本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)及應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是涉及一種抗奶牛乳腺炎卵黃抗體復(fù)合制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

奶牛乳腺炎也被稱為奶牛乳房炎，是乳腺受到物理、化學(xué)、微生物刺激后，引起奶牛乳腺發(fā)生炎性反應(yīng)的一類疾病，是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最常見的疾病之一，也是給養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟損失最嚴(yán)重的疾病。奶牛乳腺炎帶來的主要影響為：奶牛產(chǎn)奶量的下降，改變的牛奶成分也會影響奶產(chǎn)品的品質(zhì)，廢棄牛奶、治療奶牛乳腺炎的高額費用以及病牛的淘汰帶來的巨大經(jīng)濟損失。1996年，據(jù)美國奶牛乳腺炎協(xié)會(NMC)報道，全球約有35％的奶?；加腥橄傺?，患病后的奶牛產(chǎn)奶量下降20％左右，嚴(yán)重影響了奶牛業(yè)的發(fā)展。截至2014年底，我國奶牛存欄1460萬頭(第六屆中國奶業(yè)大會暨中國奶業(yè)展覽會)，其中患有各種乳腺炎的奶牛為70％。盡管對奶牛乳腺炎的防治已經(jīng)有一百多年的研究，但是實際生產(chǎn)中主要依靠抗生素的治療，且隨著耐藥性的出現(xiàn)降低了治療效果，同時抗生素的殘留也危及著人類的健康。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是導(dǎo)致奶牛乳腺炎的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，有“嗜肉菌”的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染。金黃色葡萄球菌可引起奶牛的“臨床型乳腺炎”，其中，46.67％的病牛將面臨死亡，或者被淘汰，26.67％的病牛會乳區(qū)萎縮或者病乳廢棄，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。

我國的牛場奶樣取集發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌和大腸桿菌也是主要致病菌，因此對于奶牛乳腺炎的治療，考慮用多聯(lián)卵黃抗體注射膏劑，效果會更加明顯。

目前對于致病菌引起的疾病的防治手段主要有以下幾種：抗生素和化學(xué)類藥物、中草藥、滅活疫苗和抗體等。其中使用最為普遍的即是抗生素和化學(xué)類藥物。但隨著抗生素和化學(xué)藥物的長期濫用，帶來了諸多弊端：①使病原菌產(chǎn)生耐藥性，以致抗生素的作用效果顯著下降，甚至無效；②造成嚴(yán)重的水體污染，并引發(fā)水環(huán)境微生態(tài)失衡；③在動物體內(nèi)產(chǎn)生藥物殘留，影響產(chǎn)品的質(zhì)量安全，并間接危害人體健康。因此，亟待尋求一種既能有效控制奶牛乳腺炎，又不會帶來毒副作用的新技術(shù)、新產(chǎn)品，以部分或完全替代現(xiàn)有抗生素或化學(xué)藥物，實現(xiàn)健康養(yǎng)殖，也已成為當(dāng)前研究的熱點和難點。

卵黃抗體(egg yolk immunoglobulin，IgY)由于具有特異性強、高效性、無毒無副作用及對環(huán)境無害等特點，已經(jīng)成為一種有效的抗生素和化學(xué)類藥物替代品。而且卵黃抗體具有低成本、高效益，生產(chǎn)便利及產(chǎn)量高等特點，被作為疾病預(yù)防和控制的有效方法而受到廣泛的關(guān)注。與傳統(tǒng)的抗生素和化學(xué)藥物相比，應(yīng)用卵黃抗體具有以下幾個優(yōu)點：(1)特異性強；(2)易獲??；(3)少量抗原就可以引發(fā)有效的免疫應(yīng)答；(4)無殘留；(5)研發(fā)周期短，成本低，可長期保存，便于運輸和應(yīng)用。美國食品和藥品管理局(FDA)將卵黃抗體列入“公認(rèn)安全使用物質(zhì)(Generally Recognized As Safe,GRAS)，把卵黃抗體看作藥效營養(yǎng)品(Nutraceuticals)。特異性卵黃抗體通過飼喂、注射等方式，對哺乳動物起到保護預(yù)防及疾病治療作用，還可以應(yīng)用于免疫學(xué)檢測和疾病診斷等領(lǐng)域。但是目前使用的抗體制劑多數(shù)為單一病原抗體，對于混合感染的疾病不能很好控制。另一方面，應(yīng)用卵黃抗體防治疾病也有不可避免的缺點，如可能帶有蛋傳染性疾病的病原，限制了卵黃抗體在養(yǎng)禽業(yè)上的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療奶牛乳腺炎的卵黃抗體復(fù)合制劑及其制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種抗奶牛乳腺炎卵黃抗體復(fù)合制劑，按照重量份由如下組分組成：

