本發(fā)明屬于化學、藥學、醫(yī)學等多學科交叉領域，更具體地，涉及一種RES blockade策略聯(lián)合羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒載藥系統(tǒng)及其應用。

背景技術(shù)：

化療是目前治療癌癥最有效的手段之一。化療藥物會隨著血液循環(huán)遍布全身的絕大部分器官和組織。作為一種全身治療手段，化療是目前針對一些有全身擴撒傾向的腫瘤及已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的中晚期腫瘤最主要的治療手段。但目前化療藥物存在著極大的缺陷：化療藥物的非特異靶向性導致化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也將正常細胞一同殺傷，治療過程經(jīng)常會對機體正常組織造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，降低人體的免疫能力，是一種“玉石俱焚”的治療方法。因此，納米藥物載體就成為了提高抗腫瘤藥物療效，降低藥物毒副作用的關(guān)鍵。

近幾十年,納米科學家對納米載體材料做了各種篩選及修飾,其中包括對新材料、新靶向分子的創(chuàng)新,對納米粒大小、電荷及表面物理化學性質(zhì)的改造等等。盡管以上種種嘗試與努力，納米載藥系統(tǒng)的抗腫瘤效率遠遠沒有達到預期效果。根本原因在于分布在肝、腎、脾、肺、淋巴結(jié)等組織的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)對載藥納米粒的非特異性攝取，最終導致富集于腫瘤部位的藥物濃度低。

目前，已經(jīng)有一系列的有機或無機材料被用來阻塞RES巨噬細胞，其中包括二氧化硅、碳、乳膠微球、氯化釓、葡聚糖硫酸酯、脂質(zhì)體等等?？上驳氖牵瑧眠@些材料來阻塞RES巨噬細胞在一定程度上均起到了效果，但是其中一些材料因為大的給藥劑量給機體帶來了極大的損傷，限制了其臨床的使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種RES巨噬細胞阻塞材料、腫瘤多步療法系列藥物及其應用，其目的在于通過合成不同接枝率的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒分別用作RES系統(tǒng)臨時阻塞RES blockade材料及藥物載體材料，利用RES blockade策略聯(lián)合羥乙基淀粉-聚乳酸載藥納米粒載藥系統(tǒng)應用于腫瘤治療，由此解決現(xiàn)有技術(shù)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)對載藥納米粒的非特異性攝取，最終導致富集于腫瘤部位的藥物濃度低、腫瘤治療效果差以及現(xiàn)有的RES巨噬細胞阻塞材料由于劑量過大而引起的機體損傷的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細胞阻塞材料，其特征在于，所述阻塞材料包括羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物，所述羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物具有如下的通式：

其中，m在70至300之間，n在300至3000之間，所述聚乳酸在羥乙基淀粉上接枝率為1～2。

優(yōu)選地，所述m為390，n為70，所述接枝率為1.62。

優(yōu)選地，所述羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的平均粒徑為500～1000nm，優(yōu)選為700nm。

按照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種腫瘤多步療法系列藥物，包括藥物A和藥物B，所述藥物A包括如權(quán)利要求1～3任意一項所述的阻塞材料，所述藥物B為抗腫瘤藥物。

優(yōu)選地，所述藥物B為羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的納米載藥系統(tǒng)，所述納米載藥系統(tǒng)的納米粒的尺寸為100～200nm。

優(yōu)選地，所述納米載藥系統(tǒng)的納米粒的尺寸為140nm。

優(yōu)選地，所述納米載藥系統(tǒng)的載藥為阿霉素。

按照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種所述的系列藥物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述系列藥物的藥物A的劑量為200～600mg/kg，所述藥物B的劑量為4～6mg/kg。

優(yōu)選地，所述系列藥物被制備用于：

(1)向腫瘤患者施用200～600mg/kg劑量的藥物A；

(2)等待0.5～4h的時間段向該患者施用4～6mg/kg劑量的藥物B；

優(yōu)選地，所述藥物A的劑量為400mg/kg。

優(yōu)選地，所述藥物B的劑量為4mg/kg。

優(yōu)選地，所述時間段為1.5小時。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果。

(1)本發(fā)明利用合成的不同接枝率的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒分別用作RES系統(tǒng)臨時阻塞RES blockade材料及藥物載體材料，顯著性的提高了抗腫瘤藥物在腫瘤部位的聚集，從而提高了腫瘤的治療效率。

