本發(fā)明涉及中醫(yī)藥和保健食品
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及青錢柳葉或其提取物的新用途和中藥組合物。
背景技術(shù)：
：中醫(yī)體質(zhì)是基于中醫(yī)藥理論，對機(jī)體形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和心理特點，及疾病傾向性和反應(yīng)性等固有的、相對穩(wěn)定特性的科學(xué)概括。中華中醫(yī)藥學(xué)會2009年發(fā)布的《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》標(biāo)準(zhǔn)為“治未病”提供了體質(zhì)辨識的方法、工具與評估體系，使調(diào)理中醫(yī)體質(zhì)、提高國民健康素質(zhì)成為中醫(yī)養(yǎng)生保健和基層公共衛(wèi)生體系的重要組成部分。改善體質(zhì)是中醫(yī)治未病的重要方法與途徑?；诳茖W(xué)、規(guī)范的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，研究開發(fā)體質(zhì)干預(yù)和體質(zhì)改善的藥食同源、安全有效的產(chǎn)品代表著中醫(yī)藥科技創(chuàng)新的新方向和新趨勢。《素問·調(diào)經(jīng)論》：“陰虛則內(nèi)熱”，最早提出陰虛體質(zhì)的人容易出現(xiàn)內(nèi)熱；所謂內(nèi)熱，指手足心熱，口干咽燥，心煩，易饑等表現(xiàn)。元代朱震亨《格致余論》：“瘦人火多?！敝赋?，體質(zhì)瘦削之人容易出現(xiàn)陰虛內(nèi)熱的情況?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，陰虛體質(zhì)具有以下顯著體質(zhì)特征：體形瘦長、視物花、手足心熱、失眠心煩、五心煩熱、耳鳴耳聾、喜冷飲而不解渴、大便干燥、舌紅少苔、脈象細(xì)弦而數(shù)。國內(nèi)學(xué)者運(yùn)用中醫(yī)體質(zhì)分類方法和判定標(biāo)準(zhǔn)做了大量體質(zhì)與疾病相關(guān)性的流行病學(xué)調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)，陰虛體質(zhì)人群存在以下發(fā)病傾向：季節(jié)性過敏性鼻炎、小兒呼吸道感染、慢性阻塞性肺病、高血壓、缺血性腦卒中、血管性癡呆、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、圍絕經(jīng)期綜合征、糖調(diào)節(jié)受損、女性不孕癥、少弱精癥、帕金森病、腰椎間盤突出、慢性腎功能不全、慢性葡萄膜炎等。陰虛體質(zhì)的調(diào)體原則是滋補(bǔ)腎陰、壯水制火、養(yǎng)陰清熱、養(yǎng)血護(hù)津；代表方劑是六味地黃丸、知柏地黃丸、大補(bǔ)陰丸。青錢柳，Cyclocaryapaliurus(Batal.)ljinskaja，又名青錢李、搖錢樹、甜茶樹等，系胡桃科青錢柳屬植物特有單種屬，為我國所特有，屬瀕危樹種。青錢柳是一種高大速生闊葉喬木，因其樹形似柳，果實圓形似銅錢，色青而下垂，故名“青錢柳”。據(jù)《中國中藥資源志要》記載，其樹皮、葉具有清熱消腫、止痛的功能，可用于治療頑癬。長期以來，民間用其葉片做茶，因其味甜且具有清熱解暑、降血糖、降血壓和延年益壽的作用。青錢柳為我國特有的降糖藥用植物資源，近年來的青錢柳研究也多集中在降糖藥理、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等方面。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉含多種活性成分，如具有降糖和增加糖耐量的多糖，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用的黃酮類、酚酸類和三萜類化合物。此外，中國專利CN201210271132.9公開了“一種祛痰止咳組合物及其制備方法”，CN201310462576.5公開了“一種青錢柳提取物在制備預(yù)防和治療白血病藥物中的應(yīng)用”，拓寬了青錢柳的醫(yī)藥應(yīng)用范圍。然而，作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥的藥食同源資源，有關(guān)青錢柳的中藥藥性、主治功效的研究相對缺如，對于其在體質(zhì)調(diào)節(jié)的“治未病”領(lǐng)域的研究未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了青錢柳葉或其提取物的新用途和中藥組合物。本研究發(fā)現(xiàn)青錢柳葉及其提取物可用于調(diào)理陰虛體質(zhì)人群的體質(zhì)及治療未病。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了青錢柳葉及其提取物在制備調(diào)理陰虛體質(zhì)的保健食品或治療未病的藥物中的應(yīng)用。目前缺少青錢柳相關(guān)體質(zhì)改善的研究和專利，而體質(zhì)改善不同于治療疾病和證候，需要相對長期的服用，因此對于食品安全性提出更高的要求。本發(fā)明從一般毒理學(xué)研究提供了青錢柳水提物的安全性證據(jù)，并進(jìn)行了中醫(yī)實驗與臨床研究，顯示其具有清熱養(yǎng)陰功效，證明它對陰虛體質(zhì)具有明顯的改善、調(diào)節(jié)作用。