒng)手工法制備富血小板血漿濃度或純度不高、以及手工二次離心法制備過程復(fù)雜、采用上市設(shè)備套裝制備成本高的缺陷，為臨床研究提供一種能制備得到濃度及純度均高的富血小板血漿的技術(shù)，其制備過程簡便，成本低。[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種一次離心法制備富血小板血漿的方法，包括如下步驟:將混有抗凝劑的全血以1400g的離心力離心15分鐘，離心結(jié)束后，全血將分成3層，上層為貧血小板血漿層，中層為富血小板血漿層，下層為血紅蛋白層，然后均勻吸取中層血漿即得富血小板血漿。
[0007]優(yōu)選地，所述抗凝劑為肝素或水蛭素。更優(yōu)選地，所述抗凝劑為肝素。
[0008]優(yōu)選地，所述肝素在全血中的添加量按照肝素與全血的體積比為0.2:10來確定，所述肝素為12500單位/2mL的肝素。
[0009]優(yōu)選地，所述富血小板血漿的具體制備方法為:將混有1.0mL濃度為12500單位/2mL肝素的50mL全血以1400g離心力進(jìn)行離心15min分鐘；離心結(jié)束后，全血將分成3層，上層為貧血小板血漿層，中層為富血小板血漿層，下層為血紅蛋白層，于中層均勻吸取4mL血漿即得富血小板血漿。
[0010]本發(fā)明僅利用一部高速自動離心機(jī)，采用一次離心法，整個過程僅需一次移液(吸取分界層血漿)，以達(dá)到成本低、制備方便快捷、污染風(fēng)險(xiǎn)低的目的。經(jīng)過廣東省人民醫(yī)院骨科的研究(結(jié)果見附表及圖)，本發(fā)明專利制備得到的PRP中其平均血小板濃度達(dá)1029.875X 109/L(為全血血小板濃度的3.8倍，標(biāo)準(zhǔn)差為259.92，標(biāo)準(zhǔn)誤為91.89，95%可信區(qū)間為(812.58,1247.17))，平均血紅蛋白濃度僅為20.26g/L (標(biāo)準(zhǔn)差為15.82，標(biāo)準(zhǔn)誤為5.59，95%可信區(qū)間為(7.03，33.49 ))，這就達(dá)到純度及濃度高的目的。本發(fā)明專利制備的PRP，僅利用一臺高速離心機(jī)即可，制備消耗理所當(dāng)然較采用上市的設(shè)備套裝制備成本少，因此具有價格低廉的優(yōu)點(diǎn)。
[0011]本發(fā)明所述方法比傳統(tǒng)的一次離心法(Anitua法)好:在1999年,西班牙EduardoAnitua博士發(fā)明了 Anitua法。他當(dāng)時采集患者10至20mL靜脈血,加入5mL的多個離心管內(nèi)，以160g離心力離心6分鐘，然后棄取上層(貧血小板血漿層)1ml，再吸取剩余上層血衆(zhòng)至下層(紅細(xì)胞層)1?2mm,這樣5mL的靜脈血大約可以獲取1.2mL的PRP。他當(dāng)時分析(n=10)，所棄去的上層血漿中血小板細(xì)胞數(shù)量僅僅少于全部血小板的15%，可見仍有較多血小板殘存于上層而被棄掉，表明Anitua法所采取的的離心時間和離心力不足以使大部分血小板沉降于中層。本發(fā)明技術(shù)的離心時間及離心力均較Anitua法多，可使滯留于上層的血小板沉降至中層。
[0012]與二次離心法(Landesberg法)相比:二次離心法制備的PRP時，初次離心采用低速離心，然后取交界面下3mm以上的血漿，這其中必然殘存有大量的血紅蛋白。而在第二次高速離心后，吸取全部下層血漿，即為PRP，這其中包含了初次離心后殘留的血紅蛋白。以Landesberg法制備得到的PRP中，血紅蛋白量高。另外，二次離心法需多經(jīng)一次移液，制備過程復(fù)雜，污染風(fēng)險(xiǎn)高。
[0013]與現(xiàn)有富血小板血漿制備方法、制備設(shè)備相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
(I)本發(fā)明所述富血小板血漿的制備方法與傳統(tǒng)一次離心法相比，制備得到的PRP的濃度及純度更高，與二次離心法相比則更加方便、快捷，大大降低手工法制備富血小板血漿的操作時間及污染風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明專利的技術(shù)方法耗時15分鐘，而二次離心法中最為推崇的Landesberg法耗時較多，需兩次均為10分鐘離心時間，加上額外I次的吸取移液的操作時間，而且，二次吸取移液過程不僅增加了操作的復(fù)雜性，更嚴(yán)重的是增大了污染機(jī)會。本發(fā)明專利的技術(shù)方法僅需I次離心，則避免了第二次吸取移液的過程，操作更為簡便，更重要的是大大降低血漿直接暴露的時長。
[0014](2)本發(fā)明專利的技術(shù)方法制備的富血小板血漿中血小板細(xì)胞濃度均值達(dá)1029.875X 109/L。而在本研究單位利用Landesberg法制備得到的PRP中血小板細(xì)胞濃度為1204.8333X 109，兩者比較沒有明顯差異；但在另一方面，利用本發(fā)明專利的技術(shù)方法制備得到的PRP中血紅蛋白量為20.26g/L，Landesberg法制備得到的PRP中血紅蛋白量為59.5338/1，兩者相比有明顯差異(？=0.023)。而我國威高公司的制備系統(tǒng)制備的PRP中血小板細(xì)胞濃度均值為819.47X IO9 (李明、張長青、袁霆等:富血小板血漿制備套裝的評估研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志.2011，25 (I) 112-116)，因此利用本發(fā)給制備的血小板濃度明顯較我國上市設(shè)備套裝的高。