(2)RES blockade策略聯(lián)合包載抗腫瘤藥物阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥方式顯著減少了阿霉素的心臟毒性以及肝毒性。

(3)本發(fā)明提供的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)巨噬細胞阻塞材料，具有良好的生物相容性及生物可降解性，同時也沒有免疫原性，是一種極其安全的可用于注射的材料，使用時400mg/kg的劑量，對機體損傷很小。

(4)本發(fā)明利用RES blockade策略聯(lián)合羥乙基淀粉-聚乳酸載藥納米粒載藥系統(tǒng)應用于腫瘤治療，顯著提高了腫瘤的療效，并且大大降低了藥物的毒副作用，為腫瘤的治療提供了一種新的治療手段。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的兩親性嵌段聚合物羥乙基淀粉-聚乳酸的制備方法(HES-g-PLA)的合成路線圖；

圖2為本發(fā)明制備的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物、羥乙基淀粉和聚乳酸的紅外光譜圖(FT-IR)；

圖3為本發(fā)明制備的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物、羥乙基淀粉和聚乳酸的紅外光譜圖核磁共振譜圖(¹H-NMR)；

圖4是本發(fā)明考察的注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒與注射載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的最佳時間間隔的小動物成像圖；

圖5為本發(fā)明考察的RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的組織分布圖；

圖6為本發(fā)明考察的RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的腫瘤生長曲線圖及腫瘤重量圖；

圖7為本發(fā)明考察的RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的生化指標(CK、ALB、TP)圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明針對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)RES對腫瘤治療藥物載藥納米粒的非特異性攝取，導致能夠富集于腫瘤部位的藥物濃度低，腫瘤治療效率低，而現(xiàn)有的RES巨噬細胞阻塞材料使用時由于劑量過大導致機體損傷的問題，提供了一種新型的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)巨噬細胞阻塞材料，其為羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物，具有以下的通式：

其中，m在70到300之間，n在300到3000之間，所述聚乳酸在羥乙基淀粉上接枝率為1～2，優(yōu)選為1.62，所述羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的尺寸500～1000nm，優(yōu)選為500～800nm，進一步優(yōu)選為700nm。

本發(fā)明利用RES blockade策略，即通過合成不同接枝率的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒先后分別用作RES系統(tǒng)臨時阻塞RES blockade材料及藥物載體材料，利用RES blockade策略聯(lián)合羥乙基淀粉-聚乳酸載藥納米粒載藥系統(tǒng)應用于制備治療腫瘤藥物的研究。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤多步療法系列藥物，優(yōu)選兩步療法，包括藥物A和藥物B，所述藥物A包括上述網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)巨噬細胞阻塞材料，所述藥物B為抗腫瘤藥物，優(yōu)選為羥乙基淀粉-聚乳酸的納米載藥系統(tǒng)，所述納米載藥系統(tǒng)接枝率為0.5～1，優(yōu)選為0.86，尺寸為100～200nm,優(yōu)選為140nm左右，所述載藥優(yōu)選為阿霉素。

所述的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細胞阻塞材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)溶解聚乳酸并活化其末端羧基：向端羧基的聚乳酸0.2～0.7g中加入催化劑N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，以無水二甲亞砜作為溶劑，所述聚乳酸質(zhì)量優(yōu)選為0.3～0.4g，50～70℃下反應25～45分鐘，使其完全溶解，得到端羧基活化的聚乳酸；所述聚乳酸、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶的投料摩爾比為1:4:2；

(2)溶解羥乙基淀粉：氮氣保護條件下，在50～70℃下將0.5g羥乙基淀粉充分溶解于無水二甲亞砜中，得到羥乙基淀粉的二甲亞砜溶液；

(3)酯化反應：將步驟(1)得到的端羧基活化的聚乳酸與步驟(2)得到的羥乙基淀粉的二甲亞砜溶液混合，發(fā)生酯化反應，在氮氣保護下，50～70℃下反應24～36h，得到所述兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物粗品；

