本發(fā)明屬于材料和生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種氟化石墨烯納米藥物載體及其制備方法和應用。

背景技術：

藥物載體不但能夠負載藥物并改變藥物進入體內(nèi)的方式和分布，而且能實現(xiàn)藥物的靶向輸送與可控釋放，受到越來越多研究者的關注。特別是隨著納米技術的發(fā)展，利用納米材料可以自由進入細胞并在病變組織中富集的特性，對其靶向修飾后與藥物聯(lián)合使用，既能減少藥物的使用劑量，又能提高其靶向性，從而降低藥物的毒副作用、提高治療效果（參見Wang B，Hu L，Siahaan T，Drug Delivery： Principles and Applications，Second Edition，Wiley Series in Drug Discovery and Development）。

碳材料由于具有低的細胞毒性、廣泛的原料來源以及多種存在形態(tài)，被廣泛應用于藥物載體領域（參見Feng T，Ai X Z，An G H，et al.，ACS Nano，2016，10，4410-4420；Steiger C，Uchiyama K，Takagi T，et al，Journal of Controlled Release，2016，239，128-136.），特別是最近在石墨烯領域發(fā)現(xiàn)的新型衍生物-氟化石墨烯（Fluorinated graphene），不但繼承了石墨烯比表面積大、光熱轉(zhuǎn)換性能高、細胞毒性小等優(yōu)點，更為重要的是氟化石墨烯還具有其他碳材料所不具有的顯著優(yōu)勢：（1）穩(wěn)定的順磁性：氟化石墨烯即使在液氮及2 K低溫下仍然具有穩(wěn)定的順磁性（參見Feng Q，Tang N，Liu F，et al.，ACS Nano，2013，7，6729-6734；Nair R R，Sepioni M，Lehtinen T，Keinonen J，et al.，Nature Physics，2012，8，199-202.），因此可作為磁共振成像的造影劑。（2）優(yōu)異穩(wěn)定的光熱性能：根據(jù)我們前期的實驗研究與文獻報道，氟化石墨烯比氧化石墨烯、石墨烯具有更高的光熱轉(zhuǎn)換性能（參見Romero-Aburto R，Narayanan T，Hasumura T，et al.，Advanced Materials，2013，25， 5632-5637.）；并且通過控制其結(jié)構(gòu)，在相同條件下與金納米顆粒具有可比擬的光熱治療效果；但與昂貴的金納米材料相比，碳材料價格更低廉、在激光照射下更穩(wěn)定，因此基于碳材料的光熱試劑有望大幅度降低腫瘤光熱治療的成本（參見Romero-Aburto R，Narayanan T，Hasumura T，et al.，Advanced Materials，2013，25，5632-5637.）。（3）氟元素在生物醫(yī)藥中的特殊作用：已有研究指出氟化石墨烯具有良好的生物相容性并能促進干細胞的增殖和分化；此外，C-F鍵強的極性能夠誘導產(chǎn)生生物響應，并且氟元素在生物方面的應用已經(jīng)擴展到實際應用的醫(yī)藥、臨床以及治療當中（參見Müller K， Faeh C， Diederich F，Science，2007，28，1881-1886；Wang Y，Lee W C，Manga K K，et al.，Advanced Materials，2012，24，4285-4290.）。因此，發(fā)展一種有效且簡單的方法來構(gòu)建基于氟化石墨烯的靶向給藥與光熱治療納米載藥材料，進一步提高碳材料光熱-化療聯(lián)合治療的效果，無論是對于科學研究還是實際應用都尤為迫切。

但是由于氟化石墨烯表面能低、疏水性強，而且C-F鍵的化學性質(zhì)穩(wěn)定、難以連接修飾其他官能團，目前尚無氟化石墨烯靶向修飾和生物改性的公開報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供一種氟化石墨烯納米藥物載體，該載體提供的藥物控釋方式和途徑，可顯著提高藥物的生物利用度，降低藥物的毒副作用，提高藥物的治療效果。

