本發(fā)明屬于納米藥物領域，涉及一種針對EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌治療的復合型智能納米載藥系統(tǒng)的制備方法。
背景技術：
：肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌癌(NSCLC)發(fā)病率占所有肺癌發(fā)病率的80％，是影響人類生命健康的重要殺手。EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌是一類惡性程度更高、治療更為困難的肺癌，而觀有的治療方法比較單一低效。棘皮動物微管相關蛋白4(echinodermmicrotubule-associatedprtein-like4，EML4)和間變性淋巴瘤酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)兩個基因分別位于人類2號染色體的p21和p23帶，相隔約10Mb距離。這兩個基因片段的倒位融合能夠使得組織表達新的融合蛋白EML4-ALK。通過體外克隆轉(zhuǎn)化實驗和體內(nèi)基因重組基礎上的肺部選擇性表達實驗證實：不同的EML4-ALK融合突變體均具有惡性轉(zhuǎn)化和致瘤的能力。根據(jù)這些證據(jù)可以將融合基因定義為肺癌的一種新的癌基因。2007日本學者Soda等在1例吸煙的肺腺癌患者腫瘤組織中首先發(fā)現(xiàn)了EML4和ALK基因融合的致瘤性的變異基因-EML4-ALK，自此該類肺癌逐步被人們重視起來。研究報道EML4-ALK突變有很強的排他性，即當它突變時，其他驅(qū)動基因往往不會發(fā)生變異，EML4-ALK融合基因很難與EGFR等突變共存。因此臨床上針對非小細胞肺癌EGFR突變的靶向抑制劑對于發(fā)生EML4-ALK融合的患者的預后效果非常不好。針對這類患者，EML4-ALK融合基因成為了NSCLC的重要治療靶標，具有重要臨床意義?；蛑委熆赏ㄟ^一定方式將基因片段(DNA，RNA)導入細胞內(nèi)對某靶點的mRNA進行抑制。TakezawaK等研究表明在EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌中，ALK蛋白的過表達會激活JAK/STAT3，RAS/ERK信號通路從而抑制抑癌基因BIM的表達，促進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。ChenZ等發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞中，微小RNAmicRNA-301的存在會對BIM的表達起到負調(diào)控作用，從而加重了腫瘤細胞的惡性程度。金納米殼是一種粒徑在30nm左右的球形核殼結(jié)構(gòu)的納米載體，其有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率，能夠吸收800nm的近紅外光而轉(zhuǎn)換成熱能用于體內(nèi)熱療的應用。其比表面積比較大，有較高的藥物上載能力，是一種比較高效的siRNA納米載體。同時可以利用金表面與巰基的共價結(jié)合將腫瘤靶向配體修飾到金納米殼表面，賦予其腫瘤靶向能力。金納米殼在光照后具有突出的熱效應，高溫會將巰金鍵斷開，從而可以進行光觸發(fā)式的基因控制釋放。同時金納米殼所釋放的熱能可以用于對腫瘤組織的熱殺傷，聚焦的熱量可以在宏觀組織層面將腫瘤細胞殺死。所以如果將基因治療與熱療聯(lián)合應用，可以利用基因治療在微觀層面上的治療優(yōu)勢與熱療相結(jié)合，使治療效果得到放大，充分發(fā)揮基因治療與熱療的協(xié)同作用。因此，在本領域期望能夠開發(fā)針對EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌治療的將納米材料、核酸藥物以及化學抗癌藥物結(jié)合在一起的抗癌產(chǎn)品，以期產(chǎn)生熱療、化療及基因治療的多重效果。