本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種從大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物中提取植物甾醇的方法。
背景技術(shù)：
：植物干細(xì)胞是所有植物細(xì)胞的起源，植物是由植物干細(xì)胞分裂形成的。植物干細(xì)胞技術(shù)被認(rèn)為是21世紀(jì)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
最具競爭力的技術(shù)之一。植物干細(xì)胞培養(yǎng)，是在傳統(tǒng)組培技術(shù)的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了現(xiàn)有方法，以植物干細(xì)胞為目標(biāo)，誘導(dǎo)、分離和培養(yǎng)外植體，建立相應(yīng)的干細(xì)胞培養(yǎng)體系。通過同步的植物干細(xì)胞培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)次生代謝物批量生產(chǎn)的穩(wěn)定性和目標(biāo)活性物質(zhì)的大量生產(chǎn)，為功能食品的研發(fā)提供大量的原材料。通過植物干細(xì)胞培養(yǎng)，不僅豐富了植物培養(yǎng)技術(shù)，而且為天然產(chǎn)物的商業(yè)化生產(chǎn)，乃至植物生物技術(shù)的發(fā)展，提供了新的研究方向和契機(jī)。植物甾醇是一種廣泛存在于植物根、莖、葉、果實(shí)和種子中的一種天然活性成分，尤其在大豆中含量較高。植物甾醇的種類繁多，目前，從植物中鑒定出了250多種植物甾醇，它們主要以游離態(tài)、甾醇酯(脂肪酸酯和酚酸酯)、甾基糖苷和?；藁擒盏刃问酱嬖?。不同的植物種類，其含量不同，植物油及其加工副產(chǎn)物是植物甾醇最豐富的自然來源。植物甾醇在結(jié)構(gòu)上與膽固醇相似，但是它比膽固醇更易形成膠束，可以降低膽固醇進(jìn)入血液中的幾率，從一定程度上限制外源膽固醇的攝入量，因此能夠抑制人體對(duì)膽固醇的吸收、促進(jìn)膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生化合成等作用。此外植物甾醇可用于預(yù)防治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化類的心臟病，對(duì)治療潰瘍、皮膚鱗癌、宮頸癌等有明顯的療效，植物甾醇還是重要的甾體藥物和維生素D3的生產(chǎn)原料。關(guān)于植物甾醇的提取方法有多種，其原理一般是基于原料組成、化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)及生化反應(yīng)等方面的差異，如利用皂化、中和、酶解、溶解度、蒸氣壓、吸附力的差異及在不同溫度、真空、表面活性劑下物理、化學(xué)性質(zhì)變化等以分離除去非甾醇類物質(zhì)。常見的提取方法有溶劑結(jié)晶法、絡(luò)合法、皂化法、蒸餾法(簡單蒸餾法、分子蒸餾法)、吸附法(柱吸附法、高壓流體吸附法)、超臨界CO2萃取法、酶法等。傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取方法不但需要耗費(fèi)大量溶劑，還牽涉到長時(shí)間較高溫度提取，影響產(chǎn)品質(zhì)量。目前，沒有關(guān)于從植物干細(xì)胞培養(yǎng)物中提取植物甾醇的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種從大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物中提取植物甾醇的方法。該方法以含有高含量植物甾醇的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物為原料，為植物甾醇的提取提供一種新途徑，同時(shí)結(jié)合亞臨界萃取技術(shù)，提供一種工藝操作簡單、安全性高、植物甾醇含量高的植物甾醇提取方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：一種從大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物中提取植物甾醇的方法，該方法包括：(1)將大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物凍干，粉碎過20～80目篩，送入亞臨界萃取器中，密閉萃取器，控制萃取器內(nèi)的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)打入液化的萃取溶劑進(jìn)行逆流萃?。?3)萃取結(jié)束后將萃取液打入蒸發(fā)罐，去除溶劑，得到萃取物粗品；(4)將萃取物粗品進(jìn)行結(jié)晶純化，得到植物甾醇。上述方法中，所述萃取溶劑優(yōu)選為正丁烷或丙烷。進(jìn)一步地，步驟(2)中，料液比為1∶(5～20)，萃取溫度35～70℃，萃取時(shí)間30～60min，萃取壓力0.1～1.0MPa，萃取次數(shù)2～4次。進(jìn)一步地，步驟(3)中，去除溶劑時(shí)溫度控制在20～65℃。進(jìn)一步地，結(jié)晶純化的步驟：取所述萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶(3～10)，用磁力攪拌器一邊加熱一邊攪拌，加熱溫度控制在35～50℃，待樣品完全溶解后停止加熱和攪拌，自然降溫結(jié)晶，降至室溫后維持1～3h，抽濾得到植物甾醇精品。