而且青錢柳水提物的這種新特性為陰虛體質(zhì)人群的體質(zhì)調(diào)理提供了新的產(chǎn)品選擇。在本發(fā)明中，陰虛體質(zhì)的體質(zhì)特征為體形瘦長、視物花、手足心熱、失眠心煩、五心煩熱、耳鳴耳聾、喜冷飲而不解渴、大便干燥、舌紅少苔或脈象細(xì)弦而數(shù)中的一種或幾種。作為優(yōu)選，青錢柳葉提取物為青錢柳葉水提物。作為優(yōu)選，青錢柳葉水提物的制備方法為：取青錢柳葉，加入10～20倍重量的水，煎煮1～3h，過濾；取濾渣，加入10～20倍重量的水，煎煮1～3h，過濾，合并濾液；經(jīng)濃縮、干燥，得到青錢柳葉水提物。在本發(fā)明提供的實施例中，青錢柳葉水提物的制備方法為：取青錢柳葉，加入20倍重量的水，煎煮2h，過濾；取濾渣，加入20倍重量的水，煎煮2h，過濾，合并濾液；經(jīng)濃縮、干燥，得到青錢柳葉水提物。本發(fā)明制得的青錢柳葉水提物中多糖含量為0.34％～1％，總黃酮含量為2.23％～3％，總?cè)萍霸碥蘸繛?.37％～2％。作為優(yōu)選，濃縮為濃縮至每100mL濃縮液含有50～150g青錢柳葉生藥量。在本發(fā)明提供的實施例中，濃縮為濃縮至每100mL濃縮液含有100g青錢柳葉生藥量。本發(fā)明還提供了一種中藥組合物，以重量份計，由如下原料藥制成：青錢柳葉2～3份，石斛1～2份，桑白皮1～2份，陳皮1～2份。在本發(fā)明提供的實施例中，以重量份計，該中藥組合物由如下原料藥制成：青錢柳葉3份，石斛2份，桑白皮2份，陳皮2份。本發(fā)明還提供了該中藥組合物在制備調(diào)理陰虛體質(zhì)人群的體質(zhì)的保健食品或治療未病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了該中藥組合物的制備方法，包括：取配方量的青錢柳葉、石斛、桑白皮和陳皮，混合，加入相當(dāng)于原料藥8～10倍重量的水，煎煮1～3h，過濾；取濾渣，加入8～10倍重量的水，煎煮1～3h，過濾，合并濾液；經(jīng)濃縮，得到中藥組合物。在本發(fā)明提供的實施例中，該中藥組合物的制備方法包括：取配方量的青錢柳葉、石斛、桑白皮和陳皮，混合，加入相當(dāng)于原料藥20倍重量的水，煎煮2h，過濾；取濾渣，加入20倍重量的水，煎煮2h，過濾，合并濾液；經(jīng)濃縮，得到中藥組合物。作為優(yōu)選，濃縮為濃縮至每500mL濃縮液含有50～150g青錢柳葉生藥量。在本發(fā)明提供的實施例中，濃縮為濃縮至每500mL濃縮液含有100g青錢柳葉生藥量。本發(fā)明還提供了一種中藥制劑，包括本發(fā)明提供的中藥組合物和藥學(xué)上可接受的輔料。以重量份計，該中藥組合物由如下原料藥制成：青錢柳葉2～3份，石斛1～2份，桑白皮1～2份，陳皮1～2份。本發(fā)明還提供了一種保健食品，包括本發(fā)明提供的中藥組合物和食品學(xué)上可接受的輔料。以重量份計，該中藥組合物由如下原料藥制成：青錢柳葉2～3份，石斛1～2份，桑白皮1～2份，陳皮1～2份。本發(fā)明提供了青錢柳葉或其提取物的新用途和中藥組合物。本發(fā)明具有的技術(shù)效果為：本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)青錢柳葉及其提取物可用于調(diào)理陰虛體質(zhì)或治療未病。本發(fā)明從一般毒理學(xué)研究提供了青錢柳水提物的安全性證據(jù)，并進(jìn)行了中醫(yī)實驗與臨床研究，顯示其具有清熱養(yǎng)陰功效，證明它對陰虛體質(zhì)具有明顯的改善、調(diào)節(jié)作用。而且青錢柳水提物的這種新特性為陰虛體質(zhì)人群的體質(zhì)調(diào)理提供了新的產(chǎn)品選擇。試驗結(jié)果顯示：青錢柳復(fù)方水提物(本發(fā)明中藥組合物)和青錢柳葉水提物灌胃給予4周后，均可明顯減少動物的攝食量、飲水量和尿量；青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能改善受試動物的陰虛表征評分，如背部溫度上升、舌色鮮紅、活動次數(shù)明顯增加、爪色青紫及眼睛神采異常等項目均有明顯的改善；青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物降低空腹血糖(FBG)，改善糖耐量(OGTT)，升高肝糖原，降低胰島素含量，升高胰島素敏感指數(shù)(ISI)，降低胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，改善胰島素抵抗；與模型組相比，青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物模型對大鼠脂代謝指標(biāo)的影響無顯著性差異；與模型組相比，青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能顯著降低模型大鼠cAMP水平，作用與知柏地黃丸和二甲雙胍相似；青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能夠顯著降低模型大鼠異常升高的CD4+/CD8+比例，提示青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，使之趨向恢復(fù)至正常水平。