專利名稱：人體脂肪干細(xì)胞快速提取方法及其專用人脂肪組織消化劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，特別涉及一種人體脂肪干細(xì)胞快速提取方法及其專用人脂肪組織消化劑。
背景技術(shù)：
脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種成體干細(xì)胞，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能。ADSCs呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期的細(xì)胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在條件下傳代培養(yǎng)2_3天細(xì)胞增殖I倍。多次傳代(10-20代)后，細(xì)胞增殖速度無(wú)明顯減慢，在傳代6次后細(xì)胞群體中出現(xiàn)衰老細(xì)胞，第15代細(xì)胞群體中衰老細(xì)胞約占15%。ADSCs具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本 相同的細(xì)胞免疫表型，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析⑶9，⑶10，⑶13，⑶29，⑶44，⑶49d，⑶49e，⑶54，CD55, CD59, CD90, CD105, CDl 17，CD146, CD166, STRO-1 均為陽(yáng)性，而 CD31, CD34, CD45 均為陰性。最大的區(qū)別是ADSCs表達(dá)⑶49d，不表達(dá)⑶106;而正好相反，BMSCs表達(dá)⑶106，不表達(dá) CD49d。目前常用的ADSCs分離培養(yǎng)方法是從脂肪組織分離獲取細(xì)胞，經(jīng)機(jī)械和酶處理方法除去紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞后，利用飼養(yǎng)層細(xì)胞與含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。這種培養(yǎng)干細(xì)胞方法的缺點(diǎn)是方法復(fù)雜，提取的干細(xì)胞數(shù)量少，純度不高，繼代增殖緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一種人體脂肪干細(xì)胞快速提取方法，包括如下步驟人脂肪組織處理將人脂肪組織塊加入離心管中再加入等量生理鹽水而后使用組織勻漿器處理成液狀加入離心管中；液狀脂肪離心將盛有液狀脂肪的離心管置于離心機(jī)中2400rpm/min離心5min，使液狀脂肪分為上層橙黃色透明的油層、中間層黃色脂肪層、底層沉積層；脂肪層人脂肪干細(xì)胞提取移取中間層脂肪至離心管中，加入等量的人脂肪組織消化劑混勻，置于恒溫振蕩器中，37°C、200rpm振蕩30min,而后使用離心機(jī)2400rpm/min離心lOmin，倒掉浮游脂肪，吸除液體，加入Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液混勻，轉(zhuǎn)移至另一離心管中離心后棄去上清液，加Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液混勻，2400rpm/min離心3min,洗漆2次后吸除上層液體，下層沉積細(xì)胞即為人脂肪干細(xì)胞；沉積層人脂肪干細(xì)胞提取在留有沉積層細(xì)胞的離心管中加入等量的人脂肪組織消化劑混勻，置于恒溫振蕩器中，37°C、200rpm振蕩5min, 2400rpm/min離心IOmin,吸除上層液體，加入Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液，混勻，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再離心機(jī)2400rpm/min離心5min，吸除上層液體下層沉積細(xì)胞即為人脂肪干細(xì)胞。人體脂肪干細(xì)胞提取中所使用的人脂肪組織消化劑，包含膠原酶IV型
0.15 2. 5mg/mL、胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體0. 5 5mg/mL、α I抗胰蛋白酶0. Γ . 5mg/mL和二甲基亞砜5 100 μ 1/mL,膠原酶IV型的最優(yōu)濃度為O. 75mg/mL,胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體最優(yōu)濃度為2. 5mg/mL, α I抗胰蛋白酶最優(yōu)濃度為O. 5mg/mL, 二甲基亞砜最優(yōu)濃度為30 μ Ι/mL,使用Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液作為溶劑。上述人脂肪組織消化劑中各成分作用如下膠原酶IV型作用的是消化連接脂肪細(xì)胞間的膠原組織，加速脂肪細(xì)胞解離出來(lái)，而且不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞；胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體作用是消化脂肪細(xì)胞間基質(zhì)蛋白組織，解離細(xì)胞間的連接，加速脂肪細(xì)胞從組織中游離出來(lái)，但過(guò)量胰酶復(fù)合體可以消化破壞脂肪干細(xì)胞本身需要優(yōu)選；α I抗胰蛋白酶作用是終止多余的胰蛋白酶作用，保護(hù)細(xì)胞本身不受到消化的損 傷；二甲基亞砜屬于非質(zhì)子極性溶劑，常用于細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基內(nèi)，可以保護(hù)細(xì)胞免受冰晶引起的機(jī)械性損傷，高濃度DMSO的細(xì)胞毒性是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和影響細(xì)胞生長(zhǎng)活力。使用本發(fā)明提供的快速分離提取人脂肪干細(xì)胞方法及其使用的脂肪消化劑，可以使脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞充分游離出來(lái)同時(shí)保護(hù)細(xì)胞不受傷害，以獲得充分游離存活率高的人脂肪干細(xì)胞。


