本發(fā)明涉及血紅蛋白氧載體類的血液代用品技術(shù)領域，特別是涉及一種右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體及其制備方法與應用。

背景技術(shù)：

血紅蛋白氧載體(HBOCs)是通過化學手段對血紅蛋白進行包裹、修飾或交聯(lián)得到的一類物質(zhì)，目的在于通過包裹、修飾或交聯(lián)增大游離血紅蛋白的分子量，降低其腎毒性，并保留其攜-放氧的能力。但HBOCs研究中尚存在許多制約其發(fā)展及應用的科學問題亟待解決。首先，血紅蛋白經(jīng)過化學修飾或交聯(lián)后易發(fā)生解聚，使得血紅蛋白的四聚體易解聚變?yōu)槎垠w；其次，修飾或交聯(lián)還會改變血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)，使其攜-放氧能力顯著改變。因此，包裹、修飾或交聯(lián)選用的試劑及作用于血紅蛋白的位點對HBOCs的性能影響很大。

由于血紅蛋白側(cè)鏈上Cys-93(β)的巰基是血紅蛋白上非?；钴S的基團。因此，HBOCs多數(shù)是通過修飾血紅蛋白側(cè)鏈上半胱氨酸的巰基，使其與大分子修飾劑相連。已有研究證明當血紅蛋白上的巰基被修飾，會使得那些原本維持T構(gòu)象到R構(gòu)象轉(zhuǎn)換的能量被轉(zhuǎn)化成為提高氧親和力的能量，導致其氧親和力上升，難以向組織釋放氧氣，使得組織不能獲得足夠的氧，加劇了組織的缺氧損傷。如何更好地穩(wěn)定血紅蛋白四聚體、改善其攜-放氧能力是HBOCs研究中需要解決的關(guān)鍵問題。

右旋糖酐交聯(lián)是制備HBOCs的一種技術(shù)手段，常用高碘酸鈉氧化法。高碘酸鈉氧化法是將高碘酸鈉作為氧化劑，將右旋糖酐上的羥基氧化成醛基，之后與血紅蛋白分子的氨基進行交聯(lián)反應。然而，氧化右旋糖酐后反應液中的高碘酸鈉不可能完全除盡。由于高碘酸鈉是一種強氧化劑，殘留的高碘酸鈉以及被氧化的含有多個醛基的右旋糖酐會氧化血紅蛋白側(cè)鏈上的巰基，使得血紅素微環(huán)境發(fā)生改變，造成右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白(Dex-Hb)氧親和力過高，攜-放氧能力降低，無法很好地發(fā)揮供氧作用，因此不能作為血液代用品使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，第一方面，提供一種既能穩(wěn)定血紅蛋白四聚體，又能改善攜-放氧能力的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體，由右旋糖酐與血紅蛋白交聯(lián)得到，所述氧載體中每個血紅蛋白四聚體上包含兩個巰基。

第二方面，本發(fā)明提供一種制備上述右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體的方法，將血紅蛋白上的巰基保護起來后與活化右旋糖酐混合，發(fā)生交聯(lián)反應；交聯(lián)完成后再進行巰基脫保護，得到右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體。

包括以下步驟：

1)用高碘酸鈉將右旋糖酐40上的羥基氧化成醛基，得到活化右旋糖酐；

2)用4,4’-二硫二吡啶將血紅蛋白上的巰基保護起來，得到巰基封閉后的血紅蛋白；

3)將步驟1)的活化右旋糖酐與步驟2)的巰基封閉后的血紅蛋白混合，進行交聯(lián)反應，得到巰基封閉的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體；

4)將步驟3)的巰基封閉的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體進行巰基脫保護，得到右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體，所述氧載體中每個血紅蛋白四聚體上包含兩個巰基。

步驟2)具體為：

稱取4,4’-二硫二吡啶后用無水乙醇溶解，向其中加入血紅蛋白和4倍無水乙醇體積的緩沖液B，混合均勻后于室溫條件下反應，得到巰基封閉后的血紅蛋白；血紅蛋白與4,4’-二硫二吡啶的摩爾比為1:(4-8)(優(yōu)選1：(4-6)，最優(yōu)選1:4)。

步驟2)的反應時間為3小時；優(yōu)選的，所述緩沖液B為20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。

步驟1)具體為：

分別稱取右旋糖酐40與高碘酸鈉溶解于緩沖液A中，使得右旋糖酐40的終濃度為2.5mg/ml，高碘酸鈉的終濃度為10mM，得到反應體系，室溫避光反應90分鐘，將右旋糖酐40上的羥基氧化成醛基；反應結(jié)束后加入乙二醇靜置1-3h，終止高碘酸鈉氧化反應，投料比為1mg高碘酸鈉加入3-6μl乙二醇；反應終止后分別用NaCl溶液和緩沖液B于室溫下透析，除去殘留的高碘酸鈉及乙二醇(使用10kDa的透析袋)，得到活化右旋糖酐；優(yōu)選的，所述緩沖液A為20mM乙酸鈉的醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH5.8)。