試驗結(jié)果顯示，青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能改善陰虛內(nèi)熱型大鼠模型的陰虛評分，具有養(yǎng)陰清熱的功效；能調(diào)節(jié)紊亂的細(xì)胞免疫功能，改善虛證狀態(tài)；具有降糖、改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的作用。具體實施方式本發(fā)明公開了青錢柳葉或其提取物的新用途和中藥組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的青錢柳葉或其提取物的新用途和中藥組合物中所用原料藥或輔料均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實施例1：青錢柳葉水提物的制備方法稱取青錢柳葉適量，加入20倍水，煎煮2h，過濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，再次煎煮1h，過濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g青錢柳生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得青錢柳葉水提物。所得青錢柳葉水提物中，其粗多糖含量為0.34％，總黃酮含量為2.23％，總?cè)萍霸碥蘸繛?.37％。實施例2：青錢柳復(fù)方水煎液的制備方法按照重量份分別為30份、20份、20份、20份，分別稱取適量青錢柳葉、石斛、桑白皮和陳皮，混合，加入10倍水，煎煮2h，過濾，收集濾液，濾渣加入10倍水，再次煎煮1h，過濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每500mL青錢柳復(fù)方水煎液中含有100g青錢柳生藥量，即得青錢柳復(fù)方水煎液。實施例3：青錢柳復(fù)方水煎液的制備方法按照重量份分別為20份、15份、20份、10份，分別稱取適量青錢柳葉、石斛、桑白皮和陳皮，混合，加入10倍水，煎煮2h，過濾，收集濾液，濾渣加入10倍水，再次煎煮1h，過濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每500mL青錢柳復(fù)方水煎液中含有100g青錢柳生藥量，即得青錢柳復(fù)方水煎液。實施例4：青錢柳復(fù)方水煎液的制備方法按照重量份分別為25份、20份、10份、15份，分別稱取適量青錢柳葉、石斛、桑白皮和陳皮，混合，加入10倍水，煎煮2h，過濾，收集濾液，濾渣加入10倍水，再次煎煮1h，過濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每500mL青錢柳復(fù)方水煎液中含有100g青錢柳生藥量，即得青錢柳復(fù)方水煎液。實施例5：青錢柳復(fù)方水煎液的制備方法按照重量份分別為30份、10份、15份、20份，分別稱取適量青錢柳葉、石斛、桑白皮和陳皮，混合，加入10倍水，煎煮2h，過濾，收集濾液，濾渣加入10倍水，再次煎煮1h，過濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每500mL青錢柳復(fù)方水煎液中含有100g青錢柳生藥量，即得青錢柳復(fù)方水煎液。實施例6：青錢柳葉水提物及青錢柳復(fù)方水提物對陰虛內(nèi)熱大鼠模型的干預(yù)研究1.材料：1.1供試藥物及劑量設(shè)置知柏地黃丸(0.3g/mL)，批號14030755，北京同仁堂；鹽酸二甲雙胍片(25mg/mL)，批號1501055，深圳市中聯(lián)制藥有限公司。青錢柳葉水提物(按實施例1方法制得，168，84，42mg/mL高中低劑量)，批號20151009；青錢柳復(fù)方水提物(按實施例2方法制得，進(jìn)一步干燥粉碎成粉末，按照26.4，13.2，6.6mg/mL劑量配置成高中低劑量)，批號20151009。1.2主要試劑及儀器鏈脲佐菌素(STZ)，批號150101，TOKU-ECOMPANY；左旋甲狀腺素(優(yōu)甲樂)，批號191113，德國默克公司。血糖儀/活力型，ACCU-CHEKACTIVE，羅氏診斷(型號：GC1492692)；非接觸式紅外線體溫計，深圳市宏旺達(dá)電子(型號：DM300)；電子分析天平，METTLERTOLEDO(型號：EL204)。1.3實驗動物及飼料SD大鼠，雌雄各半，動物購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號：SCXK(粵)2013-0034。正常組給予以普通飼料，其他動物予以高脂飼料。高脂飼料由豬油、蛋黃粉、糖、基礎(chǔ)維持飼料等組成，由北京科澳協(xié)力有限公司提供，許可證號為：SCXK(京)2014-0010。2.方法2.1造模方法與分組采用高脂飼料+甲狀腺素+STZ方法飼養(yǎng)SD大鼠，復(fù)制陰虛內(nèi)熱型大鼠模型。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)。第3周，除正常對照組外，每組動物均皮下注射甲狀腺素(T4)0.2mg/kg/d，連續(xù)1周。第4周，1次性腹腔注射STZ溶液35mg/kg；正常對照組腹腔注射同等劑量0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ后第7天，動物禁食測空腹血糖(FBG)，根據(jù)陰虛表征評分評判陰虛內(nèi)熱型大鼠造模是否成功。將造模成功的動物隨機(jī)分為模型對照組，陽性對照組(知柏地黃丸、二甲雙胍)，青錢柳復(fù)方水提物高、中、低劑量、青錢柳葉水提物高、中、低劑量。