本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物及其制備方法，特別是通過自組裝構(gòu)建的逐級響應(yīng)的納米前藥組裝體制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，抗腫瘤藥物在體內(nèi)遞送過程中面臨著多重的生理屏障，例如，在血液循環(huán)過程中面臨被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除的可能；通過血管進入腫瘤組織后由于腫瘤組織間質(zhì)壓較高，阻礙藥物向腫瘤深處的滲透；進入細胞時，細胞膜會阻礙藥物的攝取；對于多藥耐藥細胞，藥物進入細胞后，細胞表面的外排蛋白會將藥物排出，降低藥效，等等。因此逐級克服這些生理屏障成為化療藥物系統(tǒng)傳遞亟待解決的問題。目前，樹枝狀超分子組裝體在納米材料和納米藥物方面引起了廣泛的關(guān)注，其機械結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表面官能團豐富，生物相容性良好。我們在樹狀大分子組裝基元中引入腫瘤外基質(zhì)、腫瘤細胞質(zhì)和溶酶體中逐級敏感的化學(xué)鍵，構(gòu)建逐級響應(yīng)樹枝狀納米組裝體，希望能夠通過這種分子設(shè)計，攻克多重生理屏障，實現(xiàn)藥物的高效遞送。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有納米載體難以突破生理屏障的缺陷，提供一種在系統(tǒng)遞送過程中能夠逐級響應(yīng)，克服生理屏障的一種逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥(即納米前藥組裝體)。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥，前藥由雙親性肽類樹狀分子構(gòu)成，其親水片段通過腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的敏感多肽或敏感鍵與樹狀分子骨架連接，其疏水片段通過溶酶體內(nèi)響應(yīng)的敏感鍵或多肽將抗腫瘤藥物與樹狀分子骨架偶聯(lián)；親水片段與疏水片段通過腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)響應(yīng)的敏感鍵或多肽連接。

上述前藥的分子結(jié)構(gòu)式如下：

其中，R₁代表腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的多肽或敏感鍵，選自MMP-2敏感肽(多肽序列為：GPLGLAG，GPQGIWGQ或GPLGIAGD)或腫瘤微環(huán)境弱酸性敏感基團，選自2,3-二甲基馬來酸酐、2,2,3,3-四甲基馬來酸酐；

R₂代表腫瘤細胞質(zhì)中響應(yīng)的多肽或敏感鍵，選自凋亡蛋白(caspase-3/7)敏感多肽(DEVD)或GSH敏感鍵(二硫鍵或二硒鍵)；

R₃代表溶酶體中響應(yīng)的多肽或敏感鍵，選自酯鍵、組織蛋白酶敏感多肽(GFLA)或溶酶體pH 5.0環(huán)境可斷裂的腙鍵；抗腫瘤藥物Drug偶聯(lián)在R3上。

上述前藥為通過自組裝形成100-200nm的粒子；所述抗腫瘤藥物Drug選自鹽酸阿霉素、喜樹堿或紫杉醇。

本發(fā)明的另一目的是提供一種逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥的制備方法。

本發(fā)明的另一目的是這樣實現(xiàn)的：一種逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥的制備方法，包括以下制備步驟：

1)制備雙親性肽類樹狀前藥分子，它由抗腫瘤藥物偶聯(lián)在雙親性肽類樹狀分子的化學(xué)鍵上組成；

2)將一定濃度的親性肽類樹狀前藥分子溶解于良溶劑中，在超聲作用下將上述溶液滴入去離子水中，通過親疏水作用進行自組裝，構(gòu)建逐級響應(yīng)的粒徑100～200nm的納米粒子；