本發(fā)明還提供制備抗奶牛乳腺炎的膏狀復(fù)合制劑的方法，包括以下步驟：

(1)按照比例于容器中加入食品級果膠，再加入去離子水，攪拌均勻，加熱至50℃-70℃，放置冷卻；

(2)待步驟(1)的溶液冷卻至40℃-50℃，按照比例依次加入抗金黃色葡萄球菌卵黃抗體、抗大腸桿菌卵黃抗體、抗無乳鏈球菌卵黃抗體，攪拌均勻；

(3)添加復(fù)合維生素，攪拌均勻，得膏狀復(fù)合制劑。

進一步地，本發(fā)明的上述技術(shù)方案中，在步驟(1)中，加入去離子水時，采用少量多次加入的方式。采用這種加入方式有利于果膠的溶解，使其更加均勻的進入制劑中，從而增加制劑的粘稠度，以保證在給藥過程中，對于病灶部位起到緩釋治療的作用。

本發(fā)明中所述的抗金黃色葡萄球菌卵黃抗體、抗大腸桿菌卵黃抗體和抗無乳鏈球菌卵黃抗體可以按照本領(lǐng)域常規(guī)方法將滅活菌與佐劑混合、乳化得到的佐劑疫苗對蛋雞進行免疫，免疫方法優(yōu)選強化免疫，三免后一周開始收集雞蛋，通過水稀釋法分離得到水溶性組分后，進一步分離純化后得到卵黃抗體的凍干粉，抗體純度85％以上。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，從免疫蛋雞的雞蛋中制備得到卵黃抗體的方法包括以下步驟：

(1)將雞蛋清洗、消毒后，收集卵黃液，加入卵黃液6倍體積的去離子水稀釋，調(diào)pH至5.0，-20℃冷凍過夜后，在4℃緩慢解凍，反復(fù)凍融2次后，離心，收集上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔濾膜過濾，收集濾液，即為得卵黃水溶性組分；

(2)向卵黃水溶性組分中加入硫酸銨至飽和度為60％，4℃下過夜后離心，將沉淀用去離子水稀釋至原體積，再加入硫酸鈉至飽和度為14％，攪拌均勻后室溫過夜，室溫離心，將沉淀用去離子水稀釋至原體積，得到卵黃抗體提取液；卵黃抗體提取液用100kDa截留量的超濾膜包進行超濾濃縮，超濾后的卵黃抗體提取液在-70℃下預(yù)凍2h，然后在真空度20Pa下，冷凍干燥。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的復(fù)合制劑特異性強、純度高，且對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌有較強的抑制作用，同時抗體制備成本低、方便簡易，適于大規(guī)模生產(chǎn)，可用于由金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌引起的奶牛乳腺炎的預(yù)防和治療。本發(fā)明的復(fù)合制劑為膏狀制劑，可以直接將膏劑注入病牛乳池中，可以比較長期的留存于病牛乳池中，從而達到緩釋治療的作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明三種致病菌特異性卵黃抗體效價圖。

圖2為本發(fā)明抗金黃色葡萄球菌特異性卵黃抗體的非還原性SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果；其中，泳道M：蛋白Maker；泳道1：卵黃抗體粗提物；泳道2：硫酸銨鹽析后所得溶液；泳道3：硫酸鈉鹽析后所得溶液；泳道4：超濾濃縮后所得溶液；泳道5：標(biāo)準(zhǔn)IgY。

圖3為本發(fā)明抗金黃色葡萄球菌特異性卵黃抗體的還原性SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果；其中，泳道M：蛋白Maker；泳道1：卵黃抗體粗提物；泳道2：硫酸銨鹽析后所得溶液；泳道3：硫酸鈉鹽析后所得溶液；泳道4：超濾濃縮后所得溶液；泳道5：標(biāo)準(zhǔn)IgY。