2.2觀察指標(biāo)灌胃給予樣品4周，觀察指標(biāo)有：(1)一般狀況：體重、攝食量、飲水量、尿量；(2)中醫(yī)陰虛證候評分：陰虛證候評分表包括觀察大鼠活動次數(shù)，背部溫度，舌色鮮紅，爪甲青紫，大便干硬、眼睛神采等表征項目，其中表征比率為該表征占總數(shù)的比率；(3)血清糖代謝相關(guān)指標(biāo)：空腹血糖(FBG)、口服糖耐量(OGTT)、糖化血紅蛋白(GHb)、胰島素、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)；(4)血清脂代謝相關(guān)指標(biāo)：膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、游離脂肪酸(FFA)；(5)甲狀腺功能指標(biāo)：T3、T4、cAMP、cGMP水平；(6)細(xì)胞免疫功能指標(biāo)：淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4和CD8水平。2.3統(tǒng)計方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差檢驗和最小顯著性差異法(LSD)，P<0.05為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。陰虛內(nèi)熱證候評分表中，各表征比率為該表征占總數(shù)的比率，計數(shù)資料數(shù)據(jù)以率表示，釆用檢驗χ2檢驗，以P<0.05為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。3.結(jié)果3.1陰虛內(nèi)熱模型大鼠的特征與正常組相比，模型組動物體重明顯減輕，攝食量、飲水量和尿量均明顯增加；血糖明顯升高，糖耐量異常，肝糖原明顯降低；胰島素含量明顯升高，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯降低，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)明顯升高，表現(xiàn)為明顯的胰島素抵抗。模型組動物T3及cGMP水平明顯升高；CD3+淋巴細(xì)胞亞群水平下降，CD4+/CD8+比例異常升高，提示細(xì)胞免疫功能紊亂。模型組動物出現(xiàn)明顯的陰虛表征，包括背部溫度上升、舌色鮮紅、活動次數(shù)明顯增加、爪色青紫及眼睛神采異常等。這些結(jié)果表明高脂飼料+甲狀腺素+STZ方法成功復(fù)制陰虛內(nèi)熱型模型。3.2青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱模型大鼠的影響3.2.1對陰虛內(nèi)熱大鼠體重、攝食量、飲水量和尿量的影響受試樣品青錢柳復(fù)方水提物(Q)和青錢柳葉水提物(LY)灌胃給藥，劑量為10ml/Kg，每天給藥一次，4周后，均可明顯減少動物的攝食量、飲水量和尿量。參見表1～4。表1樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠體重的影響(n＝8)(g)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表2樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠飲水量的影響(n＝8)(mL)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表3樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠攝食的影響(n＝8)(g)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表4樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠尿量的影響(n＝8)(mL)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。3.2.2青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱模型大鼠癥狀表征評分的影響青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能改善受試動物的陰虛表征評分，如背部溫度上升、舌色鮮紅、活動次數(shù)明顯增加、爪色青紫及眼睛神采異常等項目均有明顯的改善。參見表5。表5青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物對模型大鼠陰虛內(nèi)熱癥狀表征評分注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。3.2.3青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱大鼠糖代謝的影響青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物降低空腹血糖(FBG)，改善糖耐量(OGTT)，升高肝糖原，降低胰島素含量，升高胰島素敏感指數(shù)(ISI)，降低胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，改善胰島素抵抗。參見表6～8。