3)利用透析方法純化，然后冷凍干燥得到納米粒子的前藥。

上述步驟1)的具體制備方法為：

a)對氨基酸進行保護：根據(jù)所要制備肽類樹狀大分子支化單元的不同對氨基或聯(lián)氨進行保護；

b)制備二代肽類樹狀分子：按照比例稱取芴甲氧羰基(Fmoc)保護的谷氨酸，上述a)中氨基含有保護基團的谷氨酸(3倍當(dāng)量)、縮合劑(3倍當(dāng)量)、催化劑(3倍當(dāng)量)和有機堿(12倍當(dāng)量)，氮氣保護及0℃條件下加入溶劑反應(yīng)；室溫下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，所得溶液通過洗滌，干燥，減壓濃縮，利用柱層析得到帶有保護基團的二代肽類樹狀分子；

c)脫保護：精確稱取二代肽類樹狀大分子，加入脫保護試劑(40倍當(dāng)量)及溶劑，在氮氣保護下反應(yīng)12h，減壓濃縮，通過沉淀，獲得二代肽類樹狀分子；

d)抗腫瘤藥物的偶聯(lián)：將上述二代肽類樹狀分子和抗腫瘤藥物在氮氣保護下加入溶劑溶解，在催化劑下反應(yīng)，隨后加入蒸餾水溶解，最后經(jīng)冷卻凍干燥制得成品。

上述抗腫瘤藥物選自鹽酸阿霉素、喜樹堿或紫杉醇；所述溶劑為甲醇，所述催化劑為冰醋酸。

本發(fā)明的再一目的是提供上述前藥的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的是這樣實現(xiàn)的：一種逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥的應(yīng)用，前藥在腫瘤外基質(zhì)高表達的酶(如金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs))或特定的理化環(huán)境(如弱酸性環(huán)境、低氧等)的作用下能夠斷裂脫去親水端的聚乙二醇。

上述前藥在腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)酶(如凋亡蛋白)或特定理化環(huán)境(如高濃度的GSH)作用下能夠斷裂，引起組裝體的崩解。

上述前藥在腫瘤細胞溶酶體內(nèi)酶(如組織蛋白酶)或特定理化環(huán)境(如pH 5.0)作用下能夠斷裂釋放抗腫瘤原藥(如阿霉素(DOX)、喜樹堿和紫杉醇等)。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明在雙親性樹狀大分子中引入環(huán)境響應(yīng)的化學(xué)鍵或酶敏感的多肽，利用化學(xué)鍵將藥物連接在雙親性樹狀大分子的疏水端，通過自組裝構(gòu)建逐級響應(yīng)的納米前藥組裝體。

1、本發(fā)明所述的逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥，將肽類樹狀大分子與抗腫瘤藥物偶聯(lián)，通過自組裝所得到的納米組裝體具有良好的穩(wěn)定性，強的腫瘤滲透及腫瘤抑制效果。同時，多級響應(yīng)的前藥組裝體能夠更好的克服遞送過程中的生理屏障，實現(xiàn)藥物的高效遞送。

2、本發(fā)明所述的逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥組裝體在生理條件下能夠依賴外層負電性的聚乙二醇外殼抵抗血液中的蛋白吸附，提高血液循環(huán)時間。

3、本發(fā)明所述的逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥組裝體，能夠自組裝形成100-200nm的粒子，通過腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)在腫瘤部位富集。

4、本發(fā)明所述的逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥組裝體，能夠利用腫瘤部位高表達的酶(如，金屬基質(zhì)蛋白酶)或特定的生理環(huán)境(如，弱酸性)的作用下脫去帶有負電的聚乙二醇外殼，從而增加腫瘤細胞的攝取。

5、本發(fā)明所述的逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥組裝體，能夠在細胞質(zhì)內(nèi)酶(如，凋亡蛋白)或高水平谷胱甘肽(10mM)的作用下解組裝，形成尺寸較大的聚集體，有助于藥物在腫瘤細胞內(nèi)的富集。

6、本發(fā)明所述的逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥組裝體，能夠在溶酶體內(nèi)酶(如，組織蛋白酶)或弱酸性(pH 5.0)的條件下釋放抗腫瘤原藥，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

7、本發(fā)明所述的逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥組裝體，提供了一種克服藥物遞送過程中多種生理屏障的普適性方法，可應(yīng)用于其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