本發(fā)明還提供該納米藥物載體的制備方法。

本發(fā)明也提供了該納米藥物載體在制備抗癌藥物中的應用。

本發(fā)明為了實現(xiàn)上述目的所采用的技術方案為：

一種氟化石墨烯納米藥物載體，將氟化氧化石墨烯羧基化處理，連接腫瘤靶向分子，利用聚乙烯吡咯烷酮修飾改性后，制成氟化石墨烯納米藥物載體，通過吸附作用負載藥物。

上述納米藥物載體的制備方法，包括以下步驟：

（1）氟化氧化石墨烯的制備：將氟化石墨與氫氧化鈉混合，每100 mg氟化石墨中加入氫氧化鈉為100~600 mg，在氬氣保護下加熱反應，溫度為320~400℃，反應時間為1~3小時，加水溶解，洗滌干燥后得到活化氟化石墨，與濃硫酸混合后攪拌加熱反應，反應的溫度為60~90℃，反應時間為4~6小時，再加入濃硝酸反應6-10小時，冷卻后加水溶解，超聲，抽濾、洗滌、冷凍干燥后得到氟化氧化石墨烯。此時氟化氧化石墨烯中氟含量為1~60 at%，氧含量為5~50 at%。

（2）氟化氧化石墨烯的羧基化：氟化氧化石墨烯在氫氧化鈉和氯乙酸鈉的作用下，制成羧基化的氟化氧化石墨烯。

（3）氟化氧化石墨烯連接靶向分子：取步驟（2）制成的羧基化的氟化氧化石墨烯在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)作用下，與靶向分子溶液避光反應，得到連接靶向分子的氟化氧化石墨烯。

（4）氟化氧化石墨烯的PVP改性：取步驟（3）制成的連接靶向分子的氟化氧化石墨烯制成分散液，加入PVP，超聲，加熱反應得到氟化石墨烯納米藥物載體。

優(yōu)選地，上述制備方法中，步驟（2）中氟化氧化石墨與氫氧化鈉和氯乙酸鈉的質(zhì)量比：1 ：10~75：10~75。

優(yōu)選地，上述制備方法中，所述步驟（3）中羧基化的氟化氧化石墨烯與EDC、NHS和靶向分子的質(zhì)量比：1：0.8~1.5：0.6~1.2：0.5~1.5。

優(yōu)選地，上述制備方法中，所述步驟（4）中連接靶向分子的氟化氧化石墨烯與PVP的質(zhì)量比為4：1~8。

優(yōu)選地，上述制備方法中，所述步驟（4）中超聲的功率為200~500W，時間為30~90min，加熱反應的溫度為50℃，時間為12~20小時。

本發(fā)明制成的載體中，氟化氧化石墨烯為20~3000nm的單層或者多層，PVP相對分子量為10000~360000。

上述方法制備的納米藥物載體在制備抗癌藥物中的應用。

所述的藥物包括抗癌劑、抗生素、激素、激素拮抗劑、白細胞介素、干擾素、生長因子、腫瘤壞死因子、內(nèi)毒素、淋巴毒素、尿激酶、鏈激酶、組織纖溶酶原激活劑、蛋白酶抑制劑、烷基磷酸膽堿、放射性同位素標記成分、反義 DNA、小 RNA、抗體、光動力治療藥物、心血管系統(tǒng)藥物、胃腸道系統(tǒng)藥物、神經(jīng)系統(tǒng)藥物中一種或多種的混合物。

所述的抗癌劑包括紫杉醇、喜樹堿、酞菁、表柔比星、多西他賽、吉西他濱、順鉑、卡鉑、泰素、丙卡巴肼、環(huán)磷酰胺、放線菌素 D、柔紅霉素、依托泊苷、他莫昔芬、阿霉素、絲裂霉素、博來霉素、普卡霉素、反鉑、長春堿、甲氨蝶呤和蟾毒靈中一種或多種的混合物。

本發(fā)明的藥物載體可用于疾病的治療。應用本發(fā)明藥物載體的疾病包括胃癌、肺癌、乳癌、腎癌、睪丸癌、腦瘤、卵巢癌、肝癌、支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和宮頸癌。本發(fā)明的藥物載體中所包含的藥物活性成分的種類可根據(jù)所期望的應用而變化。也就是說，本發(fā)明的藥物載體可用于多種醫(yī)療應用中。

本發(fā)明還涉及包含所述藥物載體和至少一種可藥用載體的藥物組合物。對于負載于本發(fā)明藥物組合物中的藥物活性成分的種類和本發(fā)明藥物組合物所應用的疾病的種類沒有特別限制，例如，它們與本發(fā)明藥物載體中的那些相同。對于可用于所述藥物組合物中的載體的種類沒有特別限制。醫(yī)學應用中可用的一般載體和賦形劑均可用于本發(fā)明中，它們的具體實例包括但不限于，離子交換樹脂、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白、緩沖物質(zhì)、水、鹽和電解質(zhì)、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯比咯烷酮、基于纖維素的基質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸類、蠟和羊毛脂。本發(fā)明的藥物組合物還可包含選自，但不限于，潤滑劑、潤濕劑、乳化劑、助懸劑和防腐劑的至少一種添加劑。本發(fā)明的藥物載體或藥物組合物可制備成各種劑型，例如包括，但不限于，胃腸外施用的水溶性溶液、無菌注射制劑。

