本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種將TIGA1(Transcript Induced by Growth Arrest 1)作為靶點(diǎn)來增強(qiáng)谷氨酰胺酶抑制劑抗癌活性以有效治療宮頸癌等癌癥的方法。

背景技術(shù)：

宮頸癌通常是一種以化療藥物難以治療的疾病。絕大多數(shù)宮頸癌含有免疫人類乳頭瘤病毒(HPV)抗原。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料表明，宮頸癌在全球婦女癌癥死亡率中位居第二,全球每年約有46.6萬婦女被診斷為宮頸癌,約有28.8萬患者死亡。我國每年宮頸癌的新增病例約13.5萬,死亡病例約有3-5萬人。

癌細(xì)胞新陳代謝的碳源和氮源主要來源于葡萄糖和谷氨酰胺。即使在有氧氣條件下，癌細(xì)胞內(nèi)的代謝主要是葡萄糖酵解而不是氧化磷酸化，這種有氧糖酵解稱為Warburg效應(yīng)，線粒體缺陷能加重此效應(yīng)。Warburg效應(yīng)可導(dǎo)致葡萄糖攝取增加，糖酵解加速和乳酸產(chǎn)生，通過提供過剩代謝底物以及減少線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生以提供有利于癌細(xì)胞生長的條件，是癌細(xì)胞生長和增殖以及抗藥性的基礎(chǔ)。當(dāng)葡萄糖缺乏時，細(xì)胞則可以通過代償性增加谷氨酰胺代謝來維持細(xì)胞的基本新陳代謝。

隨著近年來新型谷氨酰胺酶抑制劑968和BPTES的發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺代謝成為癌癥靶向治療的一大熱點(diǎn)。最新的谷氨酰胺酶抑制劑CB-839是BPTES的同源物，已于2014年開始臨床一期試驗。然而，谷氨酰胺酶抑制劑有較大的副作用且其抗腫瘤效果相對有限，其原因與癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)所產(chǎn)生的抗藥性有關(guān)。因此，查明Warburg效應(yīng)抗藥性的原因以及找到與此相關(guān)的靶點(diǎn)是谷氨酰胺酶抑制劑等化療藥物有效治療癌癥的關(guān)鍵所在。

TIGA1是由位于染色體5q22.2區(qū)域內(nèi)的EPB41l4A-AS1基因編碼的一種小蛋白。此區(qū)域內(nèi)DNA片段丟失時常發(fā)生，因此與腫瘤密切相關(guān)。此區(qū)域內(nèi)EPB41l4A-AS1的反義長非編碼RNA(lncRNA)叫做EPB41l4A-AS2，與腫瘤細(xì)胞的生長密切相關(guān)。盡管EPB41l4A-AS1也被認(rèn)為是一種長非編碼RNA，它依然可以編碼有122個氨基酸的蛋白TIGA1,這種蛋白是大腸桿菌中氰酸酶的同源物，位于線粒體膜上，但其功能并不清楚。有報道提示TIGA1可能與維持細(xì)胞周期過程中無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)。的確，體外過表達(dá)TIGA1可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供抑制或降低腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)和/或活性的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供了抑制或降低腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制備治療腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

或，抑制或降低腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個目的是提供抑制或降低腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)和/或活性的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供了抑制或降低腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)和/或活性的物質(zhì)在制備促進(jìn)谷氨酰胺酶抑制劑治療或抑制腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用；

或TIGA1作為靶點(diǎn)在促進(jìn)谷氨酰胺酶抑制劑治療或抑制腫瘤中應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述抑制或降低腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)和/或活性的物質(zhì)為如下1)或2)：

1)干擾腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)的雙鏈siRNA；

2)表達(dá)所述雙鏈siRNA的重組載體。

上述應(yīng)用中，所述雙鏈siRNA的正義鏈為序列1所示的核苷酸，反義鏈為序列2所示的核苷酸；且所述雙鏈siRNA上的U和C堿基均采用2′甲氧基修飾或2′氟代修飾。。

