本發(fā)明涉及基因治療和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及電荷反轉(zhuǎn)的DNA納米載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的繁榮與進(jìn)步，健康問題越來越受到人們的重視。在致命的10大疾病中，排名前幾的心臟病、惡性腫瘤、腦血管病變、糖尿病嚴(yán)重影響人們的生活，而且這些疾病還呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，死亡率也越來越高，趨向于年輕化，這些疾病常常會(huì)引起很多并發(fā)癥?；蛑委熃o人們帶來了曙光，從1990年至今，實(shí)現(xiàn)了在生物醫(yī)藥領(lǐng)域和臨床上基因治療對(duì)人類疾病進(jìn)行基因干預(yù)治療，在治療疾病的潛力得到了認(rèn)可，比傳統(tǒng)治療疾病的方法有很多不可比擬的優(yōu)點(diǎn)?；蛑委熞呀?jīng)成為當(dāng)代生命科學(xué)領(lǐng)域最具前景性的研究方向。2003年基因組計(jì)劃的成功，推動(dòng)了基因治療的進(jìn)步?；蛑委熤荚诟淖兓蛩?，有DNA和mRNA兩個(gè)水平。2009年美國(guó)就有354項(xiàng)關(guān)于基因治療的計(jì)劃在試行，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了2008年的全球的116項(xiàng)。英國(guó)在2014年推出了“十萬基因組計(jì)劃”擬通過對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序，有效確定引發(fā)癌癥及其他疾病的基因。

抗體也是生物科學(xué)領(lǐng)域的主力軍，最普遍的用法是通過Western blot去揭示細(xì)胞中特定蛋白的表達(dá)量的多少，抗體另一方面還被用于熒光染色和免疫組化。根據(jù)2015年Biocompare發(fā)表的一份報(bào)告，在科研上用于抗體的生產(chǎn)的市場(chǎng)規(guī)模很龐大，并且仍在增長(zhǎng)，抗體的種類也越來越多，但是抗體的質(zhì)量得不到保證，在抗體的購(gòu)買方面損失了很多的資金，只科研用于抗體市場(chǎng)規(guī)模就達(dá)到25億美金，每年因購(gòu)買質(zhì)量差的抗體導(dǎo)致的損失達(dá)到8億美金。2015年9月Uhlén和美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)分別舉辦了關(guān)于抗體迫在眉睫的問題的解決的會(huì)議，解決方案之一就是抗體的效果的評(píng)價(jià)。同一種抗體在幾次試驗(yàn)下表現(xiàn)出的性質(zhì)不同，會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)料的結(jié)果。斯坦福大學(xué)反向DNA疫苗開創(chuàng)一型糖尿病新療法，這種疫苗是以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的反向DNA疫苗，通過靶向抑制異常表達(dá)的T細(xì)胞保護(hù)胰島B細(xì)胞不受傷害，來治療糖尿病。2015年4月，科學(xué)家證明了納米涂層細(xì)菌能有效轉(zhuǎn)運(yùn)口服DNA疫苗，這種疫苗可以刺激人體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用治療疾病，主要目的是有效增加口服疫苗生物利用度，尋找一個(gè)有效的載體物質(zhì)。一些常見的方法如基因槍法、電穿孔法、顯微注射等方法，但這些方法目前的缺點(diǎn)是無法確保基因進(jìn)入體內(nèi)不被降解、無靶向性、會(huì)產(chǎn)生機(jī)體的免疫反應(yīng)，目前陽離子聚合物載體作為非病毒型載體已經(jīng)受到了人們的重視，將潛在的病毒型載體的安全性隱患排除。這種陽離子載體既可應(yīng)用于基因治療又可簡(jiǎn)化疫苗的生產(chǎn)以及DNA疫苗的不成熟性，可保護(hù)DNA進(jìn)入體內(nèi)不被DNA水解酶水解。常見的陽離子聚合物基因載體毒性低、轉(zhuǎn)染效率高、具有靶向性且在細(xì)胞內(nèi)無明顯免疫反應(yīng)。因此合成以陽離子聚合物為基礎(chǔ)的DNA納米載體載體很有意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種電荷反轉(zhuǎn)的DNA納米載體及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種電荷反轉(zhuǎn)的DNA納米載體，包括甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽與pDNA形成的復(fù)合物，不同pH條件下帶電荷量的不同，在相應(yīng)的PH條件下可以進(jìn)行電荷反轉(zhuǎn)。