圖4為本發(fā)明抗金黃色葡萄球菌特異性卵黃抗體的體外抑菌效果。

圖5為治療前后奶牛乳腺外觀形狀的變化。

圖6為治療前后牛奶外觀性狀的變化。

圖7為不同藥物治療臨床型乳腺炎牛奶中體細(xì)胞數(shù)變化情況。

圖8為不同藥物治療臨床型乳腺炎牛奶中細(xì)菌計數(shù)變化。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、方案、流程和優(yōu)點更加清楚明晰，結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，值得注意的是，此處具體實施例僅作為解釋說明本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從化學(xué)公司購買。

實施例所用的致病菌及其他原料：

金黃色葡萄球菌(CVCC545)(Staphylococcus aureus)：購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

大腸桿菌(CVCC1450)(Escherichia coli E.coli)：購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

無乳鏈球菌(CVCC1886)(Streptococcus agalactiae)：購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

復(fù)合維生素：購自大連博諾生物化學(xué)試劑公司。

實施例1抗奶牛乳腺炎主要致病菌特異性卵黃抗體的制備

以抗金黃色葡萄球菌抗體的制備為例。

(1)金黃色葡萄球菌抗原的制備

將金黃色葡萄球菌于TSA固體瓊脂培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在37℃，140rpm的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)12h后，培養(yǎng)至菌濃度為10⁸CFU/mL，然后離心分離得到含有金黃色葡萄球菌的沉淀物和上清液，將沉淀物與無菌PBS混合得到10⁹CFU/mL金黃色葡萄球菌的菌懸液。

(2)金黃色葡萄球菌抗原的滅活

在菌懸液中加入甲醛，使甲醛體積終濃度為0.5％，37℃搖床滅活24h后，5000g/min離心10min，除去甲醛，用無菌PBS洗滌菌體沉淀3次，調(diào)整菌液濃度，即得到滅活的金黃色葡萄球菌抗原。

(3)疫苗的制備及蛋雞的免疫

對蛋雞進行免疫，共免疫三次，初免(基礎(chǔ)免疫)為：將滅活的致病菌抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合，并采用雙推法乳化，乳化完全后對蛋雞頸后皮下和左右胸肌進行3點注射免疫，其中左右胸肌各注射0.3mL，頸后皮下注射0.4mL。初免2周后依次進行二次和三次免疫，即加強免疫，具體方法為：將滅活金黃色葡萄球菌抗原與弗氏不完全佐劑混合，采用雙推法完全乳化，對蛋雞進行3點注射免疫，每次免疫間隔2周，二次免疫時左右胸肌和頸后部皮下各注射0.5mL，三次免疫時左右胸肌各0.6mL，頸后部皮下注射0.8mL；第二次加強免疫后開始收集雞蛋，于4℃冰箱中冷藏保存。

(4)卵黃抗體的粗分離

將得到的免疫雞蛋用0.5％新潔爾滅溶液浸泡消毒。用卵黃分離器分離蛋黃，用無菌牙簽刺破卵黃膜收集卵黃液于容器內(nèi)，加入卵黃液體積6倍的去離子水稀釋，調(diào)節(jié)pH至5.0，放入-20攝氏度冰箱冷凍過夜后，放在4℃冰箱中緩慢解凍，反復(fù)凍融2次后取上清液，依次用0.45μm和0.22μm的微孔濾膜過濾，得到卵黃抗體水溶性組分，即卵黃抗體的粗提物，選取卵黃抗體效價在1:10000以上的卵黃抗體的粗提物，進行進一步的純化。

(5)卵黃抗體粗提物的純化

向卵黃抗體粗提物中加入硫酸銨至飽和度為60％，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?℃過夜。4℃，10000g/min，離心15min，棄上清，將沉淀用去離子水稀釋至原體積，再加入硫酸鈉至飽和度為14％，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笫覝剡^夜。室溫，10000g/min，離心15min，棄上清，將沉淀用去離子水稀釋至原體積，即得到IgY提取液。用100kDa截留量的超濾膜包進行超濾濃縮，同時進一步純化。將超濾后的卵黃抗體液在-70℃條件下預(yù)凍2h，然后在真空度20Pa下，冷凍干燥，24h后得到純化的抗金黃色葡萄球菌卵黃抗體凍干粉。