8、這種前藥組裝體能夠克服多重生理屏障，實現(xiàn)藥物的高效遞送。另外，前藥設(shè)計能夠避免藥物被外排蛋白識別，克服多藥耐藥。

附圖說明

圖1本發(fā)明所述逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥組裝體藥物遞送過程示意圖。

圖2實施例1中所述親水端一代樹狀分子的合成。

圖3實施例1中所述親水端二代樹狀分子的合成。

圖4實施例1中所述疏水端樹狀分子骨架的合成。

圖5實施例1中所述親水和疏水的偶聯(lián)。

圖6實施例1中所述藥物分子的偶聯(lián)。

圖7-1、7-2和7-3為實施例1中所述兩親性樹枝狀前藥分子的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物的質(zhì)譜及核磁表征。

圖8實施例2中所述的高效液相色譜。

圖9實施例2中所述的質(zhì)譜。

圖10實施例2所述的DNs的圓二色譜。

圖11實施例2中所述的DNs的粒徑及TEM照片。

圖12實施例5中所述的不同生理環(huán)境下DNs的粒徑變化。

圖13實施例5中所述的不同生理環(huán)境下DNs的形貌變化。

圖14實施例6中所述的不同條件下DOX的釋放曲線。

圖15實施例7中所述MCF7R細胞與不同濃度DNs、DOX、DOX.HCl和未接DOX的樹狀分子孵育48h后的細胞毒性。

圖16實施例8中所述的MCF7R細胞分別與DOX、DOX.HCl和DNs(DOX濃度：10μg/mL)孵育2h后的DOX陽性細胞數(shù)量和各組的平均熒光強度。

圖17實施例8中所述的在加入MMP-2或MMPs抑制劑(Phen)后MCF7R對DNs的攝取量。

圖18實施例9中所述的DNs在遞送過程研究的激光共聚焦圖片。

圖19實施例10中所述的體外細胞球滲透研究的激光共聚焦照片。

圖20實施例11中所述的治療過程中的腫瘤體積。

圖21實施例12中所述的DOX.HCl和DNs的活體成像照片。

圖22實施例13中所述的DOX.HCl、DNs、L-DNs在小鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)曲線。

圖23實施例14中所述的DOX.HCl和DNs在體內(nèi)的滲透效果。

具體實施方式

一種逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥，具有式1所示結(jié)構(gòu)：

作為可選方式，R1(腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的化學(xué)鍵或多肽)為：

中的一種。

作為可選方式，R2(腫瘤細胞內(nèi)敏感的化學(xué)鍵或多肽)為：中的一種。

作為可選方式，R2(溶酶體內(nèi)敏感的化學(xué)鍵或多肽)為中的一種。

作為可選方式，Drug為阿霉素、紫杉醇、喜樹堿中的一種。

本發(fā)明還提供了一種制備上述逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥的方法，具體步驟如下：

1)制備兩親性肽類樹狀前藥分子

2)將一定濃度的兩親性肽類樹狀前藥分子溶解于良溶劑中，在超聲條件下將上述溶液緩慢滴入去離子水中，通過親疏水作用進行組裝。

3)在通過透析的方法出去有機溶劑，利用冷凍干燥制得納米粒子。

作為可選方式，步驟1)中兩親性肽類樹狀前藥分子可通過收斂法、發(fā)散法或收斂-發(fā)散結(jié)合的方法制備。

作為可選方式，步驟1)中兩親性肽類樹狀前藥分子的具體制備方法為：

a)對氨基酸進行保護：根據(jù)所要制備肽類樹狀大分子支化單元的不同對氨基或聯(lián)氨進行保護；

b)制備二代樹狀分子：按照比例稱取芴甲氧羰基(Fmoc)保護的谷氨酸，上述a)中氨基含有保護基團的谷氨酸(3倍當(dāng)量)、縮合劑(3倍當(dāng)量)、催化劑(3倍當(dāng)量)和有機堿(12倍當(dāng)量)，氮氣保護及0℃條件下加入溶劑反應(yīng)；室溫下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，所得溶液通過洗滌，干燥，減壓濃縮，利用柱層析得到帶有保護基團的二代肽類樹狀分子；

c)脫保護：精確稱取二代肽類樹狀大分子，加入脫保護試劑(40倍當(dāng)量)及溶劑，在氮氣保護下反應(yīng)12h，減壓濃縮，通過沉淀，獲得二代肽類樹狀大分子；