(4)純化：將所述步驟(3)得到的兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物粗品使用去離子水進行透析，透析袋分子量為3500，共透析2～4天，以除去體系中的DMSO溶劑，透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所述的兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物(HES-g-PLA)。

(4)超聲分散：最后將所得的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物溶解于超純水中，聚合物的濃度為100mg/ml，超聲10min，得到用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的阻塞材料。

所述藥物B，即羥乙基淀粉-聚乳酸的納米載藥系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：

(1)溶解聚乳酸并活化其末端羧基：向端羧基的聚乳酸0.2～0.7g中加入催化劑N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，以無水二甲亞砜作為溶劑，50～70℃下反應25～45分鐘，使其完全溶解，得到端羧基活化的聚乳酸；所述聚乳酸、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶的投料摩爾比為1:4:2；

(2)溶解羥乙基淀粉：氮氣保護條件下，在50～70℃下將0.5g羥乙基淀粉充分溶解于無水二甲亞砜中，得到羥乙基淀粉的二甲亞砜溶液；

(3)酯化反應：將步驟(1)得到的端羧基活化的聚乳酸與步驟(2)得到的羥乙基淀粉的二甲亞砜溶液混合，發(fā)生酯化反應，在氮氣保護下，50～70℃下反應24～36h，得到所述兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物粗品；

(4)純化：將所述步驟(3)得到的兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物粗品使用去離子水進行透析，透析袋分子量為3500，共透析2～4天，以除去體系中的DMSO溶劑，透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所述的兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物(HES-g-PLA)。

(5)超聲乳化：將步驟(4)得到的兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物溶解于水中，在冰浴下超聲破碎，同時加入已脫去鹽酸的阿霉素的乙醇二氯甲烷溶液，得到超聲后的乳液；

(6)高壓均質(zhì)：將步驟(5)得到的乳液在高壓均質(zhì)機中，高壓勻質(zhì)壓力600～1000bar，勻質(zhì)2次以上，純化得到包載有阿霉素的兩親性羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸共聚物的納米載藥系統(tǒng)。

本發(fā)明所述羥乙基淀粉原料購買于武漢華科大生命科技有限公司，所購羥乙基淀粉的分子量為70～480kDa，優(yōu)選70kDa，羥乙基的取代度為0.5。本發(fā)明所述聚乳酸原料購買于濟南岱罡生物工程有限公司，聚乳酸的分子量為10～30kDa，優(yōu)選為10kDa。本發(fā)明所述阿霉素原料藥購買于北京華奉聯(lián)博科技有限公司，純度為99％。

所述的腫瘤兩步法系列藥物，用于制備治療腫瘤的藥物，被制備后用于：

(1)向腫瘤患者施用200～600mg/kg劑量的藥物A；

(2)等待0.5～4h的時間段向該患者施用4～6mg/kg劑量的藥物B。

所述藥物A的劑量優(yōu)選為400mg/kg，所述藥物B的劑量優(yōu)選為4mg/kg，時間段優(yōu)選為1.5小時。

藥物A為RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒，用于臨時阻塞網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細胞對納米載體的非特異性攝取，然后再施用載藥納米粒，能極大的減少納米載藥系統(tǒng)被RES系統(tǒng)攝取，因此藥物能通過EPR效應更多的富集于病灶處，提高了藥物的靶向性，減少系統(tǒng)毒性的同時進一步提高了治療效果。

以下為實施例：

實施例1

制備一種腫瘤兩步療法系列藥物，包括藥物A和藥物B，藥物A RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的制備步驟如下：

將0.323g端羧基的聚乳酸(PLA-COOH)、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，(其中PLA、DCC、DMAP三者投料摩爾比為1:4:2)置于100mL干燥的圓底燒瓶中。同時加入氮氣保護的15mL無水二甲亞砜(DMSO)溶劑，60℃攪拌30min使反應物完全溶解且活化其末端羧基。