本發(fā)明的有益成果：

（1）以商業(yè)化的氟化石墨為原料來制備氟化石墨烯，解決了以石墨烯為原料制備過程中步驟復雜的問題，并且避免了劇毒氣體（如F₂、XeF₂等）的氟化過程；同時氟化石墨活化、氧化的步驟簡單方便，有望實現(xiàn)較大規(guī)模生產(chǎn)。

（2）利用氟化氧化石墨烯，解決了氟化石墨烯難以靶向修飾的技術問題，可以實現(xiàn)氟化石墨烯藥物載體的主動靶向。與抗腫瘤藥物相結(jié)合，可以通過與血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞表面的特異性受體結(jié)合而實現(xiàn)主動靶向，同時可降低抗腫瘤藥物的毒副作用。

（3）利用PVP吸附到氟化石墨烯上完成生物相容性改性，不涉及化學反應，操作簡便，且制備的載體毒性小，具有很好的生物學安全性。

（4）可以實現(xiàn)藥物的無損裝載和可控釋放。抗癌藥物通過π-π鍵結(jié)合到氟化石墨烯上，避免了共價鍵對藥物分子的損傷，而且這種吸附方式負載的藥物可以緩慢釋放，有利于長時間保持藥效。

附圖說明

圖1為氟化石墨烯（FG）和氟化氧化石墨烯（FGO）的紅外譜圖；

圖2為葉酸修飾的氟化氧化石墨烯（FGO-FA）和PVP修飾后的氟化石墨烯（FGO-FA-PVP）的紅外譜圖；

圖3為葉酸（FA）、阿霉素（DOX）、FGO-FA、PVP修飾后氟化石墨烯(FGO-FA-PVP)及其載藥（FGO-FA-PVP-DOX）后的紫外吸收譜圖；

圖4中1、2、3、4依次為FG、FGO、FGO-FA和FGO-FA-PVP在PBS中的分散性圖片；

圖5為不同F(xiàn)GO-FA-PVP濃度時Hela細胞的存活率；

圖6為不同濃度DOX、FGO-FA-PVP-DOX、FGO-FA-PVP-DOX+808 nm laser以及氧化石墨烯修飾載藥后 (GO-FA-PVP-DOX+808 nm laser)近紅外照射下Hela細胞的存活率。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術方案進行進一步的闡述。

實施例1

（1）將100mg氟化石墨和100mg氫氧化鈉的混合物，在氬氣保護下加熱到320℃反應2小時后，加水溶解，洗滌干燥后得到活化的氟化石墨。取100 mg活化氟化石墨加入98wt%濃硫酸15mL，混合后攪拌加熱到80℃，反應4小時，然后再加入65wt%濃硝酸20mL，反應8小時，冷卻后加水溶解、超聲，抽濾、洗滌、冷凍干燥后得到氟化氧化石墨烯。制成的氟化氧化石墨烯中氟含量為23.4 at%，氧含量為17.6 at%。

（2）將步驟（1）得到的氟化氧化石墨烯分散到水中制得2mg/mL的分散液，取10mL分散液，向其中加入1.0g的氫氧化鈉和1.0g的氯乙酸鈉，在300W功率下超聲3小時，抽濾洗滌后透析，去除其他雜質(zhì)離子得到羧基化的氟化石墨烯。

（3）葉酸修飾氟化氧化石墨烯得到FGO-FA

稱取0.5g葉酸溶于100mL的去離子水中，量取20mL葉酸溶液，用飽和的碳酸氫鈉溶液調(diào)pH=8.0。稱取0.1g步驟（2）中得到的羧基化氟化石墨烯溶于100mL去離子水里，超聲分散，依次緩慢加入100mgEDC，80mg NHS，300W功率下超聲2小時，緩慢加入上述葉酸溶液后，避光攪拌24小時，抽濾，干燥，制得FGO-FA。如圖2紅外譜圖和圖3紫外吸收譜圖所示，靶向分子葉酸成功修飾到了氟化石墨烯載體之上。