上述應(yīng)用中，所述腫瘤為宮頸癌；

或，所述腫瘤細(xì)胞為Hela細(xì)胞。

本發(fā)明第三個目的是提供一種產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述抑制或降低腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)和/或活性的物質(zhì)和谷氨酰胺酶抑制劑。

上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品具有如下1)-3)中至少一種功能：

1)治療腫瘤；

2)抑制腫瘤細(xì)胞生長；

3)促進(jìn)谷氨酰胺酶抑制劑治療或抑制腫瘤。

上述產(chǎn)品中，所述谷氨酰胺酶抑制劑為化合物968。

上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品為試劑盒或單獨(dú)包裝的藥物組合物或混合包裝的藥物組合物。

上述產(chǎn)品中，所述腫瘤為宮頸癌；

或，所述腫瘤細(xì)胞為Hela細(xì)胞。

本發(fā)明提供一種通過RNA干擾將TIGA1作為靶點(diǎn)來增強(qiáng)谷氨酰胺酶抑制劑抗癌活性以有效治療宮頸癌等癌癥的應(yīng)用。當(dāng)TIGA1基因表達(dá)量通過RNA干擾技術(shù)被敲低后，可阻斷葡萄糖來源的丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，從而促發(fā)谷氨酰胺代償性增加。谷氨酰胺酶抑制劑如化合物968可抑制谷氨酰胺代謝而不能影響糖酵解，因此抑制腫瘤細(xì)胞生長作用較弱。因此，在TIGA1基因被敲低的同時用谷氨酰胺酶抑制劑處理癌細(xì)胞，可同時阻斷糖代謝和谷氨酰胺代謝，造成細(xì)胞營養(yǎng)和能量匱乏，導(dǎo)致生長顯著減慢，達(dá)到治療癌癥的目的。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明以TIGA1基因為有效靶點(diǎn)，結(jié)合RNA干擾技術(shù)和谷氨酰胺酶抑制劑，顯著降低了癌細(xì)胞的抗藥性并提高了谷氨酰胺酶抑制劑的抗癌活性，可用于治療宮頸癌。將此靶點(diǎn)與谷氨酰胺酶抑制劑等化療藥物結(jié)合或許是提高化療藥物療效和降低宮頸癌死亡率的手段，大大提高了此抑制劑抗腫瘤的效果。

附圖說明

圖1為利用實時定量PCR檢測Hela細(xì)胞內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染TIGA1的特異性siRNA后TIGA1的mRNA的表達(dá)量。

圖2為利用Westernblot方法檢測Hela細(xì)胞內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染TIGA1的特異性siRNA后TIGA1的蛋白表達(dá)量。

圖3為穩(wěn)定表達(dá)shTIGA1的Hela細(xì)胞系與其對應(yīng)的對照的細(xì)胞系的軟瓊脂集落形成實驗。

圖4為裸鼠分別皮下注射表達(dá)shTIGA1的穩(wěn)定Hela細(xì)胞與其相應(yīng)的對照細(xì)胞后,用化合物968腹腔給藥并測量腫瘤的體積。

圖5為TIGA1調(diào)低組與對照組在用谷氨酰胺酶抑制劑治療后的腫瘤大小的代表圖片。

圖6為對圖5中兩組腫瘤進(jìn)行稱重后比較其重量差異。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、沉默腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)

在長期的實驗中發(fā)現(xiàn)TIGA1基因與癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)以及能量代謝有密切關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺酶抑制劑作為抗腫瘤藥物療效并不理想，而這種藥物低效性可能與Warburg效應(yīng)有關(guān)，因此，研究TIGA1作為靶點(diǎn)是否可以提高谷氨酰胺酶抑制劑抗腫瘤的效果。

一、siRNA瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞

1、用于干擾TIGA1基因表達(dá)的2個siRNA

siTIGA1-1：

正義鏈5’-GGAUGUCCUUGGUGAGGAUTT-3’(序列1),

反義鏈5’-AUCCUCACCAAGGACAUCCTT-3’(序列2)；

siTIGA1-2:

正義鏈5’-GGCCUUACCGUAUAACUGATT-3’

