本發(fā)明屬于新型納米復合材料的制備技術，具體涉及一種釓修飾的Fe3O4@PDA納米材料的光熱診療劑的制備。

背景技術：

目前，腫瘤的臨床診斷和治療面臨兩大問題。第一，當前臨床上使用的三種癌癥治療方法包括外科手術、放療和化療，但治療效果欠佳，更糟糕的是它們存在引發(fā)第二原發(fā)癌的風險，且癌癥患者在治療過程中常常遭受極大的痛苦和副作用；第二，腫瘤的診斷和治療是分開的，因此，在腫瘤的治療過程中無法監(jiān)測腫瘤的動態(tài)變化過程，這將造成療效評估不準確、時間滯后。針對以上問題，當前，開發(fā)成像指導的新型癌癥治療方式成為目前科學研究的一個熱點。

光熱治療癌癥是借助于光敏試劑吸收光能并將其轉化為熱能，所產生的熱能促使癌細胞變性、壞死從而達到治療癌癥的目的。光熱治療方法具有以下優(yōu)勢：（1）高選擇性：光熱治療只針對有光熱治療試劑富集的腫瘤部位給予局部激光照射，正常組織即便有光熱治療試劑存在，在不給于激光照射時不會對其造成損害；（2）技術操作簡便，損傷小，恢復快，不會引發(fā)耐藥性和嚴重的副作用，因此，光熱治療在癌癥治療方面具有非常大的潛力，引起了研究者們的廣泛關注。制備基于光熱治療的診療劑是目前研究的一個熱點。當前有大量的研究工作集中于制備不同種類的納米粒子并用于癌癥的光熱治療方面，這些材料主要有以下幾類：基于Au的貴金屬納米粒子（如，金納米殼、金納米籠、金納米星、金納米棒等），半導體納米粒子（如硫化銅，硫化鉬等），碳材料（碳納米管、石墨烯等）和有機聚合物納米材料（葉綠素，聚吡咯等），盡管展現了良好的治療效果。但這些納米粒子作為光熱治療試劑仍然沒有在臨床腫瘤治療中得到應用，最主要的原因可能是由于這些納米材料存在潛在的體內毒性問題。例如，研究表明金屬類納米粒子在體內無法降解，且金屬本身就存在著毒性問題。而碳材料會產生許多毒副反應，如氧化應激和肺部感染等。Zheng小組利用卟啉化合物與脂質形成的配體作為單體通過自組裝方法制備了這樣一類的光熱治療試劑，由于卟啉是一種天然化合物，所得到的porphysomes納米粒子在體內可降解，同時不會引起嚴重的急性中毒現象，但是，這一類材料制備非常繁瑣，需要預先合成有機配體。又如Lu等報道了一種簡單有效的方法制備基于多巴胺黑色素膠束納米球的新型光熱治療劑，該材料具有較高的光熱轉換效率以及較為理想的腫瘤治療效果。更為重要的是，該材料由人體內廣泛存在的多巴胺黑色素組成，且其表面易于修飾和體內生物降解。

磁共振成像（Nuclear Magnetic Resonance Imaging，簡稱NMRI）是當前分子影像技術中使用最普遍的分子成像技術之一，是目前癌癥臨床診斷的一種重要方式。四氧化三鐵具有良好的生物兼容性，靜脈注射入人體后不會對人體產生明顯的毒副作用，且右糖旋酐保護的四氧化三鐵納米粒子已經臨床化。

基于以上背景，本文通過在四氧化三鐵外面包裹聚多巴胺（PDA）納米材料，在其表面修飾氨基，，最后得到了需要的Fe₃O₄@PDA-NH₂-DTPA-Gd納米復合材料,實現了T1-T2雙模式造影劑指導的光熱診療劑的制備。

技術實現要素：

本發(fā)明利用人體內廣泛存在的黑色素多巴胺作為原材料，在Fe₃O₄納米小球外包裹多巴胺（PDA）納米材料，得到Fe₃O₄@PDA納米粒子，再將Gd-DTPA接在經1, 6-己二胺修飾后的Fe₃O₄@PDA納米粒子上，得到Fe₃O₄@PDA-NH2-DTPA-Gd納米材料（如圖1所示）。