表6樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠血糖的影響(n＝8)(mmol/L)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表7樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠糖化血紅蛋白，肝糖原，胰島素的影響(n＝8)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表8樣品對糖尿病大鼠胰島素及其相關(guān)指標(biāo)的影響(n＝8)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。3.2.4青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱大鼠脂代謝的影響與模型組相比，青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物模型對大鼠脂代謝指標(biāo)的影響無顯著性差異。參見表9。表9樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠脂代謝的影響(n＝8)(mmol/L)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。3.2.5青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物對陰虛內(nèi)熱大鼠微觀指標(biāo)的改善與模型組相比，青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能顯著降低模型大鼠cAMP水平，作用與知柏地黃丸和二甲雙胍相似。參見表10：表10樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠T3.T4.cAMP.cGMP的影響(n＝8)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能夠顯著降低模型大鼠異常升高的CD4+/CD8+比例，提示青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，使之趨向恢復(fù)至正常水平。參見表11：表11樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠免疫功能的影響(n＝8)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。4.結(jié)論：青錢柳復(fù)方和青錢柳葉水提物能改善陰虛內(nèi)熱型大鼠模型的陰虛評分，具有養(yǎng)陰清熱的功效；能調(diào)節(jié)紊亂的細(xì)胞免疫功能，改善虛證狀態(tài)；具有降糖、改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的作用。實施例7：青錢柳復(fù)方的急性毒性試驗1.目的：觀察青錢柳復(fù)方可能引起毒性反應(yīng)的性質(zhì)、程度及可逆性；推測毒性靶器官或靶組織。2.材料：2.1供試藥物與試劑：青錢柳復(fù)方水提物(按實施例2方法制得，進(jìn)一步干燥粉碎成粉末，按照0.554g/mL濃度配置成供試藥液)，由無限極(中國)有限公司提供。2.2實驗動物：SD大鼠，SPF級，5-6周齡，雌雄各30只，來源：廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0002；飼養(yǎng)環(huán)境：香港理工大學(xué)深圳研究院(SZRI)SPF級動物房。2.3實驗分組：預(yù)實驗只設(shè)計給藥組，預(yù)實驗給藥觀察4天后再進(jìn)行正式試驗，6只動物。正式試驗分正常對照組和青錢柳復(fù)方給藥組，每組12只。3.方法：3.1劑量與給藥：在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，實驗設(shè)計為2組：正常對照組和青錢柳復(fù)方給藥組。以干粉0.554g/mL的濃度按照最大給藥體積20mL/kg經(jīng)口灌胃給予青錢柳復(fù)方，24h內(nèi)給藥2次，兩次間隔6h，即累計劑量為干粉22.15g/kg。正常對照組，經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)體積的0.9％無菌生理鹽水注射液。3.2觀察指標(biāo)：按GLP安全性評價規(guī)范，觀察大鼠外觀體征、一般行為活動、精神狀態(tài)、呼吸狀態(tài)、糞便性狀、生殖器、死亡等情況及其它毒性表現(xiàn)。并定期測定體重和攝食量，以及血液學(xué)、生化指標(biāo)(包括血分析、肝功能、腎功能、血糖、血脂、離子等)，尿液分析，組織病理學(xué)等項目。3.3統(tǒng)計分析方法：體重、攝食量、血液學(xué)、血生化、尿常規(guī)等定量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。尿常規(guī)等級資料直接列出原始數(shù)據(jù)，該組數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計分析。采用Student-ttests檢驗分別對兩組SD大鼠定量指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計比較分析，P≤0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗α＝0.05。