與此同時，將0.5g羥乙基淀粉HES溶解于10mL的無水DMSO溶劑中，60℃反應時間為30min。將PLA、DCC、DMAP的DMSO溶液加入到充分溶解了的HES溶液中，并加入5ml的無水DMSO潤洗溶解PLA的燒瓶，之后將潤洗液加入反應液。60℃反應24小時。整個反應過程均在氮氣保護下完成。待反應結(jié)束后，將反應體系置于透析袋(MWCO-3500)中，使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去體系中的DMSO溶劑。透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸接枝聚合物(HES-b-PLA)的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所需的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物。

最后將所得的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物溶解于超純水中，聚合物的濃度為100mg/ml，超聲10min，得到用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的阻塞材料。該聚合物的接枝率為1.62，得到的納米粒平均粒徑為700nm。

制備藥物B，即載藥羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的納米載藥系統(tǒng)的納米粒，制備步驟如下：

將0.565g端羧基的聚乳酸(PLA-COOH)、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，(其中PLA、DCC、DMAP三者投料摩爾比為1:4:2)置于100mL干燥的圓底燒瓶中。同時加入氮氣保護的15mL無水二甲亞砜(DMSO)溶劑，60℃攪拌30min使反應物完全溶解且活化其末端羧基。

與此同時將0.5g羥乙基淀粉溶解于10mL的無水DMSO溶劑中,60℃反應時間為30min。將PLA、DCC、DMAP的DMSO溶液加入到充分溶解了的HES溶液中，并加入5ml的無水DMSO潤洗溶解PLA的燒瓶，之后將潤洗液加入反應液。60℃反應24小時。整個反應過程均在氮氣保護下完成。待反應結(jié)束后，將反應體系置于透析袋(MWCO-3500)中，使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去體系中的DMSO溶劑。透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸接枝聚合物(HES-b-PLA)的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所需的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物。

將得到的羥乙基淀粉-聚乳酸的嵌段聚合物溶解于水中，利用超聲破碎儀，在冰浴下，一邊超聲一邊加入已脫去鹽酸的阿霉素的乙醇二氯甲烷溶液(其中乙醇與二氯甲烷的體積比為1:1)，超聲時間一共5min。將超聲后的乳液加入高壓勻質(zhì)機中，在600bar的壓力下勻質(zhì)兩次，勻質(zhì)完成后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乳液中的有機溶劑，最終得到粉紅色澄清透明溶液。將所得溶液置于透析袋(MWCO-3500)中使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去沒有包載到聚合物納米粒中的阿霉素。最后將透析得到中的載藥聚合物納米粒的水溶液凍干備用。該步驟全程在避光的條件下進行。最后將得到的包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸的凍干粉，按照11.6mg/ml的濃度溶解于超純水中，超聲10min，得到載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒。該聚合物的接枝率為0.86，得到的納米粒粒徑為140nm。