反義鏈5’-UCAGUUAUACGGUAAGGCCTT-3’。

siRNA雙鏈上在U和C堿基上采用2′甲氧基；

將上述siTIGA1-1和siTIGA1-2的正義鏈和反義鏈退火，得到siTIGA1-1和siTIGA1-2；

利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將兩條TIGA1的特異性siTIGA1-1和siTIGA1-2分別瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系，48小時后。

2、基因表達(dá)分析

利用RNAiso plus(TAKARA)提取兩條siRNA分別瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系48小時后的總RNA，用ReverTraAceqPCR RT試劑盒(TOYOBO)將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR利用SYBR Green RealTime PCRMaster Mix(TOYOBO)來完成，同時做三個重復(fù)，以ACTB為內(nèi)參。所用的引物如下:EPB41L4A-AS1(正義5’-CCTGGTTTTATTTTCGTCA-3’,反向5’-ATCCATCTTCCACCTGTAG-3’),ACTB(正向5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’,反向5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’)。

結(jié)果如圖1所示，NC為Hela細(xì)胞，可以看出，兩條siRNA均有較好的抑制TIGA1基因表達(dá)。

3、Westernblot蛋白定量分析

利用裂解液(配方為50mM TRIS-HCl,pH 8.0,4M urea and 1％Triton X-100，蛋白酶抑制劑)提取兩條siRNA分別瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系48小時后細(xì)胞內(nèi)蛋白后用SDS-PAGE膠分離(恒定電流30毫安跑膠)。然后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5％脫脂牛奶(溶解于TBST)在室溫下孵育一小時。隨后一抗(ACTB和TIGA1)室溫孵育一小時，并用TBST清洗膜三次后，加入二抗(Anti-Rabbit IgG和Anti-Goat IgG)室溫孵育一小時。孵育完畢后繼續(xù)用TBST清洗三次，然后暗室曝光。所用抗體如下ACTB(Proteintech,#20536-1-AP),TIGA1(Santa Cruz,sc-244315),Anti-Rabbit IgG(KPL,074-1506),Anti-Goat IgG(KPL,14-13-06)。

結(jié)果如圖2所示，可以看出，此兩條siRNA均能敲低細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TIGA1。

二、利用shRNA技術(shù)構(gòu)建了可穩(wěn)定過表達(dá)TIGA1特異性siRNA的Hela細(xì)胞系

Hela宮頸癌細(xì)胞系購自美國ATCC公司，用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(購自Thermo Fisher Scientific)置于37攝氏度、5％的二氧化碳條件下培養(yǎng)。

將上述一中的ShTIGA1的正義鏈和反義鏈退火，得到雙鏈shTIGA1-1和雙鏈shTIGA1-2；

表達(dá)siTIGA1-1的質(zhì)粒為將雙鏈siTIGA1-1的編碼DNA分子插入GV248載體(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)得到的載體，可以穩(wěn)定表達(dá)siTIGA1(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司構(gòu)建的過表達(dá)siTIGA1-1的質(zhì)粒，提供雙鏈siTIGA1-1的編碼DNA分子即可)。

表達(dá)siTIGA1-2的質(zhì)粒為將雙鏈siTIGA1-2的編碼DNA分子插入GV248載體(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)得到的載體，可以穩(wěn)定表達(dá)siTIGA2。

表達(dá)siTIGA1-1的質(zhì)粒、表達(dá)siTIGA1-2的質(zhì)粒shRNA和GV248載體(對照質(zhì)粒)分別用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染48小時后開始用終濃度為200微克每毫升的嘌呤霉素水溶液進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選，一個月后，能夠在此濃度藥物中正常生存的細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞、轉(zhuǎn)siTIGA1-2細(xì)胞和轉(zhuǎn)GV248載體細(xì)胞。