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種針對EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌的復合型智能納米載藥系統(tǒng)，能夠?qū)Ψ切〖毎伟┑闹委煯a(chǎn)生更好的效果。為達到此目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：一方面，本發(fā)明提供了一種針對EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌治療的復合型智能納米載藥系統(tǒng)，所述載藥系統(tǒng)由金納米殼、ALK干擾序列、micRNA-301干擾序列以及阿霉素制備得到。本發(fā)明針對已有的金納米殼制備方法進行優(yōu)化，合成出穩(wěn)定均一的金納米殼粒子溶液，并采用PEG的修飾提高納米粒子溶液穩(wěn)定性。將有巰基修飾的雙鏈干擾序列共價連接到金納米殼表面，優(yōu)化尋找納米粒子與干擾序列結(jié)合的最佳合成配比關系，大大提升了納米載藥系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷作用，可以產(chǎn)生熱療、化療及基因治療的協(xié)同治療效果，使治療更加高效。另一方面，本發(fā)明的具體技術方案主要包括以下三個方面：(1)合成金納米殼作為核心：采用硝酸銀、檸檬酸三鈉和氯金酸等材料，利用形成銀核金殼的納米結(jié)構(gòu)，對其中金銀的配比及反應條件進行細致優(yōu)化，在合成好后，將一定比例的修飾有巰基和羧基的PEG分子連接到金殼表面，從而提高粒子穩(wěn)定性，將一定量的RGD多肽與PEG分子中的羧基進行共價連接，對制備好的金納米殼進行紫外、粒徑、電鏡等方面的表征，以證明獲得均一穩(wěn)定的金納米殼溶液。這一部分的關鍵是確定金銀的配比及PEG加入的量，因為有文獻報道，少量PEG可提高納米粒子穩(wěn)定性，但過量的PEG則會抑制納米粒子被細胞攝取，所以需要通過多組平行實驗確定能使得金納米殼保持穩(wěn)定的最小PEG量。(2)上載ALK干擾序列及micRNA-301干擾序列：取一定量的ALK干擾序列和micRNA-301干擾序列巰基修飾序列連接到金納米殼的表面，利用離心重懸的方法對合成好的載體進行分離純化，沒有連接到金納米殼表面的序列則會在離心后漂浮在上清溶液中。在這一部分，優(yōu)化了反應過程，尋找最優(yōu)的序列連接數(shù)量。(3)吸附阿霉素：在步驟(2)得到的沉淀中加入一定濃度的阿霉素溶液，使其吸附上去，未吸附的阿霉素通過離心去除。這一部分的關鍵是優(yōu)化載藥量和反應時間。本發(fā)明以基因治療為切入點，利用金納米殼的熱效應及高效基因上載特性，針對基因雙靶點進行抑制，并加入阿霉素作為輔助治療，將基因治療、化療與熱療聯(lián)合利用來協(xié)同治療融合型非小細胞肺癌，給予臨床預后不好的EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌提供新的治療思路與方法。附圖說明圖1為實施例1制備的納米載藥系統(tǒng)的紫外吸收圖譜；圖2為實施例1制備的納米載藥系統(tǒng)中干擾療列和阿霉素的釋放測定結(jié)果圖；圖3為實施例3中對本發(fā)明實施例1制備的納米載藥系統(tǒng)的熱效應考察結(jié)果圖；圖4為實施例4中對本發(fā)明實施例1制備的納米載藥系統(tǒng)中的細胞存活率的測定結(jié)果。具體實施方式實施例1一種針對EML4-ALK融合突變型非小細胞肺癌治療的復合型智能納米載藥系統(tǒng)的制備及紫外吸收測定：在50ml的水加入0.0017g硝酸銀和0.007g檸檬酸三鈉，攪拌并加熱至65℃，反應0.5h后加入0.038g硼氫化鈉，繼續(xù)反應2h。然后將溫度降至室溫，加入0.0556g鹽酸羥胺及0.017g硝酸銀，反應過夜。最后，將體系加熱至65℃并快速加入1ml濃度為25mM的氯金酸。