圖1為本發(fā)明制備的兩親性嵌段聚合物羥乙基淀粉-聚乳酸(HES-g-PLA)的合成路線；圖2和圖3分別為本發(fā)明制備的兩親性嵌段聚合物羥乙基淀粉-聚乳酸(HES-g-PLA)的紅外光譜(FT-IR)及核磁共振譜(¹H-NMR)圖。采用紅外光譜(FT-IR)及核磁共振譜(¹H-NMR)確認本發(fā)明制備的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的化學結(jié)構(gòu)。傅里葉紅外光譜：本試驗采用德國Bruker Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀，通過溴化鉀壓片法得到檢測樣品，掃描波長范圍為4000-500cm^-1，得到了HES，PLA和HES-g-PLA嵌段聚合物的紅外譜圖。核磁波譜¹H-NMR：本實驗采用瑞士Bruker AV600核磁波譜儀，以氘代二甲基亞砜(d6-DMSO)為溶劑，測定了HES,PLA以及合成得到的HES-g-PLA嵌段聚合物的核磁譜圖。從HES的紅外譜圖中可以看到，3400cm^-1，2926cm^-1,1649cm^-1分別為OH的伸縮振動峰，C-H的震動吸收峰和分子內(nèi)氫鍵。對比純HES的FT-IR譜圖，HES-g-PLA在2997cm^-1，1753cm^-1和1191cm^-1處出現(xiàn)了三個新峰，它們分別是PLA-CH₃伸縮振動峰，PLA酯基中的C＝O振動峰，以及C-O-C的對稱振動峰。在3400～3500cm^-1處的羥基峰變小，表明只有部分HES的羥基偶聯(lián)了聚乳酸鏈段，同時1649cm^-1處的峰變小，代表著偶聯(lián)改性后分子內(nèi)的氫鍵作用力減弱。純PLA的羰基振動峰在1745cm^-1，而此峰在HES-g-PLA的譜圖中向高波數(shù)移動(從1745移動到1753cm^-1)，這也是表明PLA接枝到HES上。這些新出現(xiàn)的吸收峰證明聚乳酸成功的偶聯(lián)到羥乙基淀粉上。同時在所合成的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物(HES-g-PLA)的核磁共振氫譜上既存在羥乙基淀粉葡萄糖糖環(huán)上羥基質(zhì)子峰，即化學位移為4.5ppm到6ppm之間的多重峰，也能發(fā)現(xiàn)化學位移為在1-2ppm之間的聚乳酸的特征峰：甲基質(zhì)子峰。核磁譜圖結(jié)果進一步證實了HES-g-PLA的結(jié)果。

實施例2

制備一種腫瘤兩步療法系列藥物，包括藥物A和藥物B，藥物A RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的制備步驟如下：

將0.404g端羧基的聚乳酸(PLA-COOH)、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，(其中PLA、DCC、DMAP三者投料摩爾比為1:4:2)置于100mL干燥的圓底燒瓶中。同時加入氮氣保護的15mL無水二甲亞砜(DMSO)溶劑，60℃攪拌30min使反應物完全溶解且活化其末端羧基。

與此同時，將0.5g羥乙基淀分HES溶解于10mL的無水DMSO溶劑中，60℃反應時間為30min。將PLA、DCC、DMAP的DMSO溶液加入到充分溶解了的HES溶液中，并加入5ml的無水DMSO潤洗溶解PLA的燒瓶，之后將潤洗液加入反應液。60℃反應24小時。整個反應過程均在氮氣保護下完成。待反應結(jié)束后，將反應體系置于透析袋(MWCO-3500)中，使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去體系中的DMSO溶劑。透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸接枝聚合物(HES-b-PLA)的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所需的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物。

最后將所得的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物溶解于超純水中，聚合物的濃度為100mg/ml，超聲10min，得到用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的阻塞材料。得到的納米粒平均粒徑為620nm。

制備藥物B，即載藥羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的納米載藥系統(tǒng)的納米粒，制備步驟如下：

將0.565g端羧基的聚乳酸(PLA-COOH)、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，(其中PLA、DCC、DMAP三者投料摩爾比為1:4:2)置于100mL干燥的圓底燒瓶中。同時加入氮氣保護的15mL無水二甲亞砜(DMSO)溶劑，60℃攪拌30min使反應物完全溶解且活化其末端羧基。

與此同時將0.5g羥乙基淀粉溶解于10mL的無水DMSO溶劑中,60℃反應時間為30min。將PLA、DCC、DMAP的DMSO溶液加入到充分溶解了的HES溶液中，并加入5ml的無水DMSO潤洗溶解PLA的燒瓶，之后將潤洗液加入反應液。60℃反應24小時。整個反應過程均在氮氣保護下完成。待反應結(jié)束后，將反應體系置于透析袋(MWCO-3500)中，使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去體系中的DMSO溶劑。透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸接枝聚合物(HES-b-PLA)的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所需的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物。將得到的羥乙基淀粉-聚乳酸的嵌段聚合物溶解于水中，利用超聲破碎儀，在冰浴下，一邊超聲一邊加入已脫去鹽酸的阿霉素的乙醇二氯甲烷溶液(其中乙醇與二氯甲烷的體積比為1:1)，超聲時間一共5min。將超聲后的乳液加入高壓勻質(zhì)機中，在600bar的壓力下勻質(zhì)兩次，勻質(zhì)完成后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乳液中的有機溶劑，最終得到粉紅色澄清透明溶液。將所得溶液置于透析袋(MWCO-3500)中使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去沒有包載到聚合物納米粒中的阿霉素。最后將透析得到中的載藥聚合物納米粒的水溶液凍干備用。該步驟全程在避光的條件下進行。最后將得到的包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸的凍干粉，按照11.6mg/ml的濃度溶解于超純水中，超聲10min，得到載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒。該聚合物的接枝率為0.86，得到的納米粒粒徑為140nm。

