本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

大黃酸是從大黃、何首烏、番瀉葉、蘆薈等中藥中提取分離出來或經(jīng)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)制備而得，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、降糖調(diào)脂、保肝抗纖維化等多種藥理活性，它具有類似四環(huán)素類的結(jié)構(gòu)特征，具有堿金屬粒子絡(luò)合能力，使其具有親骨性，并且在治療骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病腎病等疾病及協(xié)同抗腫瘤方面表現(xiàn)突出。大黃酸在水，乙醇等溶劑中溶解性差，無法將其制成注射劑；而口服大黃酸后體內(nèi)消除較快，從而導(dǎo)致生物利用度低，限制了其在臨床上的應(yīng)用。近幾年來關(guān)于大黃酸的結(jié)構(gòu)修飾方面主要集中在7位酚羥基和三位羧基的，七位酚羥基主要是形成醚鍵或者與羧基發(fā)生酯化，從而提高大黃酸的抗炎活性，三位羧基多形成酰胺鍵和酯鍵。目前關(guān)于形成酰胺鍵的研究較多，主要用于提高大黃酸的抗腫瘤作用，而將大黃酸酯化，然后改變它的理化性質(zhì)，再將其制成制劑的研究目前還沒有出現(xiàn)過。

納米混懸劑系采用少量表面活性劑穩(wěn)定純藥物粒子所形成的一種亞微米膠體分散體系，納米混懸劑能增加難溶性藥物溶出度、提高藥物的生物利用度、增加藥物的穩(wěn)定性及提高藥效，同時納米混懸劑中“純的”藥物納米晶對胃腸道和黏膜組織具有較好的黏附性，可以延長藥物在體內(nèi)的滯留時間，進(jìn)一步提高生物利用度。納米混懸劑中的藥物粒子通常以無定型和晶體兩種形式存在，藥物粒子的不同形態(tài)對于藥物的溶出以及吸收有很大的影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑及其制備方法，采用大黃酸酯衍生物的形式提高大黃酸的脂溶性，再以大黃酸酯衍生物納米混懸劑的形式提高其水溶性，最終提高大黃酸的生物利用度。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑，由穩(wěn)定劑和大黃酸酯衍生物組成，所述大黃酸酯衍生物為化合物A或化合物B，化合物A的結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)和化合物B的結(jié)構(gòu)式(Ⅲ)如下所示：

所述的一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑，按重量百分比計算，包含1.8％-76％的大黃酸酯衍生物，5％-66％的穩(wěn)定劑。

所述的一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑，所述穩(wěn)定劑為泊洛沙姆、磷脂、十二烷基硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮PVP、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯中的一種或兩種以上組合。

所述的一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑，所述穩(wěn)定劑為泊洛沙姆和磷脂復(fù)配，且二者的重量比為1:5～5:1。

所述的一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑，所述泊洛沙姆的型號為泊洛沙姆F68，泊洛沙姆F87，泊洛沙姆F108或泊洛沙姆F127。

所述的一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑，所述磷脂為大豆卵磷脂，蛋黃卵磷脂或氫化大豆磷脂。

所述的大黃酸酯衍生物納米混懸劑的制備方法，步驟如下：

1)將大黃酸酯衍生物溶于有機溶劑中，得有機相；

2)將穩(wěn)定劑溶于去離子水中，得到水相；

3)在冰水浴中，將有機相緩慢的滴加到水相中，攪拌10～30min，得到初混懸液；

4)在10000～20000轉(zhuǎn)速下剪切1～5min進(jìn)行預(yù)分散；

5)預(yù)分散后的混懸液經(jīng)微射流在6900～14000psi壓力下均質(zhì)2～25次，最后得到大黃酸酯衍生物納米混懸劑。

所述的制備方法，步驟1)的有機溶劑為乙醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，二甲基甲酰胺DMF或二甲基亞砜DMSO。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明可通過沉淀法和分散方法聯(lián)用制備納米混懸劑，分散方法為高速剪切，超聲探頭法，高壓均質(zhì)法中的任意一種或多種。本發(fā)明通過采用大黃酸3位羧基的酯化，引入酯鍵和不同長度的碳鏈，從而可以提高化合物的脂溶性，改變其油水分配系數(shù)；并以該大黃酸酯衍生物作為有效成分研制出了納米混懸劑。大黃酸酯衍生物納米混懸劑的制備解決了大黃酸生物利用低，臨床應(yīng)用開發(fā)困難的問題。本發(fā)明采用大黃酸酯衍生物，可以改善化合物的理化性質(zhì)，對大黃酸的臨床應(yīng)用開發(fā)有重要意義。且本發(fā)明使用少量穩(wěn)定劑和有機溶劑，安全性高，工藝簡單。