所有的統(tǒng)計分析，均在GraphpadPrism5.0軟件下完成。4.結(jié)果：4.1一般狀況：14天觀察期內(nèi)未見大鼠死亡，所有大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)有光澤，行為、運(yùn)動能力正常，呼吸均勻平穩(wěn)，生殖器周圍無分泌物出現(xiàn)，大便性狀顏色均正常，未見其它毒性癥狀出現(xiàn)。4.2體重：給藥后14天觀察期內(nèi)，除試驗第2天雌性大鼠青錢柳復(fù)方給藥組體重與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義外(P<0.05)，其余各時間點體重與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雄性大鼠青錢柳復(fù)方給藥組體重于試驗第2天至第7天較正常組降低，于第7天與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨后雄性大鼠青錢柳復(fù)方給藥組體重上升，于第13天和15天與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見表12。表12經(jīng)口灌胃給予青錢柳復(fù)方對SD大鼠體重的影響(g)備注:與正常對照組比較，#P<0.05。4.3攝食量：給藥后14天觀察期內(nèi)，雌性及雄性青錢柳復(fù)方給藥組攝食量于給藥后第2天有所減少，其中雌性青錢柳復(fù)方給藥組攝食量與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外，青錢柳復(fù)方給藥組大鼠其余各時間點攝食量與對照組相比未見顯著差異。具體結(jié)果見表13。表13經(jīng)口灌胃給予青錢柳復(fù)方對SD大鼠攝食量的影響(g/只/天)備注：與正常對照組比較，##P<0.01。4.4血液學(xué)檢測：14天觀察結(jié)束顯示，青錢柳復(fù)方給藥組大鼠白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板計數(shù)(PLT)、淋巴細(xì)胞比值(LY)、單核細(xì)胞比例(MONO)、中性粒細(xì)胞比例(NEUT)、淋巴細(xì)胞計數(shù)(LY)、單核細(xì)胞計數(shù)(MONO)、中性粒細(xì)胞計數(shù)(NEUT)與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義。具體結(jié)果見表14。表14經(jīng)口灌胃給予青錢柳復(fù)方對SD大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響備注:與正常對照組比較，*P<0.05。4.5血生化檢測:14天觀察結(jié)束，青錢柳復(fù)方給藥組大鼠血清樣品中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、總膽紅素(TBIL)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、血鉀、血鈉、血總鈣、血氯、磷(K+、Na+、Ca2+、Cl-、PO43-)及肌酸激酶(CK)與對照組相比，除尿素氮(Urea)、甘油三酯(TG)與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義外(P<0.05)，其余指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義。參見表15：表15經(jīng)口灌胃給予青錢柳復(fù)方對SD大鼠血液生化指標(biāo)的影響備注:與正常對照組比較，*P<0.05。4.6尿常規(guī)檢測:14天觀察結(jié)束，青錢柳復(fù)方給藥組大鼠尿比重(SG)與PH與對照組相比均未見異常改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其余指標(biāo)如葡萄糖、尿蛋原、尿蛋白、白細(xì)胞、膽紅素、酮體、比重、隱血、pH、亞硝酸鹽檢測結(jié)果均呈陰性。具體結(jié)果見表16。表16經(jīng)口灌胃給予青錢柳復(fù)方對SD大鼠尿常規(guī)指標(biāo)的影響4.7大體解剖觀察:給藥后14天觀察期結(jié)束，各組大鼠大體解剖觀察，心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃腸道、生殖系統(tǒng)等臟器或組織的顏色、形態(tài)、質(zhì)地、大小正常，均未見異常改變。5.結(jié)論：SD大鼠24小時內(nèi)累計灌胃給予干粉22.15g/kg的青錢柳復(fù)方，大鼠未見死亡，一般狀況良好。14天觀察期結(jié)束，大鼠血液學(xué)、血生化、尿常規(guī)及大體解剖均未見異常。SD大鼠經(jīng)口灌胃給予青錢柳復(fù)方的最大耐受劑量(MTD)大于等于干粉22.15g/kg。實施例8：青錢柳復(fù)方改善陰虛體質(zhì)的作用研究1.受試人群及試食品1.1受試人群：60名陰虛體質(zhì)志愿者，簽署知情同意書，通過人體功效試驗，觀測青錢柳復(fù)方對陰虛體質(zhì)人群的療效。