步驟3)具體為：

將步驟2)得到的巰基封閉后的血紅蛋白、步驟1)得到的活化右旋糖酐與氰基硼氫化鈉粉末按質(zhì)量比1:(0.05-5):(0.25-2.5)混合均勻(優(yōu)選1:(1-2):(0.5-1)，最優(yōu)選1:1:0.5)，避光反應過夜將血紅蛋白和右旋糖酐交聯(lián)起來；反應完全后用緩沖液B進行超濾，得到巰基封閉的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體。

步驟4)具體為：

稱取三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽,用純水溶解后作為脫保護劑，三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽為血紅蛋白摩爾數(shù)的4倍，對步驟3)得到的巰基封閉的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體超濾，對封閉的巰基進行脫保護；反應完全后繼續(xù)用緩沖液B超濾，得到右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體。

第三方面，本發(fā)明提供一種右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體，是由上述方法制備得到。

第四方面，本發(fā)明提供上述右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體在血液代用品中的應用，將所述氧載體應用在輸血過程(創(chuàng)傷、失血、貧血、手術(shù)等引起的)中，部分或全部替代紅細胞發(fā)揮攜/放氧功能，其氧飽和度為50％時的氧分壓P₅₀在9.00mmHg以上。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明對右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白的方法進行改進，在制備右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體(Dex-Hb)的過程中可逆保護血紅蛋白Cys-93(β)巰基，使其不被氧化。結(jié)果證實：本發(fā)明的方法得到的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體(Dex-Hb)的P₅₀能夠有效提高，其攜-放氧能力也得到改善。由于右旋糖酐氧化產(chǎn)生的多個醛基基團能同時與血紅蛋白的四個亞基上的氨基反應，實現(xiàn)血紅蛋白四聚體的分子內(nèi)交聯(lián)，從而顯著增加HBOCs的四聚體穩(wěn)定性，進而提高HBOCs的生理功能。

附圖說明

圖1(A)幅表示實施例3凝膠過濾色譜圖，(B)幅表示SDS-PAGE的實驗結(jié)果；

圖2所示為實施例3的氧解離曲線圖；

圖3(A)幅表示實施例3的高鐵血紅蛋白含量圖，(B)幅表示凝膠過濾色譜圖；

圖4所示為實施例3、實施例4、比較例1和比較例2的反應程度圖。

具體實施方式

緩沖液的配制：

①醋酸鈉-醋酸緩沖液(NaAC-HAC，pH5.8，20mM，以下簡稱“緩沖液A”)

稱取無水乙酸鈉1.64g，溶于900ml純水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH到5.8，用純水定容至1L，即得。

②磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4，20mM，以下簡稱“緩沖液B”)

稱取4.8g無水磷酸二氫鈉(119.98)和14.8g十二水磷酸氫二鈉(358.14)，溶于4L純水中溶解，即得。

制備本發(fā)明右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體的方法，包括以下步驟：

1)分別稱取右旋糖酐40與高碘酸鈉(避光條件下稱取)溶解于緩沖液A中，得到反應體系，使得右旋糖酐40的終濃度為2.5mg/ml，高碘酸鈉的終濃度為10mM，反應體系室溫避光反應90min，高碘酸鈉將右旋糖酐40上的羥基氧化成醛基。向氧化后的反應體系中加入乙二醇，靜置1-3h，終止高碘酸鈉氧化反應，投料比為1mg高碘酸鈉加入3-6μl乙二醇。將終止氧化的反應體系用0.15M的NaCl溶液室溫透析兩次，每次1h，再用緩沖液B室溫透析1次，時間為3h，除去殘留的高碘酸鈉及乙二醇(使用10kDa的透析袋)，得到活化右旋糖酐。

2)按摩爾比為4,4’-二硫二吡啶(4-PDS):牛血紅蛋白＝(4-8):1的投料比稱取4-PDS，用無水乙醇溶解4-PDS(無水乙醇的體積(mL)是4-PDS質(zhì)量(g)的20-30倍后，向其中加入緩沖液B(體積是無水乙醇的4倍))，再加入牛血紅蛋白混合均勻進行封閉巰基的反應，室溫反應2-5h，得到巰基封閉后的牛血紅蛋白。