本發(fā)明還提供了一種逐級響應(yīng)納米自組裝樹枝狀前藥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

實施例1：兩親性肽類樹狀前藥分子的制備(合成路線如圖1所示)

a)腫瘤微環(huán)境金屬基質(zhì)蛋白酶敏感衣殼的合成(NH₂-GPLGLAG-mPEG)

精確稱取2.00g Boc-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-COOH(Boc-GPLGLAG)，3.52g聚乙二醇單甲醚(平均分子量：750)，0.90g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和0.63g 1-羥基苯并三唑(HOBT)于帶有支管的單口瓶中，在氮氣保護下加入二氯甲烷(DCM)溶解，冰浴下加入2.1mL N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)。室溫下反應(yīng)24小時后，所得溶液經(jīng)洗滌，干燥，減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離得到Boc-GPLGLAG-mPEG。

脫叔丁氧羰基(Boc)保護

精確稱取2.00g Boc-GPLGLAG-mPEG置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入DCM溶解，然后加入1.0mL三氟乙酸(TFA)。室溫反應(yīng)10小時，所得溶液經(jīng)減壓濃縮后，加入冰冷的無水乙醚沉淀，得到白色粉末狀的化合物1。

b)一代樹狀分子的合成

精確稱取1.38g NH₂-GPLGLAG-mPEG、0.10g Boc-Glu-OH、0.62g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和0.12g HOBT置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴下加入0.79mL DIPEA.室溫反應(yīng)36小時后，所得溶液經(jīng)洗滌，干燥，減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離得到化合物2。

脫保護

將1.50g Boc-Glu-(GPLGLAG-mPEG)₂置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入DCM溶解，然后加入0.60mL三氟乙酸(TFA)。室溫反應(yīng)10小時，所得溶液經(jīng)減壓濃縮后，加入冰冷的無水乙醚沉淀，得到白色粉末狀的化合物3。

c)二代樹狀分子的合成

重復(fù)一代樹狀分子的合成步驟，將其中的NH₂-GPLGLAG-mPEG換成化合物3，合成得到化合物4，Boc保護脫除后得到化合物5。

d)水合肼-谷氨酸的合成

精確稱取1.75g叔丁氧羰基肼、2.00g Fmoc-Glu-OH、5.02g 1-羥基苯并三唑和1.79g HOBT置于帶有支管的單口瓶中。氮氣保護下加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴下加入8.74mL DIPEA.室溫反應(yīng)48小時后，所得溶液經(jīng)洗滌，干燥，減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離得到化合物6。

脫保護

將1.00g Fmoc-Glu-(hyd-Boc)₂置于單口瓶中，加入1M的氫氧化鈉甲醇溶液(16.75mL)。室溫反應(yīng)4小時，所得溶液經(jīng)減壓濃縮后加入蒸餾水溶解，用乙酸乙酯萃取，干燥，濃縮后得到化合物7。

e)親水片段與疏水片段的偶聯(lián)

精確稱取1.00g化合物7,0.56g 3,3`-二硫代二丙酸，0.51g EDC.HCl和0.36g HOBT置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入DCM溶解，然后加入2.6mL DIPEA。室溫反應(yīng)24小時，所得溶液經(jīng)洗滌，干燥，減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離得到化合物8。

將1.00g化合物5，0.153mg化合物8，0.141g PyBOP和36.50mg HOBT置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入DMF溶解，然后加入178μL DIPEA。室溫反應(yīng)24小時，所得溶液經(jīng)洗滌，干燥，減壓濃縮，經(jīng)柱層析分離得到化合物9。

