本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種負(fù)載有藥物或基因的納米粒載體溫敏凝膠復(fù)合系統(tǒng)及其制備方法。

背景技術(shù)：

膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)是以關(guān)節(jié)軟骨的破壞和骨質(zhì)增生為特點(diǎn)的最常見的慢性骨關(guān)節(jié)病，是導(dǎo)致老年人關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙的主要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，50歲以上的人群中，OA的發(fā)病率為50％，55歲以上的人群中，發(fā)病率為80％，因此OA又被稱為人類的“下半生疾病”，已成為僅次于心血管疾病的第2號(hào)殺手。OA導(dǎo)致的疼痛和功能障礙將影響患者的生活質(zhì)量并給家庭和社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此研發(fā)有效的治療OA方案具有很重要的意義和社會(huì)價(jià)值。

骨與骨之間連接的地方稱為關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)的主要結(jié)構(gòu)包括關(guān)節(jié)面、關(guān)節(jié)腔和關(guān)節(jié)囊三部分。關(guān)節(jié)腔內(nèi)含有少量滑膜液，使關(guān)節(jié)保持濕潤(rùn)和滑潤(rùn)。此外，關(guān)節(jié)腔并不是一個(gè)封閉的空間，里面的滑液不停的置換更新(2h或小于2h)流入滑膜內(nèi)襯下面的淋巴管。這也導(dǎo)致小分子藥物從關(guān)節(jié)腔內(nèi)被快速清除，縮短了藥物在局部的作用時(shí)間。關(guān)節(jié)囊分為內(nèi)、外兩層，外層為厚而堅(jiān)韌的纖維層，內(nèi)層為滑膜層?；釉试S分子量小于10000的物質(zhì)自由通過，這也造成了關(guān)節(jié)內(nèi)的藥物迅速滲漏進(jìn)入血液循環(huán)引起全身吸收，存在嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。

目前OA的治療目的在于緩解癥狀，改善關(guān)節(jié)功能，避免或減少關(guān)節(jié)畸形，減慢病情進(jìn)展及修復(fù)受損關(guān)節(jié)。治療OA的方法較多，主要包括手術(shù)、藥物和輔助治療三種。治療OA的藥物主要包括一般鎮(zhèn)痛藥、非甾體類抗炎藥、激素類藥物、中藥、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和玻璃酸鈉(SH)等。常用的給藥途徑包括口服、局部外用和關(guān)節(jié)腔注射。關(guān)節(jié)腔給藥可以在降低全身毒性的情況下使高劑量的藥物到達(dá)關(guān)節(jié)腔，直接將藥物輸送至炎癥部位，改變藥物在體內(nèi)的分布模式，避開藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中的生理屏障，以最小的藥量發(fā)揮最大的藥效。因此，關(guān)節(jié)腔注射給藥能有效的降低藥物用量，減輕毒副作用；可顯著地控制病情進(jìn)展，有效改善關(guān)節(jié)功能，充分提高患者的生活質(zhì)量。

申請(qǐng)?zhí)枮?01510043498.4的中國(guó)發(fā)明專利，公開了一種多細(xì)胞因子序貫緩釋微球-水凝膠復(fù)合系統(tǒng)及其制備方法。制備的復(fù)合系統(tǒng)能夠持續(xù)緩釋3種生長(zhǎng)因子，并聚集干細(xì)胞于軟骨損傷部位，以提高關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)效果。但是存在細(xì)胞因子在長(zhǎng)期釋放過程中的穩(wěn)定性問題。同樣地，申請(qǐng)?zhí)枮?01510453601.2的中國(guó)發(fā)明專利公開了一種治療骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞制劑及其制備方法。該細(xì)胞制劑主要由間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)過誘導(dǎo)分化的干細(xì)胞、富含血小板血漿以及他們的分散介質(zhì)組成，用于炎癥的緩解和損傷的修復(fù)。但是這種細(xì)胞制劑在實(shí)際臨床應(yīng)用中的長(zhǎng)期安全性有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可負(fù)載藥物的納米粒載體溫敏凝膠復(fù)合系統(tǒng)的制備方法。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種負(fù)載有藥物的納米粒載體溫敏凝膠復(fù)合系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：

準(zhǔn)備納米粒載體，納米粒載體為末端為氨基或羥基的聚酰胺-胺型樹狀大分子；

通過共價(jià)鍵合的方式將藥物分子與聚酰胺-胺型樹狀大分子末端的氨基或羥基連接，制得負(fù)載有藥物的聚酰胺-胺型樹狀大分子聚合物；

制備水凝膠，水凝膠為PLGA-PEG-PLGA共聚物，PLGA為丙交酯-乙交酯共聚物，PEG為聚乙二醇聚合物；

將PLGA-PEG-PLGA共聚物置于溶劑中制得共聚物溶液；

在攪拌下，將負(fù)載有藥物的聚酰胺-胺型樹狀大分子聚合物加入共聚物溶液中，繼續(xù)攪拌得負(fù)載有藥物分子的納米粒載體水凝膠復(fù)合系統(tǒng)。