3)將步驟2)得到的巰基封閉后的牛血紅蛋白、步驟1)得到的活化右旋糖酐與氰基硼氫化鈉粉末按質(zhì)量比1:(0.05-5):(0.25-2.5)混合(優(yōu)選1:(1-2):(0.5-1)，最優(yōu)選1:1:0.5)，于4℃避光反應過夜(8-12h)，得到含有巰基封閉的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體的反應液。將步驟3)的反應液用緩沖液B進行超濾，設定流速為4.0ml/min，超濾7-9h，得到巰基封閉的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體。

4)按摩爾比為牛血紅蛋白:三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP·HCl)＝1:4的投料比稱取TCEP·HCl，用純水溶解后，作為脫保護劑，對步驟3)得到的巰基封閉的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體繼續(xù)進行超濾，解除對巰基的封閉，反應40min。之后繼續(xù)用緩沖液B超濾7-8h，得到液體的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體。

5)收取樣品，-80℃保存。

以下結(jié)合具體實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明進行限制。

實施例：

用上述方法制備得到一系列右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體，只是制備過程的參數(shù)稍作調(diào)整，其余程序不變，制備過程的參數(shù)見表1。

表1本發(fā)明制備右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體的方法的參數(shù)

比較例1：以實施例3為例，將本發(fā)明制備本發(fā)明右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體的方法中步驟3)巰基封閉后的牛血紅蛋白、活化右旋糖酐與氰基硼氫化鈉粉末的質(zhì)量比改為1∶0.01∶0.5，其它步驟和參數(shù)不變，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示：實施例3和實施例4的交聯(lián)效果較好，殘余的血紅蛋白量較少，考慮節(jié)約原則，反應比為1∶1∶0.5時，更能節(jié)省交聯(lián)反應的原料；而比較例1中沒有反應的血紅蛋白較多，產(chǎn)物純度較差。

比較例2：以實施例3為例，將本發(fā)明制備本發(fā)明右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體的方法中步驟3)巰基封閉后的牛血紅蛋白、活化右旋糖酐與氰基硼氫化鈉粉末的質(zhì)量比改為1：0.5:0.1，其它步驟和參數(shù)不變，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示：沒有反應的血紅蛋白較多，產(chǎn)物純度較差。

實驗一：SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)及凝膠過濾色譜

按《分子克隆實驗指南》(第三版)下冊中第1713頁蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的方法對實施例1-8進行SDS-PAGE實驗。配制好12％分離膠和5％濃縮膠后，裝好電泳系統(tǒng)，加入電泳緩沖液；將本發(fā)明實施例1-8的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體樣品(血紅蛋白含量為35mg)與5倍體積的上樣緩沖液(loading buffer)(即5μl樣品+20μl 5×loading buffer)混合；放入沸水中加熱5min，離心，取20μl上清上樣；使用伯樂電泳儀，穩(wěn)壓120V 30min，使樣品進入分離膠，之后穩(wěn)壓90V跑電泳；染色、脫色、記錄實驗結(jié)果。

按Wang et al.Biochim Biophys Acta 2014,1844:1201-1207中的實驗方法對實施例1-8進行凝膠過濾色譜的實驗。

以實施例3為例，圖1中(A)幅表示凝膠過濾色譜的結(jié)果，(B)幅表示SDS-PAGE的結(jié)果。

從圖1中(B)幅的SDS-PAGE電泳結(jié)果可以看出，血紅蛋白(Hb)只在16kDa處顯示出一個條帶，沒有其他條帶出現(xiàn)。證明了Hb純度較高，符合制備要求。右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體(Dex-Hb)只在100kDa以上顯示出一個條帶，說明Dex-Hb的純度較高。而在97kDa以下，Dex-Hb沒有條帶出現(xiàn)，說明Dex-Hb的分子量大于97kDa，交聯(lián)反應顯著增加了血紅蛋白分子的分子量。

從圖1中(A)幅的凝膠過濾色譜圖可以看出，Hb出現(xiàn)了一個對稱的單峰，說明Hb的純度較高，沒有雜質(zhì)出現(xiàn)。從Dex-Hb的出峰時間和峰型能夠得到以下結(jié)論：(1)Dex-Hb只出現(xiàn)了一個對稱單峰，說明Dex-Hb純度較高，不含其他雜質(zhì)。(2)Dex-Hb的出峰時間早于Hb，說明Dex-Hb的分子量大于Hb，交聯(lián)反應已經(jīng)成功的增大血紅蛋白分子的分子量。