一種基于釓修飾的Fe₃O₄@PDA納米材料的光熱診療劑的制備，包括如下步驟：

(1)制備粒徑為10 nm的四氧化三鐵納米粒子，具體方法如下：

①稱取1.4mmol FeCl₃·6H₂O 0.4g，0.7mmol FeSO₄·7H₂O 0.2g，溶解到20mL去離子水中，超聲15min除去空氣；

②將步驟①的溶液置于50℃下水浴，在N₂保護下磁力攪拌15min，然后向其中緩慢滴加氨水5 mL，調節(jié)pH至11，將溫度升高到80℃；

③將0.16g檸檬酸溶解到1mL水中，加入到步驟②的反應溶液中，反應1h，制得Fe₃O₄納米粒子；

④將步驟③制得的Fe₃O₄納米粒子，用乙醇洗滌兩次，最后分散到20mL超純水中。

（2）在四氧化三鐵小球表面原位包覆上一層聚多巴胺納米材料，其中聚多巴胺殼厚度為30nm左右，四氧化三鐵核的尺寸為10 nm，具體步驟如下：

①取步驟（1）最后制得的Fe₃O₄溶液5mL，分散在21mL水和0.4mL氨水混

合成的溶液中；

②稱取0.1g多巴胺溶于2ml水中，逐滴加入到步驟①的反應溶液中，在常溫下磁力攪拌24h；

③將步驟②的溶液在11000W下離心15min，吸出上清液，加去離子水、超聲分散再離心，如此3遍，第三遍離心后吸出上清液后再加20ml去離子水超聲分散后保存。

（3）制備Fe₃O₄@PDA-NH₂-DTPA-Gd納米材料，具體步驟如下：

①取20mg的Fe₃O₄@PDA分散到100mlPBS緩沖溶液（pH=8.5,10mM）中，向該溶液中加入40mg的1,6-己二胺，強烈攪拌下反應12小時；然后離心得到氨基化的Fe₃O₄@PDA-NH₂，用水洗三次后，重新分散到去離子水中；最后向此溶液中加入過量的DTPAA，并滴加NaOH 調整溶液的pH值到7，反應24小時后，離心分離，棄掉上清液得到Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA沉淀；

②將Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA分散在0.01mol/L的NaOH中，再用HCl調節(jié)Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA水溶液pH為7，緩慢加入1.8mlGdCl₃水溶液（25mM），同時用NaOH溶液（0.1M）調節(jié)pH在6到7之間，將上述的混合液繼續(xù)攪拌12小時，即可制得Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料。

本發(fā)明與以往報道的納米診療劑相比較，該Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料同時具有以下優(yōu)勢：

（1）該Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料具有較好的生物相容性和體內可降解性：制備該材料的聚多巴胺由一種人體內廣泛存在的多巴胺黑色素組成，另外Fe₃O₄和Gd-DTPA造影劑已經被臨床使用，因此所制備材料具有良好的安全性和穩(wěn)定性。

（2）Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料同時具有T1成像和T2成像功能，從而使成像信息更具準確性、精確性和可靠性，更有利于早期病變的診斷。

（3）將磁共振成像與光熱治療結合起來，將賦予該材料磁共振成像指導的癌癥光熱治療效果。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明制備Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料的流程圖。