1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡需在30歲以上及65歲以下；根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)ZYYXH/T157-2009-中醫(yī)體質(zhì)分類與判定符合陰虛質(zhì)判定標(biāo)準(zhǔn)的志愿者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡在30歲以下或65歲以上者；(2)妊娠其婦女或哺乳期婦女；(3)有嚴(yán)重其他臟器并發(fā)癥者，或合并有其他嚴(yán)重的原發(fā)性疾病或精神疾患者；(4)近一月內(nèi)有糖尿病酮癥酸中毒等急性代謝紊亂病史或合并感染病史者。1.3試食品：青錢柳復(fù)方水煎液，由無限極(中國)有限公司提供。六味地黃丸(濃縮丸)，九芝堂股份有限公司出品。2.方法：2.1隨機(jī)分組與試食方法陰虛體質(zhì)志愿者按分層隨機(jī)法分為2組，即青錢柳組和六味地黃丸組，每組各30人。青錢柳組：每天服用青錢柳復(fù)方水煎液(實施例2制得的水煎液)，飲服，一次1袋(50mL)，一日2次。六味地黃丸組：六味地黃丸(河南省宛西制藥股份有限公司，批號:150309)，口服，一次8丸，一日3次。服用時間，均為連續(xù)8周。2.2觀測指標(biāo)及評價方法2.1癥狀積分根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)ZYYXH/T157-2009-中醫(yī)體質(zhì)分類與判定，按判定標(biāo)準(zhǔn)積分，于試食前后統(tǒng)計臨床癥狀積分值。臨床癥狀積分表見表17：表17臨床癥狀積分表2.2評價方法根據(jù)試食前后積分的變化進(jìn)行判定，判定依據(jù)：由轉(zhuǎn)化分≥40分改善到轉(zhuǎn)化分30～39分，視為顯效；由轉(zhuǎn)化分≥40分改善到轉(zhuǎn)化分＜30分視為有效。2.3統(tǒng)計學(xué)分析樣本率的比較和構(gòu)成比采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。3.結(jié)果3.1一般資料：本研究納入60例陰虛體質(zhì)志愿者，其中男性26人，女性34人。中途退出3例，脫落4例，獲得完整資料者53例，其中六味地黃丸組27人，青錢柳組26人。3.2臨床癥狀積分的影響通過對比兩組志愿者服用青錢柳復(fù)方水煎液和六味地黃丸前后的臨床癥狀積分的變化，結(jié)果顯示，六味地黃丸組積分改善的有效率、顯效率分別為25.9％、55.6％，青錢柳組積分改善的有效率、顯效率分別為30.8％、53.8％，經(jīng)χ2檢驗，P>0.05,兩組之間有效率、顯效率、構(gòu)成比均無顯著性差異。參見表18：表18青錢柳復(fù)方水煎液對陰虛體質(zhì)志愿者臨床癥狀積分的影響注：經(jīng)χ2檢驗，P>0.05,兩組之間有效率等均無顯著性差異。4.結(jié)論結(jié)果提示，青錢柳復(fù)方水煎液在改善陰虛體質(zhì)志愿者臨床癥狀積分方面具有一定效果，且與六味地黃丸組相比具有等效性。實施例9：青錢柳復(fù)方水提物對陰虛內(nèi)熱大鼠模型的干預(yù)研究1.材料：1.1供試藥物及劑量設(shè)置青錢柳復(fù)方水提物按實施例2～5方法制得，進(jìn)一步干燥粉碎成干粉，按照濃度為6.6mg/mL進(jìn)行配置，制得青錢柳復(fù)方水提物水溶液。青錢柳水提物、石斛水提物、桑白皮水提物、陳皮水提物分別按照如下方法提?。悍謩e稱取上述藥材適量，加入20倍水，煎煮2h，過濾，收集濾液，濾渣加入20倍水，再次煎煮1h，過濾，合并2次濾液；濃縮濾液至每100mL含有100g生藥量，冷凍干燥或者70℃烘干，粉碎即得青錢柳水提物粉末、石斛水提物粉末、桑白皮水提物粉末、陳皮水提物粉末。將青錢柳水提物粉末、石斛水提物粉末、桑白皮水提物粉末、陳皮水提物粉末分別溶于水，制得6.6mg/mL的青錢柳水提物水溶液，石斛水提物水溶液、桑白皮水提物水溶液、陳皮水提物水溶液。1.2主要試劑及儀器同實施例6。1.3實驗動物及飼料同實施例6。2.方法2.1造模方法與分組造模方法同實施例6。將造模成功的動物隨機(jī)分為：實施例2青錢柳復(fù)方水提物組、實施例3青錢柳復(fù)方水提物組、實施例4青錢柳復(fù)方水提物組、實施例5青錢柳復(fù)方水提物組、青錢柳葉水提物組、石斛水提物組、桑白皮水提物組、陳皮水提物組。給藥方式同實施例6。2.2觀察指標(biāo)同實施例6。2.3統(tǒng)計方法同實施例6。3.結(jié)果3.1青錢柳復(fù)方對陰虛內(nèi)熱模型大鼠的影響3.1.1對陰虛內(nèi)熱大鼠體重、攝食量、飲水量和尿量的影響受試樣品實施例2-5青錢柳復(fù)方水提物灌胃給予4周后，均可明顯減少動物的攝食量、飲水量和尿量，效果顯著好于各單劑組。參見表19～22。