圖I為本發(fā)明使用的三種優(yōu)選濃度脂肪組織消化劑提取干細(xì)胞總量對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下面對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)中使用的膠原酶IV型,胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體trypsin_EDTA, α I抗胰蛋白酶，二甲基亞砜均從Sigma公司購(gòu)得。實(shí)驗(yàn)所用器具儀器試劑皆可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例I :本發(fā)明所述的一種用于消化人脂肪組織的人脂肪消化劑A的制備I)取 900ml 的 Dulbecco’ s 憐酸鹽緩沖液(Dulbecco，s PBS, Sigma,D-8537,以下相同)，再加入青霉素和鏈霉素各90000U。 2 )調(diào) pH 值用 5 % NaHCO3 溶液調(diào)節(jié) pH 到 7. 2。3)加入高效消化劑將膠原酶IV型150mg，胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體500mg，α I抗胰蛋白酶IOOmg和二甲基亞砜5000 μ L依次加入Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液中，使用振蕩或
超聲助溶。4)然后補(bǔ)加上述Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液至IOOOmL,即各個(gè)試劑組分取最低劑量配制而成的人脂肪消化劑A。實(shí)施例2 :本發(fā)明所述的一種用于消化人脂肪組織的人脂肪消化劑B的制備I)取 900ml 的 Dulbecco，s 憐酸鹽緩沖液(Dulbecco，s PBS, Sigma, D-8537),再加入青霉素和鏈霉素各90000U。2 )調(diào) pH 值用 5 % NaHCO3 溶液調(diào)節(jié) pH 到 7. 2。3)加入高效消化劑將膠原酶IV型2500mg，胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體5000mg，α I抗胰蛋白酶1500mg和二甲基亞砜100000 μ L依次加入Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液中，使用
振蕩或超聲助溶。4)然后補(bǔ)加上述Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液至IOOOmL,即各個(gè)試劑組分取最高劑量配制而成的人脂肪消化劑B。實(shí)施例3 :本發(fā)明所述的一種用于消化人脂肪組織的人脂肪消化劑C的制備I)取 900ml 的 Dulbecco，s 憐酸鹽緩沖液(Dulbecco，s PBS, Sigma, D-8537),再加入青霉素和鏈霉素各90000U。 2 )調(diào) pH 值用 5 % NaHCO3 溶液調(diào)節(jié) pH 到 7. 2。 3)加入高效消化劑將膠原酶IV型750mg，胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體2500mg，α I抗胰蛋白酶500mg和二甲基亞砜30000 μ L依次加入Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液中，使用振蕩或超聲助溶。4)然后補(bǔ)加上述Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液至IOOOmL,即各個(gè)試劑組分取最優(yōu)劑量配制而成的人脂肪消化劑C。實(shí)施例4 :人體脂肪干細(xì)胞的快速提取步驟I、取人脂肪組織塊，置于500mL離心管中，加入等量生理鹽水，用組織勻漿器(PR0200組織精密勻漿器，美國(guó)Pro Scientific公司)絞碎成為糜狀后放入離心管中。步驟2、將盛有脂肪的離心管置于8420離心機(jī)(久保田8420，日本KUBOTA久保田公司)中2400rpm離心5min后，分為3層上層即油層、中間層即脂肪層、下層即沉積層。步驟3、移取中間層等分至3個(gè)500mL離心管，分別加入與中間層等體積的不同類型的人脂肪組織消化劑，即A型消化劑、B型消化劑和C型消化劑，分別混勻，置于恒溫振蕩器中在37°C振速200rpm下振蕩30min。步驟4、取振蕩后的3組中間層與消化劑的混合物分別用8420離心機(jī)(久保田8420，日本KUBOTA久保田公司)2400rpm/min離心lOmin，倒掉上層浮游脂肪吸除上層液體，分別加入 20mL Dulbecco，s 憐酸鹽緩沖液(Dulbecco，s PBS, Sigma, D-8537)混勻，分別轉(zhuǎn)移至50mL離心管，使用2420離心機(jī)(久保田2420，日本KUBOTA久保田公司)800rpm/min離心5min。吸除上清,分別加入Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco，s PBS, Sigma,D-8537)混勻，使用2420離心機(jī)800rpm/min離心3min，吸除上層液體，同上再重復(fù)離心洗漆2次,根據(jù)細(xì)胞量剩余加5_15mL Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’ s PBS, Sigma,D-8537),使用IOmL移液管混勻。從中吸取IOuL液體經(jīng)過(guò)IOOum濾網(wǎng)過(guò)濾，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算出中間層脂肪液提取出的原代干細(xì)胞(X)數(shù)量。步驟5、步驟2中沉積層等分移至3個(gè)500mL離心管中，分別加入與沉積層等體積的不同類型的人脂肪組織消化劑，即A型消化劑、B型消化劑和C型消化劑，混勻置于恒溫振蕩器中，在37°C振速200rpm振蕩5min。