脫保護

將1.00g化合物9置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入DCM溶解，然后加入123μL三氟乙酸(TFA)。室溫反應(yīng)10小時，所得溶液經(jīng)減壓濃縮后，加入冰冷的無水乙醚沉淀，得到白色粉末化合物10。

f)抗腫瘤藥物的偶聯(lián)

精確稱取0.5g化合物10和115.83mg鹽酸阿霉素置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入甲醇溶解，并加入催化量的冰醋酸。室溫反應(yīng)72小時，減壓濃縮，加入蒸餾水溶解。將溶液置于截留分子量為2000Da的透析袋中透析，然后冷凍干燥得到化合物11(DPs)。

實施例2：雙親性樹狀前藥分子的分子敏感

將DPs溶液分別在含有2μg/mL金屬基質(zhì)蛋白酶-2、10mM DTT和pH 5.0不同條件下孵育3小時。利用高效液相色譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜觀察不同條件作用后的分子片段。如圖7和圖8所示，上述條件作用后均觀察到了色譜峰的位移以及相應(yīng)分子片段的質(zhì)譜。

實施例3：多級響應(yīng)型前藥組裝體的制備

稱取10.00mg雙親性前藥分子溶解于1mL良溶劑二甲基亞砜中，配置成10.00mg/mL溶液。在超聲條件下將上述溶液滴入去離子水中進行組裝，透析(MWCO 2000Da)除去有機溶劑，然后冷凍干燥得到多級響應(yīng)型前藥組裝體(DNs)。

實施例4：DNs的表征

a)圓二色譜分析

將DNs溶解于水中，利用圓二色譜儀測定190nm–250nm的圓二色性。如圖9所示，DNs具有典型的二級結(jié)構(gòu)，12.4％α-螺旋,40.7％β-折疊,15.2％β-轉(zhuǎn)角和31.7％無規(guī)卷曲。

b)粒徑及形貌表征

配置100μg/mL DNs溶液，利用動態(tài)光散射法(DLS)測定DNs的粒徑及zeta電位。如圖10所示，DNs的粒徑為124.5nm。

配置100μg/mL DNs溶液，將其滴在銅網(wǎng)上，室溫干燥，然后用透射電鏡(TEM)觀察其納米結(jié)構(gòu)。如圖10所示，其結(jié)構(gòu)為球型納米粒子，分布均勻，粒徑與DLS數(shù)據(jù)吻合。

實施例5：不同生理環(huán)境下粒徑的變化

配置DNs(100μg/mL)溶液，將其分別在含有2μg/mL金屬基質(zhì)蛋白酶-2、10mM DTT和pH 5.0不同條件下孵育3小時。利用DLS測定不同條件作用后的粒徑及電位的變化。通過TEM觀察作用后DNs的形貌變化。

如圖11和圖12所示，2μg/mL金屬基質(zhì)蛋白酶-2作用后由于其外圍親水PEG脫除，DNs的粒徑減小至70nm。10mM DTT作用后，連接親水和疏水片段的二硫鍵斷裂，引起疏水片段的聚集成為約800nm的粒子，親水片段組成較約250nm的粒子。pH 5.0條件下，腙鍵斷裂釋放出疏水藥物阿霉素，DNs解組裝。

實施例6：DNs的體外藥物釋放研究

將200μg/mL DNs分別溶解于1mL pH7.4、2μg/mL金屬基質(zhì)蛋白酶-2、10mM DTT、10μM DTT、pH 6.8和pH 5.0的TCNB緩沖液，并轉(zhuǎn)移至截留分子量為1000Da的透析袋中。分別將上述透析袋置于20mL相應(yīng)的緩沖液中，37℃搖床中孵育。在設(shè)定的時間點取出1mL外液，并補充1mL相應(yīng)的新鮮TCNB緩沖液。溶液中的阿霉素含量用熒光光譜進行定量分析。