反應4h后即可得到濃度為1nM的金納米殼溶液。加入適量PEG提高金納米殼溶液的穩(wěn)定性。分別取10ul濃度為10uM的ALK干擾序列及micRNA-301干擾序列至1ml金納米殼溶液中(ALK干擾序列及micRNA-301干擾序列由上海生工公司合成，具體序列如表1所示)，室溫攪拌12h后加入100ul的20×SSC溶液進行鹽化，反應過夜后12000rpm離心，去掉上清中未連接的干擾序列，在沉淀中加入濃度為0.5mg/ml的阿霉素溶液1ml，室溫攪拌24h后12000rpm離心，去掉上清中末吸附上的阿霉素，加入1ml水吹打并離心，反復多次至上清呈無色后加1ml水重懸。取適量上述納米載藥系統(tǒng)，用紫外分光光度計進行檢測，得到相應的紫外吸收圖譜。如圖1所示，兩種干擾序列的吸收峰在260nm，阿霉素的吸收峰在520nm，金納米殼的吸收峰在760nm。通過紫外吸收的表征可證明該納米載藥系統(tǒng)已經(jīng)合成成功。表1干擾序列表基因編號序列長度ALK干擾序列SEQIDNO.1ccgcuuugccgauagaaua19micRNA-301干擾序列SEQIDNO.2aguagugcaauaaagucagagc22實施例2實施例1中制備的納米載藥系統(tǒng)光觸發(fā)的干擾序列及阿霉素釋放效率考察：在PBS(pH＝7.4)溶液中投放一定量的納米載藥系統(tǒng)，用808nm近紅外激光器對其進行激發(fā)照射，照射后進行離心，收集上清，并檢測上清在260nm(干擾序列)及520nm(阿霉素)處的紫外吸收值，記錄并描述照射時長與藥物釋放量的關系，優(yōu)化地，選擇1.2W的照射強度，得到如圖2所示的釋放結(jié)果測定圖。如圖所示，當進行光觸發(fā)時，該納米載藥系統(tǒng)結(jié)構(gòu)破壞并釋放出干擾序列和阿霉素，當光照時長超過5分鐘時，干擾序列和阿霉素的相對釋放率均達到百分之八十以上。實施例3實施例1中制備的納米載藥系統(tǒng)的光熱轉(zhuǎn)換效應考察：分別取一定量的同體積的水和納米載藥系統(tǒng)溶液，同時用近紅外808nm激光激發(fā)器進行照射。利用針式溫度計對各溶液進行溫度檢測。在測試的過程改變各種參數(shù)，比如激光器的功率，照射時間，納米載藥系統(tǒng)的濃度等等。優(yōu)化地，選擇1.2W的照射強度，濃度1nM的納米載藥系統(tǒng)，改變光照時間，測量不同時間點的溫度，尋求最佳的照射時間，使得光熱轉(zhuǎn)換效率達到最高，獲得較高溫度用于腫瘤熱療。圖3為該載藥系統(tǒng)的光熱效應轉(zhuǎn)換圖，由圖可知光照時長超過2分鐘時，系統(tǒng)溫度超過45℃，而光照時長超過5分鐘后，系統(tǒng)溫度超過50℃，并幾乎保持不變，故選擇5分鐘作為最佳光照時長。實施例4實施例1中制備的納米載藥系統(tǒng)對肺癌細胞的殺傷能力的考察：理想的納米載藥系統(tǒng)應該是在進入機體或者細胞后的殺傷能力能夠被有效控制，并且在不釋藥的情況下應該對機體細胞沒有毒性。而本發(fā)明中的納米載藥系統(tǒng)是屬于光觸發(fā)的藥物控釋載體，所以本研究中應該分別考察其在有或無近紅外光照射條件下是否對機體細胞產(chǎn)生生物毒性，以評價其作為控釋藥物載體的特性。具體的，取適量的非小細胞肺癌細胞H2228接種于96孔板中，待每孔的細胞密度達到10個時加藥。設置實驗組及對照組，實驗組包括金納米殼，干擾療列@金納米殼以及阿霉素@干擾序列@金納米殼，并且在孵育6h后用光強為1.2W的808激光器進行光觸發(fā)，照射時長為5min。對照組包括金納米殼和阿霉素，僅加藥，不進行光照處理。加藥孵育滿24h后利用MTT法觀察細胞的存活率，對該納米載藥系統(tǒng)的生物安全性進行評估。得到圖4所示的細胞存活曲線圖，由圖可知本發(fā)明制備的阿霉素@干擾序列@金納米殼納米載藥系統(tǒng)擁有良好的細胞殺傷能力，其殺傷效果強于單獨的熱療、化療或基因治療。而金納米殼作為載體，在不光照的情況下表現(xiàn)出無毒性的特性，也是我們選擇這一載體的原因。當前第1頁1 2 3