本發(fā)明載藥量高，適合臨床上大劑量使用的藥物。通過大鼠體內(nèi)藥動實驗的研究，本發(fā)明能提高大黃酸的生物利用度。

本發(fā)明將大黃酸酯衍生物的合成同制劑結(jié)合，從化學(xué)性質(zhì)因素和物理因素兩方面進(jìn)行研究，最后使得大黃酸的生物利用度得到較大范圍的提高。本發(fā)明為難溶于水，難溶于有機溶劑的化合物臨床應(yīng)用提供了思路。

附圖說明

圖1為實施例10制備的大黃酸丁二醇酯納米混懸劑(RH-BE-NS)透射電鏡圖。

圖2為實施例10制備的大黃酸丁二醇酯納米混懸劑粒徑分布圖。

圖3為實施例10制備的的大黃酸丁二醇酯納米混懸劑的Zeta電位圖。

圖4表示本發(fā)明的大黃酸、大黃酸酯衍生物、大黃酸丁二醇酯納米混懸劑藥時曲線圖。

圖5表示本發(fā)明制備的大黃酸乙二醇酯(RH-EE)質(zhì)譜圖。

圖6表示本發(fā)明制備的大黃酸丙二醇酯(RH-PE)質(zhì)譜圖。

圖7表示本發(fā)明制備的大黃酸丁二醇酯(RH-BE)質(zhì)譜圖。

圖8表示本發(fā)明制備的大黃酸一縮二乙二醇酯(RH-DE)質(zhì)譜圖。

圖9表示本發(fā)明制備的大黃酸三縮四乙二醇酯(RH-TE)質(zhì)譜圖。

具體實施方式

大黃酸衍生物的制備

大黃酸與HO(CH₂)_nOH或H(OCH₂CH₂)_nOH通過酯化反應(yīng)形成羧酸酯衍生物。

具體步驟如下：將大黃酸和H(OCH₂CH₂)_nOH或者HO(CH₂)_nOH加入到有機溶劑(甲苯或氯仿)中，然后緩慢滴加催化劑，80-90℃攪拌反應(yīng)2～8h。待反應(yīng)液降至室溫，倒入冰水中，抽濾，得到濾液和濾餅。濾液中加入二氯甲烷萃取，直至二氯甲烷層不再有顏色，合并二氯甲烷層，干燥，減壓濃縮得到產(chǎn)物為黃色固體。濾餅用飽和碳酸氫鈉溶液多次打漿，洗去殘留的大黃酸，過濾，濾餅干燥，得產(chǎn)物，產(chǎn)物均為黃色固體即大黃酸衍生物。由圖5-9可知：上述方法成功合成了大黃酸酯衍生物-大黃酸乙二醇酯、大黃酸丙二醇酯、大黃酸丁二醇酯、大黃酸一縮二乙二醇酯和大黃酸三縮四乙二醇酯。

核磁結(jié)果:

大黃酸乙二醇酯(RH-EE)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ12.04(s,1H,OH),11.97(s,1H,OH),8.43(s,1H,Ar-H),7.97(s,1H,Ar-H),7.89(d,J＝7.2Hz,1H,Ar-H),7.76-7.73(m,1H,Ar-H),7.35(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),4.54(t,2H,CH₂CH₂OH),4.03(t,2H,CH₂CH₂OH)。

大黃酸丙二醇酯(RH-PE)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ12.04(s,1H,OH),11.97(s,1H,OH),8.43(s,1H,Ar-H),7.97(s,1H,Ar-H),7.89(d,J＝7.2Hz,1H,Ar-H),7.76-7.73(m,1H,Ar-H),7.35(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),4.54(t,2H,CH₂CH₂OH),4.03(t,2H,CH₂CH₂OH)。

大黃酸丁二醇酯(RH-BE)

¹H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.03(s,1H),11.98(s,1H),8.42(s,1H,Ar-H),7.94(s,1H,Ar-H)7.88(d,J＝7.4Hz,1H,Ar-H),7.75-7.73(m,1H,Ar-H),7.34(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),7.27(s,1H,Ar-H),4.44(t,2H,COOCH₂),3.76(t,2H,COOCH₂CH₂),1.95–1.91(m,2H,CH₂OH),1.78–1.74(m,2H,CH₂CH₂OH).