圖2 （a）為Fe₃O₄的透射電鏡示意圖，（b）為Fe₃O₄的粒徑分布圖。

圖3（a）為Fe₃O₄@PDA的透射電鏡示意圖，（b）為Fe₃O₄@PDA的粒徑分布圖。

圖4 (a)為Fe₃O₄@PDA-NH₂-DTPA-Gd的透射電鏡示意，（b)為Fe3O4@PDA-NH₂-

DTPA-Gd的粒徑分布圖。

圖5 (a)為Fe₃O₄@PDA-NH₂-DTPA-Gd的成像圖；(b)為Gd-DTPA的縱向磁豫率值r1；(c)為Fe₃O₄@PDA的橫向弛豫率值r2。

圖6 不同濃度的Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd的光熱轉換圖。

具體實施方式

（1）采用了共沉淀方法制備了粒徑為10nm的四氧化三鐵納米粒子，具體方法如下：

①稱取1.4mmol FeCl₃·6H₂O 0.4g，0.7mmol FeSO₄·7H₂O 0.2g，溶解到20mL去離子水中，超聲15min除去空氣；

②將步驟①的溶液置于50℃下水浴，在N₂保護下磁力攪拌15min，然后向其中緩慢滴加氨水5 mL，調節(jié)pH至11，將溫度升高到80℃；

③將0.16g檸檬酸溶解到1mL水中，加入到步驟②的反應溶液中，反應1h，制得Fe₃O₄納米粒子；

④將步驟③制得的Fe₃O₄納米粒子，用乙醇洗滌兩次，最后分散到20mL超純水中。

（2）四氧化三鐵小球表面原位包覆上一層聚多巴胺納米材料，其中，聚多巴胺殼厚度為30nm左右，具體方法如下：

①取步驟（1）最后制得的Fe₃O₄溶液5mL，分散在21mL水和0.4mL氨水混

合成的溶液中；

②稱取0.1g多巴胺溶于2ml水中，逐滴加入到步驟①的反應溶液中，在常溫下磁力攪拌24h；

③將步驟②的溶液在11000W下離心15min，吸出上清液，加去離子水、超聲分散再離心，如此3遍，第三遍離心后吸出上清液后再加20ml去離子水超聲分散后保存。

（3）制備Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA納米材料，具體方法如下：

取20mg的Fe₃O₄@PDA分散到100mlPBS緩沖溶液（pH=8.5,10mM）中，向該溶液中加入40mg的1,6-己二胺，強烈攪拌下反應12小時；然后離心得到氨基化的Fe₃O₄@PDA-NH₂，用水洗三次后，重新分散到去離子水中；最后向此溶液中加入過量的DTPAA，并滴加NaOH 調整溶液的pH值到7，反應24小時后，離心分離，棄掉上清液得到Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA沉淀。

（4）制備Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料：

將Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA分散在0.01mol/L的NaOH中，再用HCl調節(jié)Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA水溶液pH為7，緩慢加入1.8mlGdCl₃水溶液（25mM），同時用NaOH溶液（0.1M）調節(jié)pH在6到7之間，將上述的混合液繼續(xù)攪拌12小時，即可制得Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料。

（5）材料的表征和性能測試：

動態(tài)光散射檢測粒徑：分別取2ml的Fe₃O₄、Fe₃O₄@PDA、Fe₃O₄@PDA@-NH₂、Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA和Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料，利用Nanosizer Nano-ZS馬爾文公司納米粒徑分析儀粒徑進行粒徑檢測。

透射電鏡表征：分別取2ml的Fe₃O₄、Fe₃O₄@PDA、和Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料，在JEOL公司生產的2000-FX型場發(fā)射透射電子顯微鏡上進行TEM觀察，加速電壓：200 kV。TEM 樣品的制備是將所測樣品分散至環(huán)己烷或者水溶液中，然后滴一滴于涂碳的銅網上，過量的液體用濾紙吸干，后將銅網在室溫下干燥，通過JEM-2100透射電子顯微鏡得到上述材料的微觀結構圖。

光熱轉換測試：取0.35mg/ml、0.175mg/ml的Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料，并取水做對照，置于1W/cm²的MDL-N-808-8W紅外激光器1W cm-2的測量池光照500s,檢測其光熱轉換。采用數字溫度計，每隔30s記錄一次升溫數字。

弛豫率和體外成像性能測試：T1、T2時間在25℃，9.4T條件下，在Bruker Avance 400NMR分光儀上測定；T1、T2弛豫效率在德國Bruker公司生產的AVII-500型核磁共振儀上測量，MRI 成像通過 Magnetom Espree MIR 系統（西門子, 1.5T）測定。