在本發(fā)明的上述方法中，本發(fā)明所使用的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物是通過下述方法制備獲得的：(1)將大豆種子用乙醇溶液浸泡，無菌水沖洗后，再用次氯酸鈉溶液浸泡，然后無菌水沖洗，獲得無菌大豆；(2)取上述無菌大豆的下胚軸，將其切成長度為1.5-2.5mm，獲取無菌大豆組織；(3)將獲得的無菌大豆組織，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得愈傷組織，其中，1g無菌大豆組織接種于25-35mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(4)將上述獲得的愈傷組織，接種于增殖培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，同時(shí)于第2天開始進(jìn)行穩(wěn)態(tài)磁場干預(yù)，即可獲得富含植物甾醇的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L檸檬酸銨和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.0-6.3；所述增殖培養(yǎng)基為含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.8-7.0。進(jìn)一步地，上述方法中，所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為75-90％，次氯酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為2-10％。進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)為暗培養(yǎng)，溫度為30-32℃，6-7天為一個(gè)培養(yǎng)周期，優(yōu)選培養(yǎng)2-3個(gè)培養(yǎng)周期。進(jìn)一步地，所述增殖培養(yǎng)溫度為30-32℃，光照10-12h/d，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為110-130r/min，7天為一個(gè)培養(yǎng)周期，優(yōu)選培養(yǎng)2-3個(gè)培養(yǎng)周期。進(jìn)一步地，在增殖培養(yǎng)中，穩(wěn)態(tài)磁場干預(yù)具體參數(shù)為每個(gè)培養(yǎng)周期中加載穩(wěn)態(tài)磁場5-6天，每天曝磁6-8h，強(qiáng)度為0.9-3T。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供了一種工藝操作簡單、安全性高的植物甾醇提取方法：首先傳統(tǒng)上提取植物甾醇的原料多為植物油脫臭餾出物，本發(fā)明以含有高含量植物甾醇的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物為原料，該原料不僅植物甾醇含量高，而且制備周期短，經(jīng)檢測大豆干細(xì)胞中植物甾醇含量不低于6000mg/100g，普通大豆中植物甾醇含量大約為310mg/100g，二者植物甾醇含量相差近20倍，而且大豆干細(xì)胞培養(yǎng)周期僅為普通大豆生長周期的1/3，可見本發(fā)明所述的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物不僅縮短了生長周期，而且降低了生產(chǎn)成本，為植物甾醇的提取用原料提供了一種新途徑。其次本發(fā)明采用亞臨界萃取技術(shù)，整個(gè)萃取過程中低溫、低壓，可有效保護(hù)植物甾醇活性不被破壞，工藝簡單，對(duì)設(shè)備要求低，溶劑殘留少，產(chǎn)品不僅安全性高而且可大幅度提高植物甾醇提取率，提取成本低，最終得到含量和純度都較高的植物甾醇，因此應(yīng)用亞臨界萃取技術(shù)提取制備大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物中植物甾醇具有很大的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用本發(fā)明提取制備的植物甾醇提取率達(dá)5.95％，提取物中植物甾醇相對(duì)純度達(dá)97.98％。附圖說明圖1植物甾醇亞臨界萃取工藝流程圖。具體實(shí)施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1富含植物甾醇大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)：一、培養(yǎng)基配制1、誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mol/L檸檬酸銨和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.0-6.3；所述增殖培養(yǎng)基為2、增殖培養(yǎng)基：含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.8-7.0。二、獲取無菌大豆將大豆種子用質(zhì)量濃度為75-90％的乙醇浸泡15min，無菌水洗凈；用質(zhì)量濃度為2-10％的次氯酸鈉浸泡2-5min，無菌水洗凈；取上述無菌大豆下胚軸，將其切成長度為1.5-2.5mm。三、誘導(dǎo)培養(yǎng)取按照上述方法獲得的無菌大豆組織，放于以上所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于30-32℃條件下避光培養(yǎng)6-8天，按照1g樣品接種于25-35mL培養(yǎng)基的比例進(jìn)行誘導(dǎo)，6-7天為一個(gè)周期，培養(yǎng)2-3個(gè)周期，獲得愈傷組織。四、高溫脅迫協(xié)同穩(wěn)態(tài)磁場誘導(dǎo)大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物富集植物甾醇取按上述方法獲得的愈傷組織，將其接種在增殖培養(yǎng)基中，于30-32℃，光照10-12h/d條件下，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為110-130r/min。