本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種一種顯著提高免疫能力的肺癌干細(xì)胞疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤疫苗即是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，達(dá)到治療腫瘤的目的。治療性腫瘤疫苗可通過主動(dòng)免疫誘導(dǎo)全身特異性抗腫瘤效應(yīng)。根據(jù)其制備方法不同，疫苗主要分為：細(xì)胞疫苗、多肽疫苗和蛋白質(zhì)疫苗、核酸疫苗、抗獨(dú)特型抗體疫苗等。腫瘤干細(xì)胞疫苗是最近興起的研究方法，在肝癌、卵巢癌等方面已獲得了相應(yīng)的研究進(jìn)展。由于腫瘤干細(xì)胞的免疫原性非常的弱，開展腫瘤干細(xì)胞疫苗的主要任務(wù)之一便是提高其免疫原性。不過，對(duì)于不同的腫瘤干細(xì)胞而言，提高免疫原性所依賴的原理和方法尚未形成共識(shí)，許多研究之間還存在矛盾之處。一般而言，聚酐對(duì)于免疫原性的穩(wěn)定性具有著很好的效果，可增強(qiáng)免疫應(yīng)答。不過在本發(fā)明的前期研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其并不能發(fā)揮此效果。同樣，甘露聚糖或者甘露聚糖肽雖也是常用的抗腫瘤佐劑（如“Oligomannose-coatedliposomesasatherapeuticantigen-deliveryandanadjuvantvehicleforinductionofinvivotumorimmunit”），其同樣難以制備成肺癌疫苗。因此，本領(lǐng)域亟需一種適用于肺癌干細(xì)胞疫苗的制備方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的之一在于提供一種顯著提高免疫能力的肺癌干細(xì)胞疫苗的制備方法，該方法包括如下步驟：（1）將復(fù)蘇后的肺癌干細(xì)胞于DMEM全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DMEM全培養(yǎng)基中含8%的FBS，培養(yǎng)溫度為37℃，濕度為85%，CO2的濃度為0.5%，培養(yǎng)3-4天，之后對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行1:3的分盤，再用同樣的培養(yǎng)基在同樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天，細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘體或近似紡錘體；（2）對(duì)步驟（1）所得物利用60Co進(jìn)行輻照處理，劑量為3-4Gy；（3）選取CD133陽性干細(xì)胞，培養(yǎng)后進(jìn)行滅活處理，利用生理鹽水重懸干細(xì)胞，使得細(xì)胞濃度為1×105-1×106個(gè)/ml；（4）按照體積比4:1.5:2的比例，將步驟（3）所得物、殼聚糖生理鹽水溶液和昆布多糖生理鹽水溶液混合，混合后，殼聚糖濃度為2%，昆布多糖的濃度為2.5%。利用60Co進(jìn)行輻照，能夠使得陽性干細(xì)胞的比例大幅增加，利于疫苗的制備。一般而言，利用輻照會(huì)產(chǎn)生一些難以預(yù)料的后果，但是采用低劑量（3-4Gy）的60Co輻照時(shí)，并沒有發(fā)現(xiàn)其它不理的后果，而是大幅增加了陽性干細(xì)胞的比例。初步的研究發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的輻照劑量下，CD133陽性干細(xì)胞的比例可達(dá)到70-90%左右，而不進(jìn)行輻照，所得的CD133陽性干細(xì)胞僅為40%左右。不過，輻照劑量與CD133干細(xì)胞比例之間并非呈線性關(guān)系，更為重要的是，即使采用同樣的輻照劑量進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，不同實(shí)驗(yàn)之間所得CD133陽性干細(xì)胞比例在30-50%范圍內(nèi)呈具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的無規(guī)律隨機(jī)分布。關(guān)于該現(xiàn)象的機(jī)理，還需要進(jìn)行深入的研究。另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)利用甘露聚糖作為佐劑無法實(shí)現(xiàn)滿意的疫苗功能，可能是甘露聚糖并不能增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明能夠獲得較好的效果的原因可能在于對(duì)肺癌干細(xì)胞的處理過程增加了其免疫原性，可能是輻照、培養(yǎng)方式、佐劑的選擇或者其結(jié)合使然。這方面需要后續(xù)進(jìn)行相關(guān)單因素和條件篩選實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。不過，可以肯定的是，在所有條件不變的情況下，將佐劑替換為在腫瘤干細(xì)胞疫苗中常用的甘露聚糖或者甘露聚糖肽確實(shí)不能獲得滿意的效果。步驟（2）中，輻照劑量為3Gy。雖然該劑量并不能進(jìn)一步穩(wěn)定的增加CD133陽性干細(xì)胞的比例，但出于保守考慮，取本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的輻照劑量的最低值，可能是一種合理的選擇。步驟（3）中，細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。步驟（3）中，所述的滅活為：對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行多次凍融處理。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述方法制備得到的疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述疫苗在制備治療肺癌藥物方面的用途。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所得疫苗對(duì)于肺癌具有顯著的療效，可顯著的增強(qiáng)免疫能力，并控制腫瘤的生長(zhǎng)。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述
發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例（1）將復(fù)蘇后的肺癌干細(xì)胞于DMEM全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DMEM全培養(yǎng)基中含8%的FBS，培養(yǎng)溫度為37℃，濕度為85%，CO2的濃度為0.5%，培養(yǎng)3-4天，之后對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行1:3的分盤，再用同樣的培養(yǎng)基在同樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天，細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘體或近似紡錘體；（2）對(duì)步驟（1）所得物利用60Co進(jìn)行輻照處理，劑量為3Gy；（3）選取CD133陽性干細(xì)胞，培養(yǎng)后進(jìn)行多次凍融處理，將其滅活，然后利用生理鹽水重懸干細(xì)胞，使得細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml；（4）按照體積比4:1.5:2的比例，將步驟（3）所得物、殼聚糖生理鹽水溶液和昆布多糖生理鹽水溶液混合，混合后，殼聚糖濃度為2%，昆布多糖的濃度為2.5%。對(duì)比實(shí)施例除佐劑為甘露聚糖肽和脂肪乳之外，其余與實(shí)施例一致。實(shí)驗(yàn)例對(duì)植入肺癌腫瘤的10只昆明鼠注射實(shí)施例所得疫苗作為實(shí)驗(yàn)組1，另取10只昆明鼠注射對(duì)比實(shí)施例所得物作為實(shí)驗(yàn)組2，另取10只昆明鼠注射生理鹽水作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的注射量均為200ul,15天后進(jìn)行外周淋巴細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞功能和腫瘤體積檢測(cè)。結(jié)果如表1、表2和表3所示。表1注：*P＜0.01表2實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2對(duì)照組IFN-γ（pg/ml）1.69±0.110.81±0.130.74±0.20TNF（pg/ml）1.57±0.260.76±0.150.69±0.12IL-4（pg/ml）2.95±0.112.01±0.151.88±0.24注：*P＜0.01表3實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2對(duì)照組腫瘤體積變化（%）-30±2+15±3+80±5注：“+”表示腫瘤體積增加，“-”表示腫瘤體積減少，*P＜0.01。當(dāng)前第1頁1 2 3