8420離心機(jī)800rpm/min離心IOmin,吸除上層液體，分別加入20mLDulbecco’ s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco，s PBS, Sigma, D-8537),分別混勻，轉(zhuǎn)移至50mL離心管,2420離心機(jī)(久保田2420,日本KUBOTA久保田公司)800rpm/min離心5min,吸除上層液體。根據(jù)細(xì)胞量剩余量加5_10mlDulbecco’ s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’sPBS, Sigma, D-8537)，使用 10ml 移液管混勻；從中吸取IOuL液體IOOum濾網(wǎng)過(guò)濾，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算出沉積層提取出的原代干細(xì)胞(Y)數(shù)量。實(shí)施例5 :結(jié)果及分析將中間層提取的脂肪干細(xì)胞總量(X)和沉積層收獲的干細(xì)胞總量(Y)合并，根據(jù)公式(X+Y)/總液量，計(jì)算出提取的人體脂肪干細(xì)胞濃度及細(xì)胞總量。使用本發(fā)明A型消化劑、B型消化劑和C型消化劑實(shí)際提取的人體脂肪干細(xì)胞總量見圖I。如圖I所示用三種不同濃度消化劑都取得預(yù)期效果，其中最優(yōu)濃度的脂肪組織消化劑消化組織提取的細(xì)胞數(shù)量最多，與預(yù)期相同。低濃度的配方消化作用低消化不完全所以提取的細(xì)胞數(shù)量較少，而高濃度的配方對(duì)細(xì)胞有較大的損傷作用所以最后提取的細(xì)胞數(shù)量反而是3組中最低。以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改變和改進(jìn)，例如用于消化人脂肪組織的人體脂肪消化劑使用的Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液可由其他有類似作用的緩沖液溶或者培 養(yǎng)液代替，其并非所述的人體脂肪消化劑中的有效成分，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種人體脂肪干細(xì)胞快速提取方法，包括如下步驟 人脂肪組織處理將人脂肪組織塊加入離心管中，再加入等量的生理鹽水而后使用組織勻漿器處理成液狀的脂肪，再將已成為液狀的脂肪加入離心管中； 將液狀的脂肪離心使用離心機(jī)分離離心管中的液狀脂肪使之分為三層，上層即油層、中間層即脂肪層、底層即沉積層； 脂肪層中人體脂肪干細(xì)胞提取移取中間層脂肪至離心管中，加入與脂肪層相等體積的人脂肪組織消化劑混勻，該消化劑包含膠原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體、α I抗胰蛋白酶、二甲基亞砜，然后置于恒溫振蕩器中振蕩，接著離心分離后去浮游脂肪取上層液體；而后再向取出的上層液體中加入Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液然后離心，棄去離心后的上清液取下層沉積細(xì)胞，再使用Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液重復(fù)離心洗滌2次，下層沉積細(xì)胞即為人體脂肪干細(xì)胞； 沉積層中人脂肪干細(xì)胞提取在留有沉積層細(xì)胞的離心管中加入等體積的人脂肪組織消化劑混勻，該消化劑包含膠原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體、α I抗胰蛋白酶、二甲基亞砜，然后置于恒溫振蕩器中振蕩后離心機(jī)離心，其后吸除上層液體，下層沉積細(xì)胞即為人脂肪干細(xì)胞。
2.人體脂肪干細(xì)胞快速提取中使用的人脂肪組織消化劑，其特征在于包含膠原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體、α I抗胰蛋白酶、二甲基亞砜，所述膠原酶IV型濃度為O. 15^2. 5mg/mL，所述胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體濃度為O. 5 5mg/mL，所述α I抗胰蛋白酶濃度為O. I I. 5mg/mL,所述二甲基亞砜濃度為5 100 μ 1/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人脂肪組織消化劑，其特征在于膠原酶IV型的最優(yōu)濃度為O. 75mg/mL,胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體最優(yōu)濃度為2. 5mg/mL, α I抗胰蛋白酶最優(yōu)濃度為O.5mg/mL, 二甲基亞砜最優(yōu)濃度為30 μ 1/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人脂肪組織消化劑，其特征在于制備所述的一種人脂肪組織消化劑時(shí)使用Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖液作為溶劑。
全文摘要
本申請(qǐng)公開了一種人體脂肪干細(xì)胞快速提取方法及其專用人脂肪組織消化劑，該方法包括人脂肪組織處理、液狀的脂肪離心、人體脂肪干細(xì)胞提取，該方法中用到的專用人脂肪組織消化劑包含膠原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA復(fù)合體、抗胰蛋白酶和二甲基亞砜。本發(fā)明具有使脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞充分游離出來(lái)，同時(shí)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的效果。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102719396SQ20121018116
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者焦陽(yáng) 申請(qǐng)人:江蘇瑞思坦生物科技有限公司