大黃酸一縮二乙二醇酯(RH-DE)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ12.04(s,1H,OH),11.97(s,1H,OH),8.42(s,1H,Ar-H)7.94(s,1H,Ar-H),7.88(d,J＝7.2Hz,1H,Ar-H),7.75-7.73(m,1H,Ar-H),7.35(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),4.58–4.55(m,COOCH₂),3.90–3.88(m,2H,COOCH₂CH₂O),3.81–3.79(m,2H,CH₂CH₂OH),3.70–3.68(m,2H,CH₂CH₂OH),1.88(s,1H,CH₂CH₂OH).

大黃酸三縮四乙二醇酯(RH-TE)

1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.03(s,1H,OH),11.97(s,1H,OH),8.44(s,1H,Ar-H),7.97(s,1H,Ar-H),7.88(d,J＝7.4Hz,1H,Ar-H),7.75-7.73(m,1H,Ar-H),7.34(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),4.56–4.54(m,2H,COOCH₂CH₂),3.89–3.87(m,2H,COOCH₂CH₂),3.74-3.72(m,12H).

本發(fā)明大黃酸衍生物納米混懸劑制備實例(其中大黃酸衍生物以大黃酸丁二醇酯為例)

實施例1一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

制備方法如下：

1)將10mg大黃酸丁二醇酯溶于1mL DMF中，超聲至完全溶解后得到溶液A。

2)稱取25mg的F68和25mg的大豆卵磷脂置于50mL去離子水中，超聲至完全溶解得到溶液B。

3)將溶液B置于冰水浴中，在攪拌的條件下，將溶液A緩慢的加入溶液B中，攪拌30min，將得到的初混懸劑。

4)在20000轉(zhuǎn)速下剪切2min。

5)然后馬上在11850psi壓力下進(jìn)行微射流，循環(huán)15次，最后得到大黃酸酯衍生物納米混懸劑，測得粒徑為235nm，PDI為0.124，Zeta電位為-20.9mv。

實施例2一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

方法同實施例1，僅將步驟1)中的有機溶劑由DMF改為乙醇，最后得到大黃酸酯衍生物納米混懸劑，測得粒徑為432nm，PDI為0.276，Zeta電位為-17.1mv。

實施例3一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

方法同實施例1，僅將步驟1)中的有機溶劑由DMF改為二氯甲烷，最后得到大黃酸酯衍生物納米混懸劑，測得粒徑為500nm左右，PDI位0.875，Zeta點位為-21.5mv。

由實施例1-3可知，以DMF為有機溶劑時，制備出的納米混懸劑粒徑和PDI最小。當(dāng)以二氯甲烷或乙醇為有機溶劑時，制備出的納米混懸劑較DMF粒徑分布較寬，PDI值較大；粒徑都是400nm以上；但是以二氯甲烷和乙醇為有機溶劑時，有機溶劑較易旋出，有機溶劑殘留較少；以乙醇為有機溶劑時制備出的納米混懸劑較二氯甲烷為有機溶劑時制備出的納米混懸劑穩(wěn)定。

實施例4利用沉淀法制備大黃酸酯衍生物納米混懸劑

將50mg大黃酸丁二醇酯溶于1mLDMF中得到溶液A。稱取25mg泊洛沙姆F68，20mg卵磷脂溶于50mL水中得到溶液B。將溶液A緩慢滴加到溶液B中，攪拌30min，最后得到大黃酸酯衍生物混懸劑，測得其粒徑為760nm，PDI為0.964，Zeta電位-21.8mv。

實施例5利用直接高壓均質(zhì)法制備大黃酸酯衍生物納米混懸劑

此法不使用有機溶劑，處方量同實施例3，直接將50mg的大黃酸丁二醇酯加入到含有穩(wěn)定劑的溶液B中，然后在20000轉(zhuǎn)速下剪切4min，立即在11859psi壓力下進(jìn)行微射流，循環(huán)15次，最后制備出大黃酸酯衍生物納米混懸劑。此法制備出的納米混懸劑安全無毒，然而在制備的過程中會有損失，堵塞微射流，且制劑不穩(wěn)定，容易聚集。測得其粒徑為348m，PDI為0.453，Zeta電位-19.5mv。