本發(fā)明還通過一種制備上述電荷反轉(zhuǎn)的DNA納米載體的方法，步驟如下：

（一）制備丁二酸甲酯

稱取丁二酸, Dowex 50W-X₂，加入到甲酸甲酯/辛烷的混合液中，80℃水浴反應(yīng)持續(xù)12h，將溶液過濾并蒸干，然后通過色譜純對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化，即為丁二酸甲酯；所述丁二酸與甲酸甲酯的摩爾比為1:2;

（二）制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯

稱取上步所得丁二酸甲酯、0.5倍丁二酸甲酯摩爾量的3-二甲基氨基-1-丙醇和1/5丁二酸甲酯摩爾量的4-甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷中，得到溶液1：將4倍丁二酸甲酯摩爾量的二環(huán)己基碳二亞胺溶解在二氯甲烷中，得到溶液2，備用：另外將溶液2加入到溶液1中，持續(xù)攪拌2d，然后過濾除去不溶物后將溶劑揮發(fā)，得到甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯；

（三）制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽

將上步所得甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯溶解在二氯甲烷中，加入3倍丁二酸甲酯摩爾量的MeI，在室溫下攪拌4h后蒸發(fā)濃縮，殘余物通過二氯甲烷/乙醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶，得到甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽；

（四）以0.2PH為間隔配制3.2-8.0pH梯度的pH緩沖溶液，將上步所得甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽加入不同pH的緩沖溶液中，測(cè)定甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽所帶電荷量，并找到電荷反轉(zhuǎn)的點(diǎn)；

（五）制備電荷反轉(zhuǎn)DNA復(fù)合物

1.稱取步驟三中所的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶解在滅菌水中，調(diào)節(jié)其pH值使其符合使用環(huán)境，通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無菌操作臺(tái)備用；

2.將上步所得季銨鹽溶液加入離心管1中，將pDNA加入離心管2中，加入無菌水稀釋至2μg/mL，備用；按照藥用比例設(shè)定將稀釋后的pDNA分批加入離心管1中，渦旋30s后將離心管1放入孵育器中，在37℃條件下孵育1h，即得。

作為優(yōu)選項(xiàng)：所述步驟（一）中，甲酸甲酯/辛烷混合液中甲酸甲酯與辛烷體積比為2:8。

作為優(yōu)選項(xiàng)：所述步驟（五）1中，調(diào)節(jié)甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶液pH值的調(diào)節(jié)劑為0.1M HCl或0.1MNaOH。

作為優(yōu)選項(xiàng)：所述步驟（五）2中，將稀釋后的pDNA分批加入離心管1中的具體操作為將稀釋后的pDNA按照每次15μL的量加入到離心管1中。

本發(fā)明制備的電荷反轉(zhuǎn)復(fù)合物具有pH響應(yīng)性，通過甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽在不同pH條件下帶電荷量的不同，在某一個(gè)PH條件下進(jìn)行電荷反轉(zhuǎn)，通過帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面時(shí)，納米復(fù)合物帶正電，與細(xì)胞膜有很高的親和性，更能有效被內(nèi)化，進(jìn)入細(xì)胞中不同的pH條件下，發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)，更加有利于載體進(jìn)入細(xì)胞，負(fù)電荷的載體在血管中更容易長(zhǎng)效循環(huán)，更加適合基因治療和抗體生產(chǎn)的應(yīng)用。

本發(fā)明的DNA納米載體，可以與不同濃度的可以表達(dá)綠色熒光蛋白的pDNA進(jìn)行結(jié)合，從而可以對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，更好的用于生物檢測(cè)。

本發(fā)明制備的電荷反轉(zhuǎn)復(fù)合物也是利用靜電作用與DNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在不同pH條件下復(fù)合物的電荷不同，在某一個(gè)pH值可以實(shí)現(xiàn)電荷正負(fù)的變化，從而更加適應(yīng)生物體內(nèi)的微環(huán)境，能很好的應(yīng)用在基因治療和抗體生產(chǎn)。

綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：

1、本發(fā)明制備方法工藝簡(jiǎn)單，成本低；

2、本發(fā)明制備的納米顆粒穩(wěn)定性好，并且在水中分散性好，粒徑可控；

3、本發(fā)明制備的pDNA納米載體比在PBS和油相中尺寸和帶電荷量影響更??；

4、本發(fā)明制備的納米顆粒比兩單體的物質(zhì)穩(wěn)定性更好，更能改變整個(gè)物質(zhì)的電荷分布，更加適合基因治療和抗體生產(chǎn)的應(yīng)用。

5、電荷反轉(zhuǎn)復(fù)合物在不同pH條件下帶電荷量的不同，在某一個(gè)PH條件下進(jìn)行電荷反轉(zhuǎn)，通過帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面時(shí)，納米復(fù)合物帶正電，與細(xì)胞膜有很高的親和性，更能有效被內(nèi)化，進(jìn)入細(xì)胞中不同的pH條件下，發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)，負(fù)電荷的載體在血管中更容易長(zhǎng)效循環(huán)，更加適合基因治療和抗體生產(chǎn)的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中電荷反轉(zhuǎn)復(fù)合物的制備過程示意圖；

圖2為本發(fā)明制備的載體進(jìn)入細(xì)胞示意圖。

具體實(shí)施方式

制備電荷反轉(zhuǎn)/DNA復(fù)合物

(1) 制備丁二酸甲酯

稱取一定量的丁二酸，Dowex 50W-X₂，加入到甲酸甲酯/辛烷的混合液中，80℃水浴反應(yīng)持續(xù)12h.將溶液過濾并蒸干，通過色譜進(jìn)行純化所得產(chǎn)物。

（2）制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯

稱取DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)溶解在二氯甲烷中,配制好的DCC溶液備用。將丁二酸甲酯，3-二甲基氨基-1-丙醇, 4-甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷中，取一定量的DCC加入上述溶液中，溶液持續(xù)攪拌2d.反應(yīng)混合物通過過濾除去不溶物。

（3）制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽

稱取一定量的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯溶解在二氯甲烷中，加入MeI（碘甲烷），溶液在室溫下攪拌4h,蒸發(fā)濃縮，殘余物通過二氯甲烷/乙醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶。

（4）不同pH條件下季銨鹽所帶電荷量

配制3.2-8.0pH梯度（間隔0.2pH）的pH緩沖溶液，將季銨鹽加入不同pH的緩沖溶液中，測(cè)定季銨鹽所帶電荷量，并找到電荷反轉(zhuǎn)的點(diǎn)。

(5) 制備電荷反轉(zhuǎn)DNA復(fù)合物

①稱取甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶解在滅菌水中，使用1MHCl(1MNaOH)調(diào)節(jié)溶液的pH，通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無菌操作臺(tái)備用；

②將1中的季銨鹽溶液取1mL加入離心管1中，取pDNA加入2mL離心管2中，加入無菌水稀釋至100μL，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。

以下實(shí)施例描述了本發(fā)明的特殊實(shí)施例子，以便對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例只是說明而不表示本發(fā)明所有的可能性，本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例中提到的材料、反應(yīng)條件或參數(shù)，任何在相關(guān)領(lǐng)域具備經(jīng)驗(yàn)的人，都可以按照本專利的原理，利用其他類似材料或反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所描述的DNA納米載體的制備，這些不脫離本發(fā)明描述的基本概念。因此，這些修改或不同的應(yīng)都在本發(fā)明的覆蓋范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

1 、制備丁二酸甲酯

稱取丁二酸(0.118g,1mmol),Dowex 50W-X₂(1.0g)，加入到10ml甲酸甲酯/辛烷(體積比=2:8)的混合液中，80℃水浴反應(yīng)持續(xù)12h.將溶液過濾并蒸干，通過色譜純進(jìn)行純化所得產(chǎn)物。

2、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯

將DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)0.4g(20mmol)溶解在5ml二氯甲烷中,

稱取1中的丁二酸甲酯0.732g(5.5mmol),3-二甲基氨基-1-丙醇0.223g（2.5mmol）,12mg4-甲氨基吡啶溶解在15ml二氯甲烷，將配好的DCC加入上述溶液中，溶液持續(xù)攪拌2d.反應(yīng)混合物通過過濾除去不溶物。

3、 制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽

稱取2中制備的的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯0.347g（1.7mmol）溶解在5ml二氯甲烷中，加入1mlMeI(15mmol)，溶液在室溫下攪拌4h,蒸發(fā)濃縮，殘余物通過二氯甲烷/乙醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶。