為了考察Fe₃O₄納米粒子的形貌及粒徑大小，我們對其進行了TEM和DLS分析。其TEM圖顯示，該納米粒子的形貌呈球形，具有單分散性，平均粒徑為10nm，如圖2 (a)。共沉淀法制備的Fe₃O₄納米小球的水合粒徑為32.8nm，如圖2(b)圖所示，其多分散性指數（PDI）為0.18，該值小于0.2，進一步說明所制備的納米材料尺寸均一，單分散性較好。

接下來對Fe₃O₄@PDA納米材料進行了電鏡考察，結果如圖3(a)，其粒徑在70nm左右，因此PDA殼厚度約為30nm。圖3(b)顯示Fe₃O₄@PDA納米材料的水合粒徑為162.2nm，其測試PDI為0.145，表明該納米粒子具有較好的單分散性。

然后，我們通過在Fe₃O₄@PDA表面修飾氨基，最終得到了Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料。如圖4(a)，所得TEM圖表明Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米粒子的外部形貌與Fe₃O₄@PDA（圖 3a）類似，都呈現平均粒徑為70nm的球形結構，并且具有良好的單分散性，說明表面氨基-NH₂、Gd-DTPA配體的修飾對于Fe₃O₄@PDA結構沒有明顯的影響。該納米粒子的粒徑分布測試表明，其水合粒徑為316.6nm，PDI為0.290，如圖4(b)。水合粒徑與TEM圖顯示的粒徑相差較大的原因是，我們所制備的Fe₃O₄@PDA-NH₂-DTPA-Gd外連有氨基-NH₂、Gd-DTPA配體，在水溶液中檢測粒徑時，配體呈舒展狀態(tài)，而TEM檢測粒徑時，是將樣品滴在銅網上并干燥，因此水合粒徑較大。

所制備納米材料的T1、T2成像效果如圖5(a)所示，隨著Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd濃度的減小，T1加權信號逐漸變弱，成像逐漸變暗；T2加權信號逐漸變弱，成像逐漸變暗。該圖5(a)直觀表明Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd同時具有良好的T1和T2加權成像效果。圖5(b)、(c)分別表示Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd的縱向磁豫率值r1=12.6mM-1S-1、橫向弛豫率值r2=104.0mM-1S-1，與商用Gd-DTPA(r1=3.7 mM -1s -1) 相比提升了3.4倍的弛豫系數，進一步說Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd具有良好的磁共振成像效果。

為了探索Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd在光熱治療方面的可行性，我們考察了它們的光熱轉換性能。我們分別將0.35mg/ml、0.175mg/ml的Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd和水溶液用808nm激光器照射500秒，記錄溶液的溫度變化，結果顯示在圖6中。很明顯，純水溶液在激光照射下400秒僅升高2度。而當給予激光照射后，Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd的溫度快速升高，并且濃度越高，溶液溫度增加越快。造成這種結果的原因是，隨著濃度的增加，Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料在808nm處的光吸收值變強，從而導致其光熱轉換能力增強。通過光熱轉化實驗，我們得出Fe₃O₄@PDA@-NH₂-DTPA-Gd納米材料具有良好的光熱轉換能力，并且濃度越高，光熱轉換能力越好。

綜上，本發(fā)明采用已被臨床應用的T1造影劑（Gd-DTPA）、T2造影劑（Fe₃O₄），和具有良好的生物相容性和近紅外吸收能力的PDA，用共沉淀法合成了10nm左右的Fe₃O₄納米粒子，在其表面包裹PDA，得到單分散性較好的Fe₃O₄@PDA納米材料；接下來為了將Gd-DTPA與之接合，我們使Fe₃O₄@PDA氨基化，最后得到了Fe₃O₄@PDA-NH₂-DTPA-Gd納米復合材料。實驗結果證實，該材料同時具有良好的T1、T2成像效果和光熱轉換能力，這為開發(fā)新的成像指導的光熱診療劑提供了一個新的平臺。