結(jié)果如圖13所示，pH 7.4、2μg/mL MMP-2和10μM DTT條件下，96小時時阿霉素的累積釋放量約為10％。10mM DTT條件下，96小時時阿霉素的釋放量不足15％。pH5.0條件下，能夠快速釋放藥物，96小時時累積釋放96％。表明該雙親性納米前藥能夠避免藥物在正常生理條件、腫瘤微環(huán)境及細胞質(zhì)中提前釋放，而到達溶酶體時，能夠快速釋放藥物。

實施例7：體外抗腫瘤效果

將人乳腺癌阿霉素耐藥細胞系(MCF7R)以1×10⁴細胞/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時。配置不同阿霉素濃度(0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100μg/mL)的DOX、DOX.HCl和DNs的DMEM高糖培養(yǎng)基溶液與細胞孵育48小時。將細胞用PBS洗三次，加入含10％CCK-8的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育2小時。然后用酶標(biāo)儀測定每個孔450nm處的吸光值。每個濃度設(shè)置6個平行樣。利用一下公式計算細胞存活率：

Cell Viability＝(OD_sample-OD_background)/(OD_control-OD_background)×100％

如圖14所示，抑制率為50％時所需DNs相應(yīng)的DOX濃度為17.8μg/mL，與DOX.HCl相比降低了9.6μg/mL，表明DNs能夠有效提高抗腫瘤效果。未與DOX偶聯(lián)的樹狀分子在較高濃度的時細胞存活率依然接近100％，表明其良好的生物相容性。

實施例8：細胞攝取

將MCF7R細胞以3×10⁵細胞/孔的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時。將阿霉素濃度為10μg/mL的DOX、DOX.HCl和DNs的培養(yǎng)基溶液于細胞孵育2h。將細胞用PBS洗三次，用胰酶消化收集細胞。用離心的方法除去培養(yǎng)基，加入300μL PBS緩沖液，通過流式細胞儀測定阿霉素的攝取量。

如圖15所示，與其DOX和DOX.HCl相比DNs大大提高了腫瘤細胞對阿霉素的攝取量。另外，在外加金屬基質(zhì)蛋白酶-2后細胞對藥物的攝取量增加，而加入金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑后阻礙PEG的脫除降低了細胞的攝取。

實施例9：細胞內(nèi)遞送過程

細胞攝取過程

將MCF7R細胞以8000細胞/皿的密度接種于玻底皿中，培養(yǎng)24小時。加入含有10μg/mL DOX的DOX、DOX.HCl和DNs培養(yǎng)基溶液與細胞孵育2小時。去除藥物后將細胞用PBS洗兩次，然后加入3％的甲醛溶液室溫固定5min。除去甲醛溶液后將細胞用PBS洗兩次，加入DiD染液對細胞膜進行染色。染色30min后用PBS將細胞洗三次，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

如圖16所示，DNs能夠有效促進DOX的入胞。而在相同濃度和時間下，DOX.HCl和DOX組細胞內(nèi)的熒光均較弱。

溶酶體逃逸

將MCF7R細胞以8000細胞/皿的密度接種于玻底皿中，培養(yǎng)24小時。加入含有10μg/mL DOX的DNs培養(yǎng)基溶液分別與細胞孵育6h和8h小時。去除藥物后將細胞用PBS洗兩次，然后加入溶酶體染色液(Lysotracker)，染色50min。將細胞用PBS洗三次后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

如圖16所示，在6h時能夠觀察到DOX和溶酶體的熒光幾乎完全重疊，說明組裝體在溶酶體中富集。在8h時，DOX的熒光和溶酶體的熒光大部分分離，說明DOX在肽類樹狀分子的質(zhì)子海綿效應(yīng)的作用下實現(xiàn)溶酶體逃逸。

對核釋放

將MCF7R細胞以8000細胞/皿的密度接種于玻底皿中，培養(yǎng)24小時。加入含有5μg/mL DOX的DNs培養(yǎng)基溶液分別與細胞孵育48h小時。去除藥物后將細胞用PBS洗兩次，然后加入細胞核染色液(Hoechst 33342)，染色20min。將細胞用PBS洗三次后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