在一些實(shí)施方式中，丙交酯與乙交酯的摩爾比為4-6：1。

在一些實(shí)施方式中，聚乙二醇聚合物的數(shù)均分子量為1500。

在一些實(shí)施方式中，聚乙二醇聚合物占PLGA-PEG-PLGA共聚物的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為28％-35％。

在一些實(shí)施方式中，納米粒載體與水凝膠的質(zhì)量體積百分比為0.5％-5％。

在一些實(shí)施方式中，藥物分子選自鎮(zhèn)痛劑、非甾體類抗炎藥、激素類藥物及刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞小分子藥物中的一種。

在一些實(shí)施方式中，溶劑選自注射用水或生理鹽水。

在一些實(shí)施方式中，共聚物溶液的濃度為18-30wt％。

其有益效果為：本發(fā)明首先將藥物與納米載體相連，在將負(fù)載有藥物的那你離載體包覆于水凝膠中，得到負(fù)載有藥物的納米粒載體水凝膠系統(tǒng)，此系統(tǒng)具有雙重緩釋的作用，并刺激滑膜間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)育為軟骨細(xì)胞，減緩軟骨損傷部位炎癥，提高關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)進(jìn)程。

本發(fā)明的水凝膠PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物在低溫、低濃度條件下以液體的形態(tài)存在，當(dāng)負(fù)載有藥物或基因的系統(tǒng)進(jìn)入關(guān)節(jié)時(shí)，由于環(huán)境溫度升高達(dá)到臨界膠束溫度以上，水凝膠濃度也達(dá)到臨界聚集濃度以上時(shí)，溶液會(huì)迅速發(fā)生相轉(zhuǎn)變，在給藥部位形成半固體凝膠態(tài)，這些凝膠可填充于關(guān)節(jié)組織的間隙，使得給藥部位藥物滯留時(shí)間延長(zhǎng)，從而延緩藥物的釋放，有利于維持局部的藥物濃度，適用于患者的關(guān)節(jié)治療；

本發(fā)明的LGA-PEG-PLGA嵌段共聚物水凝膠是以具有兩個(gè)端羥基的聚乙二醇作為引發(fā)物，對(duì)環(huán)化的丙交酯和乙交酯進(jìn)行開環(huán)聚合，一步反應(yīng)就可以得到，并且產(chǎn)物的純化在水中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單安全；

本發(fā)明的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子能物理包埋或化學(xué)結(jié)合小分子藥物，其表面的官能團(tuán)還能連接多種對(duì)機(jī)體某些器官、組織和細(xì)胞有特異性相互作用的靶向配基，從而將包封或者偶聯(lián)的藥物帶到病變部位實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向治療；PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物水凝膠中的聚乙二醇具有優(yōu)良的親水性，且無毒，無免疫原性；PEG不僅可降低負(fù)載有藥物或基因的聚酰胺-胺型樹枝狀大分子的毒性，提高其安全性，而且可進(jìn)一步提高其分子量和親水性，從而減少滑膜巨噬細(xì)胞的攝取及藥物的滲漏，提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)關(guān)節(jié)腔中的滯留時(shí)間，提高療效。

附圖說明

圖1為Kartogenin(KGN)的¹HNMR圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制得的負(fù)載有Kartogenin(KGN)的聚酰胺-胺型樹狀大分子(PAMAM)聚合物的¹H NMR圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1制得的PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物的¹H NMR圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1制得的PLGA-PEG-PLGA凝膠溶液的相轉(zhuǎn)變溫度圖和儲(chǔ)能模量變化圖；

圖5本發(fā)明實(shí)施例1的負(fù)載有KGN的納米粒載體溫敏凝膠復(fù)合系統(tǒng)的體外釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離和培養(yǎng)

Wistar大鼠腹腔注射麻醉后脫頸處死，酒精浸泡大鼠15-20min；無菌取雙后肢，放入體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇浸泡5min；清除下肢肌肉，從膝關(guān)節(jié)斷離股骨。剪開股骨兩端，用10ml注射器吸取含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，制成單細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)濾過后以1×10⁸/L接種于75cm²培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h首次更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每2d換液1次。當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底面積的80％-90％時(shí)，傳代培養(yǎng)。之后，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底2/3時(shí)即可再次傳代擴(kuò)增，利用差速貼壁法分離純化MSCs。

KGN的合成及表征

鄰苯二甲酸酐(1.05equiv)溶解在無水氯仿/四氫呋喃(3:1)中，然后加入相應(yīng)量的(1equiv)的4-胺基聯(lián)苯?；旌弦菏覝?cái)嚢?～3h，旋蒸除去有機(jī)溶劑，得到kartogenin粗品。所得粗品溶于適量乙酸乙酯中，飽和鹽水清洗(×2)，硫酸鈉干燥，有機(jī)溶劑減壓濃縮，硅膠柱純化，如圖1所示，¹H NMR表征合成產(chǎn)物。