實施例6利用超聲探頭法制備大黃酸酯衍生物納米混懸劑

稱取50mg大黃酸丁二醇酯置于1mL DMF中，超聲至完全溶解得到溶液A。然后稱取25mg F68，20mg卵磷脂置于40mL去離子水中，超聲至完全溶解得到溶液B。將溶液A緩慢滴加到溶液B中，攪拌30min，立即用超聲探頭在315W的功率下超聲4min，最后得到大黃酸酯衍生物納米混懸劑。此法得到的納米混懸劑雖然簡單，藥量損失少，但是得到制劑不穩(wěn)定，易聚沉。測得其粒徑為495nm，PDI為0.688，Zeta電位-23.5mv。

實施例7利用本發(fā)明沉淀法與高壓均質(zhì)結(jié)合法制備大黃酸酯衍生物納米混懸劑

1)稱取50mg大黃酸丁二醇酯置于1mL DMF中，超聲至完全溶解得到溶液A。

2)稱取25mg F68、20mg卵磷脂置于40mL去離子水中，超聲至完全溶解得到溶液B。

3)將溶液B置于冰水浴中，在攪拌的條件下，將溶液A緩慢滴加到B中，攪拌30min，將得到的初混懸劑。

4)然后在20000轉(zhuǎn)速下剪切4min。

5)立即在11859psi壓力下進(jìn)行微射流，循環(huán)15次，最后制備出大黃酸酯衍生物納米混懸劑，沉淀法與高壓均質(zhì)法結(jié)合制備出的納米混懸劑穩(wěn)定，不易聚沉，且PDI較小，粒徑均一，粒徑為234nm，PDI為0.165，Zeta電位-21.5mv。

由實施例4-7，以直接高壓均質(zhì)法制備納米混懸劑的方法簡單易行，且不使用有機溶劑，但是對藥物的損失較大，且容易改變藥物的濃度，同時容易堵塞微射流，對于機器的損耗較大。以超聲探頭法制備納米混懸劑是沉淀法與超聲探頭結(jié)合的方法，對于藥物無損失，也不會改變藥的濃度，但是制備出的制劑粒徑不均勻。以沉淀法和高壓均質(zhì)法結(jié)合制備出納米混懸劑的穩(wěn)定性好，粒徑均勻，對微射流損耗較小，但是需要使用有機溶劑，且藥物損失較多。

實施例8一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

方法同實施例7，僅將步驟1)中大黃酸丁二醇酯用量改為100mg最后得到納米混懸劑，測得其粒徑233.5nm，PDI為0.254，Zeta電位為-17.6mv。

實施例9一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

方法同實施例7，僅將步驟1)中大黃酸丁二醇酯用量改為200mg最后得到納米混懸劑，測得其粒徑474.3nm，PDI為0.308，Zeta電位為-19.8mv。

由實施例7、8和9可知，大黃酸丁二醇酯的不同含量是影響納米混懸劑粒徑以及PDI的一個關(guān)鍵因素，隨著大黃酸丁二醇酯含量的增加，納米混懸劑的粒徑以及PDI隨之增大，Zeta電位隨之減小。由于穩(wěn)定劑是黏附在藥物粒子的表面，以及分散在水溶液中，使得藥物粒子不會發(fā)生聚集，保持一個穩(wěn)定平衡狀態(tài)。但是隨著藥物濃度增大，平衡被破壞，藥物粒子雖然在高壓均質(zhì)下減小，但是會快會聚集，使得粒徑增大，PDI值增大。

實施例10一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

方法同實施例7，僅將步驟2)中的穩(wěn)定劑25mg F68、20mg卵磷脂改為20mg F68、10mg卵磷脂，最后得到納米混懸劑，測得粒徑為256.3nm，PDI為0.154，Zeta電位為-22.6mv。

由圖1可知，大黃酸丁二醇酯納米混懸劑的藥物粒子呈球形，粒子之間不黏連，粒徑在230nm左右，說明大黃酸丁二醇酯納米混懸劑穩(wěn)定，未發(fā)生聚集。由圖2可知，大黃酸丁二醇酯納米混懸劑的粒徑在230nm左右，與透射電鏡測定結(jié)果接近。由圖3可知，大黃酸丁二醇酯納米混懸劑的Zeta電位絕對值大于20。