采用上述一的基因表達(dá)和WB檢測，均檢測穩(wěn)定表達(dá)siTIGA1的細(xì)胞系中TIGA1表達(dá)敲低。

實施例2、沉默腫瘤細(xì)胞中TIGA1表達(dá)在治療腫瘤中的應(yīng)用

一、體外實驗軟瓊脂集落形成

分別收集對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞(SHTIGA1)和轉(zhuǎn)GV248載體細(xì)胞(SHNC)，調(diào)整細(xì)胞濃度，制成500活細(xì)胞每毫升的細(xì)胞懸液。15mlEP管中加入9ml此細(xì)胞懸液，然后各加入1ml3％的瓊脂后混勻。六孔板中每孔加入混勻后的液體2ml，并于室溫放置20分鐘使其凝固。將細(xì)胞置于37攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將上述細(xì)胞分為對照組和實驗組分別處理：

對照組：將各個細(xì)胞在含有DMSO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，每3天更換一次新鮮的培養(yǎng)基；

含有DMSO的培養(yǎng)基為DMSO(D2650)和細(xì)胞培養(yǎng)基組成。DMSO濃度為千分之一。

實驗組：將各個細(xì)胞在含有谷氨酰胺酶抑制劑化合物968(SIGMA，SML1327)的培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，每3天更換一次新鮮的培養(yǎng)基；

含有化合物968的培養(yǎng)基為由10納摩爾濃度的化合物968和細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基、Thermo Fisher，10566-016)組成。

觀察集落形成情況，結(jié)果如圖3所示，可以看出，

與轉(zhuǎn)GV248載體細(xì)胞對照組相比，轉(zhuǎn)GV248載體細(xì)胞實驗組單獨(dú)用谷氨酰胺酶抑制劑化合物968處理，可以減少瓊脂中癌細(xì)胞克隆數(shù)目，但不能抑制集落形成；

與轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞載體細(xì)胞對照組相比，轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞載體細(xì)胞實驗組，在TIGA1表達(dá)量被敲低的條件下同時用化合物968處理細(xì)胞，可導(dǎo)致癌細(xì)胞克隆數(shù)目及面積急劇下降。這是由于對于轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞載體細(xì)胞對照組來說，單獨(dú)敲低TIGA1基因的表達(dá)后，可阻斷葡萄糖來源的丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，從而促發(fā)谷氨酰胺代償性增加，因此對集落形成的影響不明顯。

表明，以TIGA1為靶點(diǎn)敲低TIGA1基因表達(dá)和谷氨酰胺酶抑制劑共同作用的治療方案有較為理想的抗宮頸癌的作用。

二、體內(nèi)實驗

4周齡裸鼠購自廣州動物實驗中心，并于動物房飼養(yǎng)一周后在用于試驗。將小鼠隨機(jī)分為兩組：

轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞組(SHTIGA1-1)：用于皮下注射轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞；每組7只，每只小鼠分別注射5×10⁵個癌細(xì)胞。

Hela細(xì)胞組(SHNC)：用于皮下注射對照Hela細(xì)胞；每組7只，每只小鼠分別注射5×10⁵個癌細(xì)胞。

13天后腫瘤長大體積達(dá)到75mm³后，每兩天每只小鼠腹腔內(nèi)注射100微克谷氨酰胺酶抑制劑化合物968。同時注射DMSO或PBS作為陰性對照。

四周后，取小鼠體內(nèi)腫瘤稱重并進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4和圖6所示，與Hela細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞組對谷氨酰胺酶抑制劑的敏感性顯著提高，此組腫瘤的生長被有效抑制，其腫瘤重量顯著小于對照組。

腫瘤體積的統(tǒng)計圖如5所示，可以看出，轉(zhuǎn)siTIGA1-1細(xì)胞組腫瘤體積顯著低于Hela細(xì)胞組。

表明合并TIGA1基因敲低和谷氨酰胺酶抑制劑具有較為理想的抗腫瘤效果。

序列表

<110>清華大學(xué)深圳研究生院 蘇州吉瑪基因股份有限公司 深圳南粵藥業(yè)有限公司

<120> 一種將TIGA1作為靶點(diǎn)來增強(qiáng)谷氨酰胺酶抑制劑抗宮頸癌活性的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ggauguccuu ggugaggaut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

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