其它實施例也有類似效果，不再一一贅述。

實驗二：攜-放氧能力

將實施例1-8的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體(含血紅蛋白6mg)與4ml pH7.4的P₅₀緩沖液(P₅₀緩沖液：稱取7.89g氯化鈉，6.89g TES和0.373g氯化鉀，溶于超純水中，在37℃下調(diào)節(jié)pH＝7.4±0.02，滲透壓為295±10mOsm/kg，定容至1L，4℃保存?zhèn)溆?混勻，控制反應體系的溫度為37℃，用血氧分析儀測定反應體系的氧解離曲線(以實施例3為例，見圖2中的曲線b)及P₅₀(氧飽和度為50％時的氧分壓)。采用同樣的方法得到血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線(見圖2中的曲線a)及P₅₀)。

P₅₀是氧飽和度為50％時的氧分壓，是表征血紅蛋白攜-放氧能力的重要指標。圖2表示按本發(fā)明封閉巰基的方法交聯(lián)得到的產(chǎn)物b(即實施例3的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體)與未封閉巰基交聯(lián)得到的產(chǎn)物a的氧解離曲線及P₅₀變化情況。從圖2可以看出未封閉巰基的Dex-Hb(產(chǎn)物a)的P₅₀過低，為4.61mmHg，P₅₀過低不利于向組織提供氧氣。與未封閉巰基的Dex-Hb(產(chǎn)物a)相比，封閉巰基后制得的Dex-Hb(產(chǎn)物b)氧解離曲線右移，且P₅₀增大到9.86mmHg。與未封閉巰基的Dex-Hb相比，封閉巰基的Dex-Hb的P₅₀明顯提高，證明封閉巰基方法能有效改善Dex-Hb的攜-放氧能力。

其它實施例也有類似效果，不再一一贅述。

實驗三：血紅蛋白四聚體穩(wěn)定性

按照Benesch RE,Benesch R,Yung S.Equations for the spectrophotometric analysis of hemoglobin mixtures.Anal Biochem,1973,55(1)：245-248.中的方法對本發(fā)明的實施例1-8進行高鐵血紅蛋白檢測，具體為：配制PBS溶液，0.22μm濾膜過濾，備用；分別取實施例1-8得到的右旋糖酐交聯(lián)血紅蛋白氧載體(Dx40-Hb)和Hb作為樣品裝入15ml離心管中，定容到10ml,保證血紅蛋白終濃度為1.6mg/ml；向樣品中分別加入MgCl₂至終濃度為0.9M；分別取1ml樣品，測其在540nm、560nm、576nm、630nm、700nm的吸光度；將剩余樣品(未添加MgCl₂的樣品)放入水浴鍋中，37℃水浴，分別在1h、2h、3h、4h、6h、7h，取1ml溶液，測其在540nm、560nm、576nm、630nm、700nm的吸光度；用三波長法計算0h、1h、2h、3h、4h、6h、7h的高鐵血紅蛋白百分含量；作圖，以實施例3為例，結(jié)果見圖3(A)。

凝膠過濾色譜實驗過程(與實驗一方法相同)：分別取Hb樣品和Dex-Hb樣品(血紅蛋白含量均為300μg)于150μl PBS中，加入氯化鎂至終濃度0.9M，總體系300μl，37℃反應150min，過0.45μm濾器，取100μl上樣；設置檢測波長為280nm，上樣速度為0.5mg/ml，獲得凝膠過濾色譜圖，以實施例3為例，結(jié)果見圖3(B)。

圖3表示封閉巰基對血紅蛋白四聚體穩(wěn)定性的影響。MgCl₂能夠促進血紅蛋白由四聚體解聚變?yōu)槎垠w，從而易發(fā)生氧化，當血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白時，失去了結(jié)合氧的功能，即失去了生物學作用，所以在制備血紅蛋白氧載體時要求高鐵血紅蛋白含量越低越好。圖3(A)顯示在MgCl₂作用下，Hb出現(xiàn)明顯氧化，變化量將近100％(曲線a)，而對于Dex-Hb來說，其MetHb含量變化不大，變化量不到30％(曲線b)，證明Dex-Hb四聚體遠高于Hb；曲線c和d基本重合表明本發(fā)明方法在交聯(lián)過程中并未引起血紅蛋白氧化狀態(tài)的改變，因此得到Dex-Hb在沒有MgCl₂的情況下，與血紅蛋白的四聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性基本一致。

凝膠過濾色譜結(jié)果顯示圖3(B)在MgCl₂的作用下，Hb出峰時間滯后，并在洗脫體積20ml前后出現(xiàn)兩個峰(如圖中箭頭所示)，說明Hb出現(xiàn)明顯解聚；而Dex-Hb在MgCl₂作用下出峰時間基本不變，僅呈現(xiàn)單峰，說明其解聚并不明顯；該結(jié)果證實：封閉巰基Dex-Hb具有較高的四聚體穩(wěn)定性。

其它實施例也有類似效果，不再一一贅述。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出的是，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的內(nèi)容。