實施例3

制備一種腫瘤兩步療法系列藥物，包括藥物A和藥物B，藥物A RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的制備步驟如下：

將0.485g端羧基的聚乳酸(PLA-COOH)、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，(其中PLA、DCC、DMAP三者投料摩爾比為1:4:2)置于100mL干燥的圓底燒瓶中。同時加入氮氣保護的15mL無水二甲亞砜(DMSO)溶劑，60℃攪拌30min使反應物完全溶解且活化其末端羧基。

與此同時，0.5g羥乙基淀粉HES溶解于10mL的無水DMSO溶劑中，60℃反應時間為30min。將PLA、DCC、DMAP的DMSO溶液加入到充分溶解了的HES溶液中，并加入5ml的無水DMSO潤洗溶解PLA的燒瓶，之后將潤洗液加入反應液。60℃反應24小時。整個反應過程均在氮氣保護下完成。待反應結(jié)束后，將反應體系置于透析袋(MWCO-3500)中，使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去體系中的DMSO溶劑。透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸接枝聚合物(HES-b-PLA)的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所需的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物。

最后將所得的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物溶解于超純水中，聚合物的濃度為100mg/ml，超聲10min，得到用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的阻塞材料。得到的納米粒平均粒徑為550nm。

制備藥物B，即載藥羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物的納米載藥系統(tǒng)的納米粒，制備步驟如下：

將0.565g端羧基的聚乳酸(PLA-COOH)、N-N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，(其中PLA、DCC、DMAP三者投料摩爾比為1:4:2)置于100mL干燥的圓底燒瓶中。同時加入氮氣保護的15mL無水二甲亞砜(DMSO)溶劑，60℃攪拌30min使反應物完全溶解且活化其末端羧基。

與此同時將0.5g羥乙基淀粉溶解于10mL的無水DMSO溶劑中,60℃反應時間為30min。將PLA、DCC、DMAP的DMSO溶液加入到充分溶解了的HES溶液中，并加入5ml的無水DMSO潤洗溶解PLA的燒瓶，之后將潤洗液加入反應液。60℃反應24小時。整個反應過程均在氮氣保護下完成。待反應結(jié)束后，將反應體系置于透析袋(MWCO-3500)中，使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去體系中的DMSO溶劑。透析完畢后將透析袋中的液體轉(zhuǎn)移至塑料培養(yǎng)皿中，先放入-20℃冰箱中冷凍4h，然后放入-50℃的凍干機中冷凍干燥，將冷凍干燥后得到了羥乙基淀粉-聚乳酸接枝聚合物(HES-b-PLA)的凍干粉，利用索氏提取器抽提除去未反應的聚乳酸，具體條件是：以二氯甲烷為提取液，提取溫度為設為70℃，反應時間為36小時。將提取后的樣品在70℃的烘箱中，干燥10min，得到所需的羥乙基淀粉-聚乳酸嵌段聚合物。將得到的羥乙基淀粉-聚乳酸的嵌段聚合物溶解于水中，利用超聲破碎儀，在冰浴下，一邊超聲一邊加入已脫去鹽酸的阿霉素的乙醇二氯甲烷溶液(其中乙醇與二氯甲烷的體積比為1:1)，超聲時間一共5min。將超聲后的乳液加入高壓勻質(zhì)機中，在600bar的壓力下勻質(zhì)兩次，勻質(zhì)完成后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乳液中的有機溶劑，最終得到粉紅色澄清透明溶液。將所得溶液置于透析袋(MWCO-3500)中使用去離子水進行透析，每天早晚換水兩次，共透析3天，以除去沒有包載到聚合物納米粒中的阿霉素。最后將透析得到中的載藥聚合物納米粒的水溶液凍干備用。該步驟全程在避光的條件下進行。最后將得到的包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸的凍干粉，按照11.6mg/ml的濃度溶解于超純水中，超聲10min，得到載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒。該聚合物的接枝率為0.86，得到的納米粒粒徑為140nm。