（4）PVP生物改性FGO-FA得到氟化石墨烯納米藥物載體（FGO-FA-PVP）

聚乙烯吡咯烷酮相對分子量為260000，將10mg PVP加入到10mL 1mg/mL步驟（3）中得到的FGO-FA分散液中，在300W超聲下處理30分鐘，然后在50 ℃下攪拌15小時，得到FGO-FA-PVP。如圖2紅外譜圖和圖3紫外吸收譜圖所示，PVP成功修飾到氟化石墨烯上，而且制備的載體在PBS中具有良好的分散穩(wěn)定性，見附圖4。實施例2

（1）將100mg氟化石墨和600mg氫氧化鈉的混合物，在氬氣保護下加熱到400℃反應3小時后，加水溶解，洗滌干燥后得到活化的氟化石墨。取100 mg活化氟化石墨加入98wt%濃硫酸40ml，混合后攪拌加熱到90℃，反應6小時，然后再加入68wt%濃硝酸30ml反應10小時，冷卻后加水溶解、超聲，抽濾、洗滌、冷凍干燥后得到氟化氧化石墨烯。制成的氟化氧化石墨烯中氟含量為7.5 at%，氧含量為37.1 at%。

（2）將步驟（1）得到的氟化氧化石墨烯分散到水中制得1mg/mL的分散液，取10mL分散液，向其中加入0.1g的氫氧化鈉和0.1g的氯乙酸鈉，在300W功率下超聲3小時，抽濾洗滌后透析，去除其他雜質(zhì)離子得到羧基化的氟化石墨烯。

（3）葉酸修飾氟化氧化石墨烯得到FGO-FA

稱取0.75g葉酸溶于100mL的去離子水中，量取20mL葉酸溶液，用飽和的碳酸氫鈉溶液調(diào)pH=8.0。稱取0.1g步驟（2）中得到的羧基化氟化石墨烯溶于100mL去離子水里，超聲分散，依次緩慢加入150mgEDC，120mg NHS，300W功率下超聲2小時，緩慢加入上述葉酸溶液后，避光攪拌24h，抽濾，洗滌，干燥，制得FGO-FA。

（4）PVP生物改性FGO-FA得到氟化石墨烯納米藥物載體（FGO-FA-PVP）

PVP的相對分子量為360000，將20mg PVP加入到10mL 1mg/mL步驟（3）中得到的FGO-FA分散液中，在500W超聲下處理50分鐘，然后在50 ℃下攪拌20小時，得到FGO-FA-PVP。

實施例3

（1）將100mg氟化石墨和200mg氫氧化鈉的混合物，在氬氣保護下加熱到350℃反應2小時后，加水溶解，洗滌干燥后得到活化的氟化石墨。取100 mg活化氟化石墨加入98wt%濃硫酸20ml混合后攪拌加熱到80℃，反應5小時，然后再加入68wt%濃硝酸20ml反應7小時，冷卻后加水溶解、超聲，抽濾、洗滌、干燥后得到氟化氧化石墨烯。制成的氟化氧化石墨烯中氟含量為15.2 at%，氧含量為19.3 at%。

（2）將步驟（1）得到的氟化氧化石墨烯分散到水中制得5mg/mL的分散液，取4mL分散液，向其中加入1.5g的氫氧化鈉和1.5g的氯乙酸鈉，在300W功率下超聲3h，抽濾洗滌后透析，去除其他雜質(zhì)離子得到羧基化的氟化石墨烯。

（3）葉酸修飾氟化氧化石墨烯得到FGO-FA

稱取0.25g葉酸溶于100mL的去離子水中，量取20mL葉酸溶液，用飽和的碳酸氫鈉溶液調(diào)pH=8.0。稱取0.1g步驟（2）中得到的羧基化氟化石墨烯溶于100mL去離子水里，超聲分散，依次緩慢加入80mg EDC，60mg NHS，300W功率下超聲2h，緩慢加入上述葉酸溶液后，避光攪拌24h，抽濾，干燥，制得FGO-FA。

（4）PVP生物改性FGO-FA烯得到氟化石墨烯納米藥物載體（FGO-FA-PVP）

將10mg PVP加入到40mL 1mg/mL步驟（3）中得到的FGO-FA分散液中，在200W超聲下處理90分鐘，然后在50 ℃下攪拌12小時，得到FGO-FA-PVP。PVP的相對分子量為100000。