采用相同的方法也可以得到抗大腸桿菌特異性卵黃抗體以及抗無乳鏈球菌特異性卵黃抗體。

實施例2卵黃抗體的效價檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測效價，用10⁹CFU/mL菌濃度的致病菌包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃包被過夜后，甩板，用洗滌液洗滌3次后，加入含有1％BSA的封閉液37℃水浴2h。水浴結(jié)束后甩板，洗滌3次，然后每孔加入含有1‰BSA的結(jié)合物稀釋液稀釋的致病菌卵黃抗體(或卵黃抗體粗提物)100μL，同時設(shè)置陰性對照和空白對照，37℃水浴2h。水浴結(jié)束后洗滌3次，每孔加入結(jié)合物稀釋液稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞抗體(IgG-HRP)100μL，37℃水浴1h。反應(yīng)結(jié)束后洗滌5次，每孔加入TMB顯色液100μL，室溫避光顯色20min，顯色結(jié)束后每孔加入H₂SO₄終止液50μL，用酶標(biāo)儀檢測OD_450/630nm。OD值大于陰性對照平均值2.1倍的最高稀釋度為卵黃抗體效價?？谷N致病菌(金黃色葡萄球菌(S.aureus)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、大腸桿菌(E.coli))特異性卵黃抗體效價圖如圖1。圖1可見，初次免疫后效價開始上升，7周后，抗金黃色葡萄球菌特異性卵黃抗體達到峰值，為32000；8周后，抗無乳鏈球菌特異性卵黃抗體達到峰值，為24000；8周后，抗大腸桿菌特異性卵黃抗體達到峰值，為32000；持續(xù)3-4周時間后開始下降，第三次加強免疫后，效價再次升至峰值，并持續(xù)兩周時間，然后逐步下降。

實施例3卵黃抗體的純度鑒定

取實施例1中步驟(4)步驟(5)中得到的產(chǎn)品進行卵黃抗體純度鑒定，使用非還原性SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2，M：蛋白Maker；1：卵黃抗體粗提物；2：硫酸銨鹽析后所得溶液；3：硫酸鈉鹽析后所得溶液；4：超濾濃縮后所得溶液；5：卵黃抗體凍干粉。用還原性SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3，其中M：蛋白Maker；1：卵黃抗體粗提物；2：硫酸銨鹽析后所得溶液；3：硫酸鈉鹽析后所得溶液；4：超濾濃縮后所得溶液；5：卵黃抗體凍干粉。圖2的結(jié)果顯示，IgY的分子量為180kDa，由于非還原性SDS-PAGE的上樣緩沖液中無β-巰基乙醇，因此IgY分子的二硫鍵未被破壞，保留了其四級結(jié)構(gòu)，電泳結(jié)果顯示會比本身分子量高。經(jīng)凝膠分析軟件分析可知，純度達到83％。圖3的結(jié)果顯示，IgY分子由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，重鏈約68kDa，輕鏈約28kDa。還原性SDS-PAGE的上樣緩沖液中含有β-巰基乙醇，可以IgY分子間的二硫鍵斷裂，使各亞基完全分開為兩條重鏈和兩條輕鏈。結(jié)果顯示其重鏈約68kDa，輕鏈約28kDa與文獻報道一致。

實施例4體外抑菌實驗

將金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃，140rpm搖床培養(yǎng)，待至對數(shù)期是接種于新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)菌濃度至10⁶CFU/mL，分裝到6個三角瓶中并分別加入0.22μm過濾除菌后的1mg/ml、5mg/ml和10mg/ml抗金黃色葡萄球菌特異性卵黃抗體、10mg/ml非特異性卵黃抗體(卵黃抗體均溶解于PBS中)、鏈霉素0.1mg/ml(圖4中以抗生素0.1mg/ml表示)和無菌PBS(0.01mol/mL，pH 7.4)。將6個三角瓶28℃，140rpm搖床培養(yǎng)，每隔2小時取培養(yǎng)液，用稀釋涂平板法計活菌數(shù)。結(jié)果證明(圖4)，制備的抗金黃色葡萄球菌卵黃抗體的濃度達到10mg/ml時，對金黃色葡萄球菌的生長繁殖有明顯的抑制作用。

實施例5

一種抗奶牛乳腺炎卵黃抗體復(fù)合制劑，按照質(zhì)量百分比由如下組分組成：抗金黃色葡萄球菌卵黃抗體8份、抗大腸桿菌卵黃抗體8份、抗無乳鏈球菌卵黃抗體8份、食品級果膠5份、復(fù)合維生素3份、去離子水50份.