4、不同pH條件下季銨鹽所帶電荷量

配制3.2-8.0pH梯度（間隔0.2PH）的pH緩沖溶液，將季銨鹽加入不同pH的緩沖溶液中，測(cè)定季銨鹽所帶電荷量，并找到電荷反轉(zhuǎn)的點(diǎn)。

5 、制備電荷反轉(zhuǎn)DNA復(fù)合物

(1)、稱取20mg步驟3中的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶解在滅菌水中，使用1MHCl(1MNaOH)調(diào)節(jié)溶液pH在7.4，通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無菌操作臺(tái)備用。

(2)、將(1)中的季銨鹽溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h;

將稀釋后的pDNA分批加入離心管1中的具體操作為將稀釋后的pDNA按照每次15μL的量加入到離心管1中。

實(shí)施例2

1、 制備丁二酸甲酯

稱取丁二酸(0.118g,1mmol),Dowex 50W-X₂(1.0g)，加入到10ml甲酸甲酯/辛烷(體積比=2:8)的混合液中，80℃水浴反應(yīng)持續(xù)12h.將溶液過濾并蒸干，通過色譜純進(jìn)行純化所得產(chǎn)物。

2、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯

將DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)0.4g(20mmol)溶解在5ml二氯甲烷中,

稱取1中的丁二酸甲酯0.732g(5.5mmol),3-二甲基氨基-1-丙醇0.223g（2.5mmol）,12mg4-甲氨基吡啶溶解在15ml二氯甲烷，將配好的DCC加入上述溶液中，溶液持續(xù)攪拌2d.反應(yīng)混合物通過過濾除去不溶物。

3 、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽

稱取2中制備的的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯0.347g（1.7mmol）溶解在5ml二氯甲烷中，加入1mlMeI(15mmol)，溶液在室溫下攪拌4h,蒸發(fā)濃縮，殘余物通過二氯甲烷/乙醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶。

4、不同pH條件下季銨鹽所帶電荷量

配制3.2-8.0pH梯度（間隔0.2PH）的pH緩沖溶液，將季銨鹽加入不同pH的緩沖溶液中，測(cè)定季銨鹽所帶電荷量，并找到電荷反轉(zhuǎn)的點(diǎn)。

5、制備電荷反轉(zhuǎn)DNA復(fù)合物

(1)、稱取20mg步驟3中的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶解在滅菌水中，使用1MHCl(1MNaOH)調(diào)節(jié)溶液pH在6.8，通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無菌操作臺(tái)備用。

(2)、將(1)中的季銨鹽溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h。

將稀釋后的pDNA分批加入離心管1中的具體操作為將稀釋后的pDNA按照每次15μL的量加入到離心管1中。

實(shí)施例3

1、 制備丁二酸甲酯

稱取丁二酸(0.236g,2mmol),Dowex 50W-X₂(2.0g)，加入到20ml甲酸甲酯/辛烷(體積比=2:8)的混合液中，80℃水浴反應(yīng)持續(xù)12h.將溶液過濾并蒸干，通過色譜純進(jìn)行純化所得產(chǎn)物，即得到丁二酸甲酯；

2、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯

將DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)0.8g(40mmol)溶解在10ml二氯甲烷中,

稱取1中的丁二酸甲酯1.464g(11mmol),3-二甲基氨基-1-丙醇0.446g（5mmol）,24mg4-甲氨基吡啶溶解在15ml二氯甲烷，將配好的DCC加入上述溶液中，溶液持續(xù)攪拌2d，反應(yīng)混合物通過過濾除去不溶物。

3 、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽

稱取2中制備的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯0.694g（3.4mmol）溶解在10ml二氯甲烷中，加入2mlMeI(30mmol)，溶液在室溫下攪拌4h,蒸發(fā)濃縮，殘余物通過二氯甲烷/乙醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶。

4、不同pH條件下季銨鹽所帶電荷量

配制3.2-8.0pH梯度（間隔0.2PH）的pH緩沖溶液，將季銨鹽加入不同pH的緩沖溶液中，測(cè)定季銨鹽所帶電荷量，并找到電荷反轉(zhuǎn)的點(diǎn)。

5、制備電荷反轉(zhuǎn)DNA復(fù)合物

(1)、稱取40mg步驟3中的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶解在滅菌水中，使用1MHCl(1MNaOH)調(diào)節(jié)溶液pH在6.8，通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無菌操作臺(tái)備用。