從培養(yǎng)的第2天起加載穩(wěn)態(tài)磁場，每個(gè)周期(7天)加載5-6天，每天曝磁6-8h，強(qiáng)度為0.9-3T，培養(yǎng)3個(gè)周期，即可獲得富含植物甾醇的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物。植物甾醇測定一、植物甾醇提取準(zhǔn)確稱取10g大豆或大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物(大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物使用前先作凍干處理)，將其粉碎過60目篩，以無水乙醇為提取液，按照料液比1:20，超聲波功率500W，提取溫度50℃，提取時(shí)間60min的工藝參數(shù)進(jìn)行超聲波提取后，以4000r/min離心5分鐘，冷卻至室溫后真空抽濾，棄去沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容，得到植物甾醇粗提液。二、大豆甾醇含量的測定參照GB/T25223-2010甾醇總量測定方法測定甾醇含量，測定結(jié)果如下：名稱植物甾醇含量(mg/100g)本發(fā)明培育大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物6025普通大豆310.63大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物中植物甾醇含量為6025mg/100g，普通大豆中植物甾醇含量為310.63mg/100g，二者植物甾醇含量相差近20倍。實(shí)施例2植物甾醇的提取(1)取100g實(shí)施例1制備的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物凍干，然后粉碎過60目篩；送入亞臨界萃取器中，密閉萃取器，控制萃取器內(nèi)的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)通入液化的正丁烷進(jìn)行逆流萃取，樣品與正丁烷的料液比為1∶10，萃取溫度40℃，萃取時(shí)間30min，萃取壓力0.6MPa，萃取2次；(3)萃取結(jié)束后將萃取液打入蒸發(fā)罐，使溶劑與樣品分離，脫溶過程中溫度控制在50℃左右，保持恒溫，最終得到萃取物粗品；(4)取一定量的萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶8，用磁力攪拌器一邊加熱一邊攪拌，加熱溫度控制在50℃，待樣品完全溶解后停止加熱和攪拌，讓其自然降溫結(jié)晶，降至室溫后維持2h，抽濾得到植物甾醇精品。植物甾醇檢測及提取率測定：參照GB/T25223-2010甾醇總量測定方法測定大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物、植物甾醇萃取物粗品、植物甾醇精制品中甾醇含量并計(jì)算提取率。提取率/％＝萃取物中甾醇總量/大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物總量×100％；植物甾醇相對(duì)純度/％＝萃取處理后甾醇總量/萃取處理前甾醇總量×100％測定結(jié)果如下：經(jīng)計(jì)算，應(yīng)用本方法制備的植物甾醇萃取物粗品提取率可達(dá)到5.95％，最后制得精品相對(duì)純度可達(dá)到97.98％，表明應(yīng)用本發(fā)明提取大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物中植物甾醇方法具有較高的提取效率。實(shí)施例3植物甾醇的提取(1)取100g實(shí)施例1制備的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物凍干，然后粉碎過60目篩；送入亞臨界萃取器中，密閉萃取器，控制萃取器內(nèi)的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)通入液化的正丁烷進(jìn)行逆流萃取，樣品與正丁烷的料液比為1∶20，萃取溫度70℃，萃取時(shí)間60min，萃取壓力1.0MPa，萃取3次；(3)萃取結(jié)束后將萃取液打入蒸發(fā)罐，使溶劑與樣品分離，脫溶過程中溫度控制在60℃左右，保持恒溫，最終得到萃取物粗品；(4)取一定量的萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶10，用磁力攪拌器一邊加熱一邊攪拌，加熱溫度控制在40℃，待樣品完全溶解后停止加熱和攪拌，讓其自然降溫結(jié)晶，降至室溫后維持3h，抽濾得到植物甾醇精品。實(shí)施例4植物甾醇的提取(1)取100g實(shí)施例1制備的大豆干細(xì)胞培養(yǎng)物凍干，然后粉碎過60目篩；送入亞臨界萃取器中，密閉萃取器，控制萃取器內(nèi)的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)通入液化的正丁烷進(jìn)行逆流萃取，樣品與正丁烷的料液比為1∶5，萃取溫度35℃，萃取時(shí)間30min，萃取壓力0.2MPa，萃取3次；(3)萃取結(jié)束后將萃取液打入蒸發(fā)罐，使溶劑與樣品分離，脫溶過程中溫度控制在30℃左右，保持恒溫，最終得到萃取物粗品；(4)取一定量的萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶4，用磁力攪拌器一邊加熱一邊攪拌，加熱溫度控制在35℃，待樣品完全溶解后停止加熱和攪拌，讓其自然降溫結(jié)晶，降至室溫后維持2h，抽濾得到植物甾醇精品。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。當(dāng)前第1頁1 2 3