表19樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠體重的影響(n＝8)(g)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表20樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠飲水量的影響(n＝8)(mL)組別給藥前第一周第二周第三周第四周正常組28.5±11.831.4±16.841.5±14.740.2±12.935.1±11.9模型組99.6±42.7ΔΔ89.9±27.5ΔΔ92.4±41.5ΔΔ49.8±18.493.7±34.9ΔΔ實施例250.8±21.8**45.9±14.1**47.2±21.2**25.4±9.4*47.8±17.8**實施例358.9±25.3*53.2±16.3*54.7±24.5*29.5±10.9*55.4±20.6*實施例461.0±26.2*55.0±16.9*56.6±25.4*30.5±11.3*57.4±21.4*實施例552.8±22.7**47.7±14.6*49.0±22.0**26.4±9.8*49.7±18.5**青錢柳水提物66.0±28.3*59.6±18.3*61.3±27.5*33.0±12.2*62.1±23.1*石斛水提物64.0±27.5*57.8±17.7*59.4±26.6*32.0±11.8*60.2±22.4*桑白皮水提物71.1±30.564.2±19.766.0±29.635.6±13.266.9±24.9陳皮水提物73.2±31.466.0±20.267.9±30.536.6±13.568.8±25.6注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表21樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠攝食的影響(n＝8)(g)組別給藥前第一周第二周第三周第四周正常組29.6±11.726.8±15.442.4±6.636.8±12.633.2±10.7模型組21.7±5.741.1±9.3Δ45.7±8.946.3±8.054.9±4.7ΔΔ實施例219.5±5.331.6±18.2*50.0±7.843.4±14.939.2±12.6*實施例319.5±5.330.8±17.7*48.8±7.642.3±14.538.2±12.3*實施例419.5±5.431.1±17.9*49.2±7.742.7±14.638.5±12.4*實施例519.5±5.429.2±16.8*46.2±7.240.1±13.736.2±11.7*青錢柳水提物20.6±5.434.8±20.055.1±8.647.8±16.443.2±13.9石斛水提物20.6±5.134.6±19.954.7±8.547.5±16.342.8±13.8桑白皮水提物20.6±5.136.2±20.857.2±8.949.7±17.044.8±14.4陳皮水提物20.6±5.137.5±21.659.4±9.251.5±17.646.5±15.0注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。表22樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠尿量的影響(n＝8)(mL)組別給藥前第一周第二周第三周第四周正常組10.9±3.610.6±4.910.3±4.39.6±5.29.8±4.3模型組105.6±29.2ΔΔ90.0±29.9ΔΔ95.7±35.3ΔΔ90.2±36.3ΔΔ99.0±38.1ΔΔ實施例252.8±14.6**45.0±14.9**47.9±17.6**45.1±18.1**49.5±19.1**實施例361.3±16.9*52.2±17.3*55.5±20.5*52.3±21.0*57.4±22.1*實施例463.4±17.5*54.0±17.9*57.4±21.2*54.1±21.8*59.4±22.9*實施例554.9±15.2**46.8±15.5**49.8±18.3**46.9±18.9**51.5±19.8**青錢柳水提物68.7±19.0*58.5±19.4*62.2±22.9*58.6±23.6*64.3±24.8*石斛水提物66.6±18.4*56.7±18.8*60.3±22.2*56.8±22.8*62.4±24.0*桑白皮水提物74.0±20.463.0±20.967.0±24.763.1±25.469.3±26.7陳皮水提物76.1±21.064.8±21.568.9±25.464.9±26.171.3±27.4注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。3.1.2青錢柳復(fù)方對陰虛內(nèi)熱模型大鼠癥狀表征評分的影響實施例2-5青錢柳復(fù)方能不同程度地改善受試動物的陰虛表征評分，如背部溫度上升、舌色鮮紅、活動次數(shù)明顯增加、爪色青紫及眼睛神采異常等項目均有明顯的改善，效果好于各單劑組。參見表23。表23青錢柳復(fù)方對模型大鼠陰虛內(nèi)熱癥狀表征評分注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。3.1.3青錢柳復(fù)方對陰虛內(nèi)熱大鼠微觀指標(biāo)的改善與模型組相比，實施例2-5青錢柳復(fù)方水提物均能顯著降低模型大鼠T3、cGMP水平，并能顯著升高cAMP/cGMP比例。并且，各實施例與單味藥比較，實施例2-5青錢柳復(fù)方水提物在改善T3、cGMP水平以及cAMP/cGMP比例方面表現(xiàn)出優(yōu)于各單味藥的趨勢。參見表24：表24樣品對陰虛內(nèi)熱大鼠T3.T4.cAMP.cGMP的影響(n＝8)注：與正常對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01.與模型對照組比較，*P<0.05**P<0.01。4.結(jié)論：實施例2-5青錢柳復(fù)方均能改善陰虛內(nèi)熱型大鼠模型的陰虛評分，具有養(yǎng)陰清熱的功效，效果優(yōu)于各單劑。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3