(2)、將(1)中的季銨鹽溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h;

將稀釋后的pDNA分批加入離心管1中的具體操作為將稀釋后的pDNA按照每次15μL的量加入到離心管1中。

實(shí)施例4

1、 制備丁二酸甲酯

稱取丁二酸(0.236g,2mmol),Dowex 50W-X₂(2.0g)，加入到20ml甲酸甲酯/辛烷(體積比=2:8)的混合液中，80℃水浴反應(yīng)持續(xù)12h.將溶液過濾并蒸干，通過色譜純進(jìn)行純化所得產(chǎn)物，即得到丁二酸甲酯；

2、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯

將DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)0.8g(40mmol)溶解在10ml二氯甲烷中,

稱取1中的丁二酸甲酯1.464g(11mmol),3-二甲基氨基-1-丙醇0.446g（5mmol）,24mg4-甲氨基吡啶溶解在15ml二氯甲烷，將配好的DCC加入上述溶液中，溶液持續(xù)攪拌2d，反應(yīng)混合物通過過濾除去不溶物。

3 、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽

稱取2中制備的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯0.694g（3.4mmol）溶解在10ml二氯甲烷中，加入2mlMeI(30mmol)，溶液在室溫下攪拌4h,蒸發(fā)濃縮，殘余物通過二氯甲烷/乙醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶。

4、不同pH條件下季銨鹽所帶電荷量

配制3.2-8.0pH梯度（間隔0.2PH）的pH緩沖溶液，將季銨鹽加入不同pH的緩沖溶液中，測(cè)定季銨鹽所帶電荷量，并找到電荷反轉(zhuǎn)的點(diǎn)。

5、制備電荷反轉(zhuǎn)DNA復(fù)合物

(1)、稱取40mg步驟3中的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶解在滅菌水中，使用1MHCl(1MNaOH)調(diào)節(jié)溶液pH在7.2，通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無菌操作臺(tái)備用。

(2)、將(1)中的季銨鹽溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h;

將稀釋后的pDNA分批加入離心管1中的具體操作為將稀釋后的pDNA按照每次15μL的量加入到離心管1中。

實(shí)施例5

1、 制備丁二酸甲酯

稱取丁二酸(0.059g,0.5mmol),Dowex 50W-X₂(0.5g)，加入到5ml甲酸甲酯/辛烷(體積比=2:8)的混合液中，80℃水浴反應(yīng)持續(xù)12h.將溶液過濾并蒸干，通過色譜純進(jìn)行純化所得產(chǎn)物，即得到丁二酸甲酯；

2、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯

將DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)0.2g(10mmol)溶解在2.5ml二氯甲烷中,

稱取1中的丁二酸甲酯0.366g(2.75mmol),3-二甲基氨基-1-丙醇0.1115g（1.25mmol）,6mg4-甲氨基吡啶溶解在15ml二氯甲烷，將配好的DCC加入上述溶液中，溶液持續(xù)攪拌2d，反應(yīng)混合物通過過濾除去不溶物。

3 、制備甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽

稱取2中制備的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯0.1735g（0.85mmol）溶解在2.5ml二氯甲烷中，加入0.5mlMeI(7.5mmol)，溶液在室溫下攪拌4h,蒸發(fā)濃縮，殘余物通過二氯甲烷/乙醚混合溶液進(jìn)行重結(jié)晶。

4、不同pH條件下季銨鹽所帶電荷量

配制3.2-8.0pH梯度（間隔0.2PH）的pH緩沖溶液，將季銨鹽加入不同pH的緩沖溶液中，測(cè)定季銨鹽所帶電荷量，并找到電荷反轉(zhuǎn)的點(diǎn)。

5、制備電荷反轉(zhuǎn)DNA復(fù)合物

(1)、稱取40mg步驟3中的甲基丁二酸-3-二甲氨基-1-丙基酯季銨鹽溶解在滅菌水中，使用1MHCl(1MNaOH)調(diào)節(jié)溶液pH在6.7，通過0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無菌操作臺(tái)備用。

(2)、將(1)中的季銨鹽溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA加入2ml離心管2中，加入無菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h;

將稀釋后的pDNA分批加入離心管1中的具體操作為將稀釋后的pDNA按照每次15μL的量加入到離心管1中。