實施例4

RES blockade策略聯(lián)合羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒載藥系統(tǒng)抗腫瘤效率考察：

利用小鼠H22肝癌模型考察了注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒與注射載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的最佳時間間隔，具體步驟如下：

在雄性BALB/c小鼠右后肢近腋下皮下接種小鼠肝癌H22細胞懸液1×10⁵個細胞/100μL，建立小鼠肝癌H22皮下移植瘤小鼠模型。當皮下瘤體積為50-120mm³時，將小鼠隨機分為4組，各組3只。其中一組單一尾靜脈注射20μg/ml的包載了熒光染料(DiR)的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒100ul，其它三組首先尾靜脈注射400mg/kg用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒，0.5h、1.5h、4h之后再分別注射20μg/ml包載熒光染料(DiR)的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒100ul，再利用小動物活體成像檢測：置于LuminaⅡ操作臺近紅外線進行活性檢測，小鼠全程異氟烷麻醉，整個操作過程中操作臺溫度保持37℃。小動物成像實驗表明注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒與注射載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的最佳時間間隔為1.5h，因為這樣的注射間隔時間熒光染料在腫瘤部位的富集最多。

圖4為本發(fā)明考察的注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒與注射載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的最佳時間間隔的小動物成像圖。從附圖4可知，RES blockade策略在三個時間點均能增加DiR在小鼠腫瘤部位的富集，減少DiR在RES系統(tǒng)的富集。其中，與0.5小時、4小時相比，1.5小時，DiR在腫瘤的富集量最多，在肝臟的富集量最少，與空白對照組相比，有顯著性差異。這一結(jié)果表明，注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒與注射載藥羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的最佳時間間隔為1.5h。

實施例5

RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的組織分布行為考察：

本發(fā)明建立了H22小鼠肝癌皮下瘤模型，考察了RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的組織分布行為，具體步驟如下：

在雄性BALB/c小鼠右后肢近腋下皮下接種小鼠肝癌H22細胞懸液1×10⁵個細胞/100μL，建立小鼠肝癌H22皮下移植瘤小鼠模型。當皮下瘤體積為50-120mm³時，將小鼠隨機分為3組，各組3只，分別經(jīng)尾靜脈注射給予游離阿霉素、包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒以及RESblockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療。其中RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的注射方法具體是：首先注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒，1.5h后再注射包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒。治療中阿霉素的劑量為4mg/kg，用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥劑量為400mg/kg。四組注射完成12h后處死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，首先組織勻漿萃取組織中的阿霉素，然后通過高效液相色譜檢測組織中的藥物含量。組織分布實驗表明RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥方式顯著提高了阿霉素在腫瘤部位的聚集。

圖5為本發(fā)明考察的RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的組織分布圖。從附圖5及表1可知，尾靜脈羥注射12h后，阿霉素原料治療組中相較于載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組以及RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組來說，通過靜脈給藥的方式，本發(fā)明制備的包載阿霉素的羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸納米粒可以顯著的增加阿霉素在腫瘤部位的聚集。

表1

實施例6

RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒載藥系統(tǒng)在體內(nèi)的抗腫瘤效應考察：

本發(fā)明利用小鼠H22肝癌模型考察了RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒載藥系統(tǒng)在體內(nèi)的抗腫瘤效應，具體步驟如下：