[0015](3)本發(fā)明專利技術(shù)方法將要于我院骨科開展，初步擬定的患者整個治療過程約花費(fèi)3500元。而上市的PRP設(shè)備，單單是制備出PRP就需300~400美元，還未計(jì)算患者治療過程的其他費(fèi)用，如美國的GenesisCS設(shè)備系統(tǒng)的套裝價格為1550美元，我國威高公司即將上市的PRP設(shè)備系統(tǒng)的套裝價格為8000元。因此，以本發(fā)明專利的技術(shù)方法制備PRP，相對于其他設(shè)備系統(tǒng)，更加實(shí)惠。
[0016]說明書附圖 圖1.17種離心處理方法制備得到的PRP中血小板計(jì)數(shù)的均值。
[0017]圖2.17組的PRP及全血中血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。
[0018]圖3.本發(fā)明15-1400方法和Landesberg法獲得的PRP中PLT和HGB均值?！揪唧w實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0020]因?yàn)橹苽涞玫降母谎“逖獫{(PRP)最終要用回至人體，所以，制備PRP的全過程需嚴(yán)格無菌。
[0021]實(shí)施例1 S1.材料與方法
主要儀器設(shè)備及試劑^ppendorf 5702離心機(jī)，離心管，EDTA采血管，注射器，肝素鈉，全自動血細(xì)胞分析儀。
[0022]S2.實(shí)驗(yàn)對象:首先根據(jù)以下6點(diǎn)篩選出患者:
1、擬自愿接受富血小板血漿注射治療的患者。
[0023]2、患者靜脈血血細(xì)胞分析結(jié)果三系在正常范圍內(nèi):血小板計(jì)數(shù)在100~300X 109/L之間，血紅蛋白女性在135~150g/L之間，男性在140~155g/L之間，白細(xì)胞數(shù)在4~IOX 1012/L之間。
[0024]3、紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白在正常范圍內(nèi)。
[0025]4、全身及治療局部無感染表現(xiàn)者。
[0026]5、基礎(chǔ)情況好，無高脂血癥、糖尿病等對血液成分影響巨大的血液系統(tǒng)外疾病。
[0027]6、患者知情同意。
[0028]S3.實(shí)驗(yàn)方法S31.分組方法:首先將17種離心處理方法進(jìn)行編號(I至17號)，然后讓志愿者選擇一個號碼，根據(jù)號碼對應(yīng)離心處理方法入組，如志愿者I選擇了號碼1，則將其分配至I組，其對應(yīng)的離心處理方法為編號I的離心處理方法。17種離心處理方法如下:經(jīng)上述條件篩選出實(shí)驗(yàn)志愿者后，用肝素濕潤了的注射器于患者肘靜脈采集血液50mL，注入離心管內(nèi)，按其所在組的處理方案進(jìn)行離心處理:
表1 17種離心處理方法
【權(quán)利要求】
1.一種一次離心法制備富血小板血漿的方法，其特征在于，將混有抗凝劑的全血以1400g的離心力離心15分鐘，離心結(jié)束后，全血將分成3層，上層為貧血小板血漿層，中層為富血小板血漿層，下層為血紅蛋白層，然后均勻吸取中層血漿即得富血小板血漿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備富血小板血漿的方法，其特征在于，所述抗凝劑為肝素或水蛭素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備富血小板血漿的方法，其特征在于，所述抗凝劑為肝素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備富血小板血漿的方法，其特征在于，所述肝素在全血中的添加量按照肝素與全血的體積比為0.2:10來確定，所述肝素為12500單位/2mL的肝素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備富血小板血漿的方法，其特征在于，所述富血小板血漿的具體制備方法為:將混有1.0mL濃度為12500單位/2mL肝素的50mL全血以1400g離心力進(jìn)行離心15min分鐘；離心結(jié)束后，全血將分成3層，上層為貧血小板血漿層，中層為富血小板血漿層，下層為血紅蛋白層，于中層均勻吸取4mL血漿即得富血小板血漿。
【文檔編號】B01D17/038GK103505910SQ201310480780
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】鄭秋堅(jiān), 林子洪, 沈梓維 申請人:廣東省人民醫(yī)院