實施例4

（1）將100mg氟化石墨和100mg氫氧化鈉的混合物，在氬氣保護下加熱到380℃反應1小時后，加水溶解，洗滌干燥后得到活化的氟化石墨。取100 mg活化氟化石墨加入98wt%濃硫酸15ml，混合后攪拌加熱到60℃，反應4小時，然后再加入65wt%濃硝酸10ml，反應6小時，冷卻后加水溶解、超聲，抽濾、洗滌、干燥后得到氟化氧化石墨烯。制成的氟化氧化石墨烯中氟含量為25.1 at%，氧含量為12.2 at%。

（2）將步驟（1）得到的氟化氧化石墨烯分散到水中制得2mg/mL的分散液，取10mL分散液，向其中加入0.4g的氫氧化鈉和0.4g的氯乙酸鈉，在300W功率下超聲3h，抽濾洗滌后透析，去除其他雜質(zhì)離子得到羧基化的氟化石墨烯。

（3）葉酸修飾氟化氧化石墨烯得到FGO-FA

稱取0.5g葉酸溶于100mL的去離子水中，量取20mL葉酸溶液，用飽和的碳酸氫鈉溶液調(diào)pH=8.0。稱取0.1g步驟（2）中得到的羧基化氟化石墨烯溶于100mL去離子水里，超聲分散，依次緩慢加入120mg EDC，100mg NHS，300W功率下超聲2h，緩慢加入上述葉酸溶液后，避光攪拌24小時，抽濾，洗滌，干燥，制得FGO-FA。

（4）PVP生物改性FGO-FA得到氟化石墨烯納米藥物載體（FGO-FA-PVP）

將10mg PVP加入到20mL 1mg/mL步驟（3）中得到的FGO-FA分散液中，在300W超聲下處理30分鐘，然后在50 ℃下攪拌15小時，得到FGO-FA-PVP。

對比例1

（1）氧化石墨烯分散到水中制得2mg/mL的分散液，取10mL分散液，向其中加入0.4g的氫氧化鈉和0.4g的氯乙酸鈉，在300W功率下超聲3h，抽濾洗滌后透析，去除其他雜質(zhì)離子得到羧基化的氧化石墨烯。

（2）葉酸修飾氧化石墨烯（GO-FA）的制備

稱取0.5g葉酸溶于100mL的去離子水中，量取20mL葉酸溶液，用飽和的碳酸氫鈉溶液調(diào)pH=8.0。稱取0.1g步驟（2）中得到的羧基化氧化石墨烯溶于100mL去離子水里，超聲分散，依次緩慢加入100mg EDC，80mg NHS，300W功率下超聲2小時，緩慢加入上述葉酸溶液后，避光攪拌24h，抽濾，干燥，制得GO-FA。

（3）PVP生物改性的氧化石墨烯（GO-FA-PVP）的制備

將10mg PVP加入到20mL 1mg/mL步驟（2）中得到的GO-FA分散液中，在300W超聲下處理30分鐘，然后在50 ℃下攪拌15小時，得到GO-FA-PVP。

1.毒理實驗：

圖5為不同F(xiàn)GO-FA-PVP濃度時Hela細胞的存活率。實驗表明，即使在高的濃度下，F(xiàn)GO-FA-PVP對細胞基本上也沒有顯著毒性。

2.FGO-FA-PVP-DOX+808nm laser與GO-FA-PVP-DOX+808nm laser的制備以及細胞毒性

將實施例1及對比例中得到的載體與不同比例的DOX混合，完成藥物負載得到FGO-FA-PVP-DOX及GO-FA-PVP-DOX，然后用超濾去掉未結(jié)合的DOX，沉淀用PBS重新溶解均勻，放于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將Hela細胞分別接種于96孔板中，24小時后將FGO-FA-PVP-DOX與GO-FA-PVP-DOX分別加入并形成濃度梯度，加入培養(yǎng)基后進行培養(yǎng)。

相同條件下，分別以純DOX和負載相同濃度DOX的FGO-FA-PVP-DOX，與FGO-FA-PVP-DOX+808nm，GO-FA-PVP-DOX+808nm laser做平行對照，24小時后進行細胞存活率檢測。結(jié)果如圖6所示，可以看出，可以看出藥物負載到FGO-FA-PVP具有很好的緩釋效果；總體上FGO-FA-PVP 比單純 DOX 殺滅癌細胞的效果都好。在808nm近紅外光照射下，功率密度為1. 3 W/cm² ，F(xiàn)GO-FA-PVP-DOX比GO-FA-PVP-DOX表現(xiàn)出更好的腫瘤細胞殺滅效果。因此氟化石墨烯納米藥物載體的光熱效果好于氧化石墨烯藥物載體。