利用復(fù)合制劑按照如下方法制備膏狀復(fù)合制劑：

(1)按照比例加入食品級果膠，加入去離子水，攪拌均勻，加熱至60℃，放置冷卻；

(2)待步驟(1)的溶液冷卻至40℃，按照比例依次加入抗金黃色葡萄球菌卵黃抗體、抗大腸桿菌卵黃抗體、抗無乳鏈球菌卵黃抗體，攪拌均勻；

(3)添加復(fù)合維生素，攪拌均勻，得膏狀復(fù)合制劑。

實施例6抗奶牛乳腺炎特異性卵黃抗體復(fù)合制劑治療臨床型奶牛乳腺炎的應(yīng)用

將判定為臨床型乳腺炎的奶牛24頭隨機分為空白對照組、青霉素對照組和IgY治療組，分別將青霉素溶液(2mg/mL)、卵黃抗體復(fù)合制劑(實施例5制備得到)各10mL注入乳池中，空白對照組不作任何處理。每天早10點、晚6點擠奶后注射，連續(xù)給藥6天。治療前和治療期間每天早晨擠奶時采集樣品，取樣后4℃保存，送樣上機檢測。

(1)乳腺外觀變化

奶?；既橄傺缀?，乳腺的主要外觀表現(xiàn)是乳頭、乳腺紅腫(圖5B)，甚至壞死(圖5C)?？贵w或青霉素治療后乳腺外觀癥狀改善，恢復(fù)正常(圖5A)。

(2)牛奶性狀變化

①顏色改變

臨床型乳腺炎組在治療前牛奶的顏色為肉色(III級)甚至血紅色(IV級)(圖6)，治療后得到明顯改善。臨床型乳腺炎組在抗體或青霉素治療后72h牛奶顏色明顯改善(p<0.05)，在144h內(nèi)經(jīng)抗體治療有3個奶樣恢復(fù)正常，青霉素治療后2個奶樣恢復(fù)正常(I級)。無藥物治療時牛奶顏色未得到改善(表1)。

表1臨床型乳腺炎奶牛在不同治療作用下牛奶顏色的改變

^*p<0.05，相對于0h處理組；^#p<0.05，相對于未處理組。

②凝結(jié)狀況改變

臨床型乳腺炎組在治療前牛奶中有大量凝塊(III級)甚至分層(IV級)。臨床型乳腺炎組在抗體或青霉素治療后48h牛奶中凝塊明顯減少(p<0.05)。治療后120h各有3個奶樣恢復(fù)正常，無藥物治療時牛奶凝結(jié)狀況未得到改善(表2)。

表2臨床型乳腺炎奶牛在不同治療作用下牛奶凝塊的改變

^*p<0.05，相對于0h處理組；^#p<0.05，相對于未處理組。

③體細(xì)胞數(shù)變化

臨床型乳腺炎組，注射抗體復(fù)合制劑或青霉素24h后牛奶中SCC均明顯低于未治療組(p<0.05)，抗體對SCC的降低作用強于青霉素(p<0.05)(圖7)。

(3)細(xì)菌計數(shù)變化

由圖8可見，經(jīng)IgY或青霉素治療后臨床型乳腺炎組的細(xì)菌計數(shù)明顯降低(p<0.05)。IgY的抑菌作用強于青霉素(p<0.05)。

(4)治愈率

表3的結(jié)果顯示，臨床型奶牛乳腺炎患病奶牛在經(jīng)青霉素和IgY治療后，IgY治療組治愈率為75％，與青霉素治療組相當(dāng)。

表3臨床型奶牛乳腺炎的治愈率