如圖16所示，DOX能夠與細胞核的熒光大部分重疊，說明DOX能夠有效進入細胞核發(fā)揮抗腫瘤作用。

實施例10：體外滲透效果評價

利用腫瘤多細胞球模型考察藥物的腫瘤滲透能力。將1％的瓊脂糖凝膠經(jīng)高壓滅菌后以1.5mL/孔加入6孔細胞培養(yǎng)板中，然后將MCF7R細胞以2×10⁴個/孔接種。培養(yǎng)一周后腫瘤多細胞球直徑約為200μm，將細胞球轉(zhuǎn)移至玻底皿中加入DOX、DOX.HCl和DNs(DOX濃度為5μg/mL)孵育兩個小時，用PBS洗兩次后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察。

如圖17所示，DNs能夠?qū)OX遞送至腫瘤細胞球內(nèi)部，且熒光強度較強。金屬基質(zhì)蛋白酶-2作用后DNs的滲透能力進一步增強，然而在加入金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑菲啰啉后DNs的滲透能力降低。

實施例11：體內(nèi)抗腫瘤研究

動物飼養(yǎng)：所有的動物在25℃、55％濕度的條件下飼養(yǎng)。所有的動物實驗操作符合四川大學(xué)有關(guān)動物飼養(yǎng)規(guī)范管理條例的規(guī)定。

MCF7R腫瘤模型的建立：將MCF7R細胞以2×10⁶細胞/只的數(shù)量接種于BALB/c裸鼠的右后腿上部，當(dāng)腫瘤長至50mm³時將小鼠隨機分為3組，每組6只，分別通過尾靜脈注射生理鹽水，DOX.HCl和DNs，給藥量為5mg DOX/kg，每三天給藥一次，共給4次，并測量腫瘤體積。給藥結(jié)束后再測量5次至24天。

如圖18所示，DNs能夠有效抑制腫瘤的生長，24天時DNs的腫瘤抑制率達到了69.02％，而DOX.HCl的僅為32.45％。

實施例12：體內(nèi)藥物分布

將MCF7R細胞以2×10⁶細胞/只的數(shù)量接種于BALB/c裸鼠的右側(cè)腋下，當(dāng)腫瘤長至100mm³時，通過尾靜脈注射生理鹽水，DOX.HCl和DNs，給藥量為10mg DOX/kg。使用CRi Maestro EX活體成像儀，觀察注射后1h，3h，6h和12h的DOX分布，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為455nm和605nm。如圖19所示，注射后1h DNs組的DOX熒光主要分布在腫瘤部位，而且隨時間延長而增強。而DOX.HCl組難以觀察到藥物的分布。

實施例13：藥物代謝動力學(xué)研究

將BALB/c小鼠隨機分為兩組每組18只，通過尾靜脈注射DOX.HCl和DNs，藥物濃度為10mg DOX/kg。在給藥后2min,30min,1h,6h和12h，通過小鼠眼球取血將血液樣品收集于含肝素鈉的采血管中。將上述樣品在4℃條件下3000g離心10min。取出100μL血漿加入50μL的5M鹽酸，50℃孵育1.5h。樣品冷卻后加入50μL氫氧化鈉溶液(1M)。用氯仿/異丙醇(體積比為4:1)將藥物萃取至有機相。有機溶劑揮發(fā)干后加入100μL乙腈，用高效液相色譜分析藥物濃度。如圖20所示，DNs能夠明顯增加藥物的血液循環(huán)時間。

實施例14：體內(nèi)滲透效果

將建有MCF7R腫瘤的小鼠靜脈注射DOX.HCl和DNs，藥物濃度為10mg DOX/kg。注射12h后將小鼠斷頸處死，取出腫瘤。將腫瘤組織冰凍切片，用AF594-CD31抗體標(biāo)記腫瘤組織的血管。利用激光共聚焦顯微鏡觀察DOX在腫瘤組織的分布。如圖21所示，DOX.HCl僅分布于血管周圍，不能達到距離血管較遠的腫瘤深。而DNs能夠?qū)OX遞送至腫瘤深處，而且腫瘤組織的藥物濃度明顯增加。