實施例11一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

方法同實施例7，僅將步驟2)中的穩(wěn)定劑25mg F68、20mg卵磷脂改為20mg F127、10mg卵磷脂，最后得到納米混懸劑。最后得到納米混懸劑，測得粒徑為427nm，PDI為0.613，Zeta電位為-17.1mv。

實施例12一種大黃酸酯衍生物納米混懸劑

方法同實施例7，僅將步驟2)中的穩(wěn)定劑25mg F68、20mg卵磷脂改為20mg F68、10mg維生素E聚乙二醇琥珀酸酯，最后得到納米混懸劑。測得粒徑為496.5nm，PDI為0.482，Zeta電位為-20.8mv。

由實施例7、10-12可知，不同的穩(wěn)定劑種類對于納米混懸劑的粒徑、Zeta電位，PDI的影響較大。F127和F68都屬于親水性泊洛沙姆，但是以F127和卵磷脂合用時，所制備出的納米混懸劑粒徑及PDI較F68大；以維生素E聚乙二醇琥珀酸酯和卵磷脂合用時，所制備出的納米混懸劑粒徑較大，但Zeta電位與F68結(jié)果接近，維生素E聚乙二醇琥珀酸酯雖然可以作為乳化劑，穩(wěn)定劑，增溶劑，同時可以促進(jìn)藥物吸收，但是其不利于制備較小粒徑的納米混懸劑。

由上可知：本發(fā)明的優(yōu)選配方如下：

表1為優(yōu)選配方

大黃酸酯衍生物及大黃酸油水分配系數(shù)的測定

取200mL正辛醇，用等量的蒸餾水飽和(在振蕩器中震蕩24h),分別稱取定量大黃酸以及大黃酸酯衍生物，將其分別加入到5mL蒸餾水飽和的正辛醇中，最后得到藥物的正丁醇溶液，再加入等量的正辛醇飽和的水溶液，將其置于空氣振蕩器中，震蕩24h，溫度為常溫，震蕩速度，155rpm。最后用液相測定油相的濃度，然后根據(jù)油相計算出水相的藥物濃度。

表2油水分配系數(shù)

結(jié)果分析，除了一縮二乙二醇酯衍生物外，其它產(chǎn)物的油水分配系數(shù)均大于大黃酸。大黃酸、大黃酸酯衍生物、大黃酸酯衍生物納米混懸劑的體內(nèi)藥動學(xué)。

以大黃酸丁二醇酯納米混懸劑為例研究

取42只SD大鼠，體重為250g±40g，隨機分成7組，每組6只，給藥前禁食12小時，但是自由飲水，給藥前稱重，7組大鼠分別口服灌胃為大黃酸(混懸于0.5％的CMCNa溶液)，大黃酸酯衍生物(混懸于0.5％的CMCNa溶液)，大黃酸丁二醇酯納米混懸劑，然后于5min，10min，15min，20min，30min，1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h，24h眼眶取血1mL，置于肝素管中，在10000轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清，然后處理樣品，用液相測定大黃酸的血藥濃度。

表3藥動數(shù)據(jù)參數(shù)

從表3中可以看出，大黃酸酯衍生物，隨著碳鏈的增長，AUC值逐漸增大。

大黃酸三縮四乙二醇酯與其他酯衍生物相比，它對于大黃酸的AUC提高的最多，提高了2.17倍，但是它的T_max最小，這是由于不僅引入了酯鍵和長碳鏈，還引入了醚鍵和羥基，它們與水形成氫鍵從而導(dǎo)致水溶性和脂溶性都有所提高導(dǎo)致的。

由上可知，大黃酸丁二醇酯納米混懸劑大鼠口服灌胃后得到大黃酸的AUC為84.09，與大黃酸原料藥(AUC_0-∞＝34.12)相比提高了2.46倍。

圖4表示本發(fā)明的大黃酸、大黃酸酯衍生物、大黃酸丁二醇酯納米混懸劑藥時曲線圖。由圖4可知，將大黃酸酯衍生物制成納米混懸劑后，大黃酸酯衍生物在體內(nèi)可以迅速斷開，形成大黃酸，從而使大黃酸的生物利用度得到了明顯的提高。