反應(yīng)式如下：

實(shí)施例1

負(fù)載有Kartogenin(KGN)的聚酰胺-胺型樹狀大分子(PAMAM)聚合物即PAMAM-NH₂-KGN的制備

Kartogenin和三乙胺溶于4mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫避光反應(yīng)1h，然后加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，相同條件下繼續(xù)反應(yīng)12h，最后加入PAMAM-NH₂(Molar ratio,KGN與PAMAM的摩爾比為25:1)繼續(xù)反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后用水透析除去DMF，超濾濃縮后葡聚糖G25凝膠柱純化，收集先流出的大分子部分，再次超濾濃縮，冷凍干燥得固體即PAMAM-NH₂-KGN。圖1為合成產(chǎn)物的¹H NMR表征。如圖1所示，7.3-8.3ppm為KGN的特征質(zhì)子峰，2.25ppm為PAMAM的特征質(zhì)子峰。

PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物的合成及表征

聚乙二醇(PEG)在異辛酸亞錫催化作用下與乙交酯、D,L-丙交酯開環(huán)聚合反應(yīng)生成透明粘稠膠體，PEG與(D,L-丙交酯+乙交酯)的重量比為1:2.3，D,L-丙交酯與乙交酯的摩爾比為1:5，PEG重量為1g，D,L-丙交酯的重量2.05g，乙交酯的重量約為0.25，凍干得PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物。所制備的PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物為略帶粘稠的、淡黃色的、透明膠狀物。

反應(yīng)式如下：

圖2為PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物的¹H NMR表征。如圖2所示，a-1.55ppm峰是乳酸中甲基-CH3的質(zhì)子峰，b-3.60ppm是聚乙二醇主鏈中重復(fù)單元亞甲基-CH2的質(zhì)子峰，c-4.36ppm是乙二醇與乙交酯(或丙交酯)所連亞甲基-CH2的質(zhì)子峰，聚乙二醇中靠近PLGA嵌段的兩個(gè)亞甲基-CH2的質(zhì)子峰位于d-4.80ppm。e-5.20ppm是乳酸中次甲基-CH的質(zhì)子峰。

不同濃度的PLGA-PEG-PLGA凝膠溶液相轉(zhuǎn)變溫度測(cè)定

聚合物凝膠的相轉(zhuǎn)變溫度采用的是試管倒置法。制備一系列濃度的PLGA-PEG-PLGA共聚物水溶液，取1mL將其加入直徑為10mm的玻璃瓶中，將玻璃瓶放在4℃冰箱去除氣泡，恒溫24h，取出后置于恒溫的20℃水浴中，每攝氏度下穩(wěn)定15min，取出倒置180°，30s內(nèi)看玻璃瓶底的凝膠是否流動(dòng)，每次升溫1℃，然后重復(fù)以上步驟，直到凝膠30s內(nèi)不發(fā)生流動(dòng)現(xiàn)象，我們就說共聚物發(fā)生了sol-gel的相轉(zhuǎn)變，則此時(shí)溫度為相轉(zhuǎn)變溫度。

負(fù)載有KGN藥物分子的納米粒載體溫敏凝膠復(fù)合系統(tǒng)即KGN/PLGA-PEG-PLGA的制備

將2g上述PLGA-PEG-PLGA共聚物置于10ml溶劑中制得共聚物溶液；

在攪拌下，將0.2g上述PAMAM-NH₂-KGN加入共聚物溶液中，繼續(xù)攪拌得負(fù)載有KGN藥物分子的納米凝膠復(fù)合系統(tǒng)即KGN/PLGA-PEG-PLGA。

PLGA-PEG-PLGA凝膠溶液的相轉(zhuǎn)變溫度和儲(chǔ)能模量變化如圖4所示。

KGN/PLGA-PEG-PLGA復(fù)合系統(tǒng)的體外釋放實(shí)驗(yàn)

步驟1：空白溫敏凝膠的制備

精密稱量2g上述PLGA-PEG-PLGA共聚物適量于燒杯中，加入10ml的蒸餾水，于4℃冰箱中保存至凝膠充分的溶脹，然后不斷攪拌直至共聚物溶解、分散均勻，得到略帶黃色透明的PLGA-PEG-PLGA共聚物溫敏凝膠溶液即空白溫敏凝膠。

步驟2：KGN/PLGA-PEG-PLGA溫敏凝膠的體外釋放

選用pH7.4的磷酸緩沖液作為體外釋放介質(zhì)，由于周期較長(zhǎng)，故加入0.02％疊氮鈉作為防腐劑。

在底部?jī)?nèi)徑為10mm的具塞玻璃管中加入上述KGN/PLGA-PEG-PLGA復(fù)合物的水溶液，然后放入37±1℃的恒溫水浴搖床中(35stocks/min)。首先，水浴中放置10min而使其成為凝膠。然后加入pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液6mL，其中含有0.02％疊氮鈉。每次取樣3mL，同時(shí)加入相同溫度體積的新鮮緩沖溶液以達(dá)到漏槽條件。以不載藥的水凝膠作為空白參照，同時(shí)在相同時(shí)間點(diǎn)間隔取樣。紫外分光光度法測(cè)定KGN在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值，空白參照用來校正降解產(chǎn)物對(duì)于紫外測(cè)試的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，PLGA-PEG-PLGA溫敏凝膠對(duì)KGN的釋放起到明顯的緩釋作用。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。