在雄性BALB/c小鼠右后肢近腋下皮下接種小鼠肝癌H22細胞懸液1×10⁵個細胞/100μL，建立小鼠肝癌H22皮下移植瘤小鼠模型。當皮下瘤體積為50-120mm³時，將小鼠隨機分為4組，各組5只，分別經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水、游離阿霉素、包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒、RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療，RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的注射方法具體是：首先注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒，1.5h后再注射包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒。治療中阿霉素的劑量為4mg/kg，用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥劑量為400mg/kg。記第一天給藥時間為第0天，再分別于第4、8天按上述劑量給藥。自第0天起，每隔一天測量一次小鼠體重及皮下瘤體積，繪制瘤體積-時間曲線。在第12天處死小鼠，剝離皮下瘤稱重。體內(nèi)抗腫瘤活性實驗表明RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥方式取得了良好的抗腫瘤效果。

圖6為本發(fā)明考察的RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的腫瘤生長曲線圖及腫瘤重量圖。從附圖6可知，與生理鹽水組相比，阿霉素原料治療組、載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組、RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的相對腫瘤體積都有明顯的減少。治療十二天之后，阿霉素原料治療組的抑瘤率為59.4％、載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的抑瘤率為56.5％、RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的抑瘤率為86.8％。實驗結(jié)果表明，與阿霉素原料藥治療組相比較，載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的抑瘤率相差不大，但是RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的抑瘤率明顯提高。RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的抑瘤率是阿霉素原料藥的1.5倍，與組織分布結(jié)果吻合。

實施例7

RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的安全性考察：

本發(fā)明建立了H22小鼠肝癌皮下瘤模型，考察了RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的安全性，具體步驟如下：

在雄性BALB/c小鼠右后肢近腋下皮下接種小鼠肝癌H22細胞懸液1×10⁵個細胞/100μL，建立小鼠肝癌H22皮下移植瘤小鼠模型。當皮下瘤體積為50-120mm³時，將小鼠隨機分為4組，各組4只，分別經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水、游離阿霉素、包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒以及RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療。其中RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的注射方法具體是：首先注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒，1.5h后再注射包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒。治療中阿霉素的劑量為4mg/kg，用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥劑量為400mg/kg。注射4小時后，從小鼠的眼眶靜脈叢取血0.5mL,3500rmp離心10min，取血清100μL,用以測試生物指標肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)以及白蛋白(ALB)。生化指標實驗數(shù)據(jù)表明RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥方式顯著減少了阿霉素的心臟毒性以及肝毒性。

圖7為本發(fā)明考察的RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的的生化指標(CK、ALB、TP)圖。從圖4可以看到，RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組、載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒與生理鹽水組相比，CK,ATP,ALP值基本一致，與阿霉素原料藥相比,載阿霉素的羥乙基淀粉偶聯(lián)聚乳酸納米粒給藥組具有更低的CK,ATP,ALP值,表明RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組能顯著降低阿霉素的心臟及肝臟的毒副作用。

實施例8

本發(fā)明建立了H22小鼠肝癌皮下瘤模型，考察了RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的安全性，具體步驟如下：

在雄性BALB/c小鼠右后肢近腋下皮下接種小鼠肝癌H22細胞懸液1×10⁵個細胞/100μL，建立小鼠肝癌H22皮下移植瘤小鼠模型。當皮下瘤體積為50-120mm³時，將小鼠隨機分為4組，各組4只，分別經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水、游離阿霉素、包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒以及RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療。其中RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒結(jié)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒治療組的注射方法具體是：首先注射RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒，1.5h后再注射包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒。治療中阿霉素的劑量為6mg/kg，用作RES blockade羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥劑量為600mg/kg。注射4小時后，從小鼠的眼眶靜脈叢取血0.5mL,3500rmp離心10min，取血清100μL,用以測試生物指標肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)以及白蛋白(ALB)。生化指標實驗數(shù)據(jù)表明RES blockade策略聯(lián)合包載阿霉素的羥乙基淀粉-聚乳酸納米粒的給藥方式顯著減少了阿霉素的心臟毒性以及肝毒性。

本領域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。