本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及高致病性豬葡萄球菌的蛋白在作為亞單位疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬滲出性表皮炎是哺乳仔豬或早期斷乳仔豬因感染豬葡萄球菌而引起的一種急性致死性淺表膿皮炎，以全身油脂樣滲出性皮炎為特征并具有高度傳染性的疾病。世界上大多數(shù)國(guó)家的哺乳仔豬和斷奶仔豬都有滲出性皮炎，發(fā)病率10％～90％，死亡率5％～90％。近年來(lái)豬滲出性皮炎在國(guó)內(nèi)外豬場(chǎng)的發(fā)生率也逐漸增高，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)豬葡萄球菌的研究己有不少，但它的毒力及其致病機(jī)理至今仍不十分明確。

本實(shí)驗(yàn)室于2011年從增城某豬場(chǎng)分離得到一株高致病性豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)，之后對(duì)其致病性以及分子機(jī)理進(jìn)行了較深入的研究。目前我們用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，篩選得到了多個(gè)具有免疫原性的豬葡萄球菌蛋白，經(jīng)過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)了其蛋白acetate kinase具有較好的免疫原性。而目前對(duì)豬葡萄球菌的研究主要基于基因水平和細(xì)胞水平，在蛋白水平上的研究較少，而對(duì)于豬葡萄球菌在蛋白水平上的研究也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種高致病性豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)的蛋白在作為亞單位疫苗中的應(yīng)用，該分泌蛋白具有較好的免疫原性，能夠預(yù)防豬葡萄球菌感染。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種高致病性豬葡萄球菌的蛋白在作為亞單位疫苗中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述豬葡萄球菌的蛋白在作為預(yù)防豬葡萄球菌感染引起的豬滲出性表皮炎的亞單位疫苗中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述豬葡萄球菌的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

進(jìn)一步地，制備如權(quán)利要求1或2所述的高致病性豬葡萄球菌的蛋白作為亞單位疫苗的方法,其特征在于：將豬葡萄球菌的分泌蛋白中加入佐劑、賦形劑、凍干穩(wěn)定劑，攪拌均勻，即成。

更進(jìn)一步地，所述的佐劑為水性佐劑或油性佐劑或其他佐劑混合使用，如本領(lǐng)域常見(jiàn)的白油佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑等等。所述賦形劑選自氨基乙酸。

進(jìn)一步地，所述高致病性豬葡萄球菌的蛋白的制備方法為：

1)細(xì)菌培養(yǎng)；

2)基因組DNA提?。?/p>

3)Acetate kinase基因克?。篜CR擴(kuò)增；

4)Acetate kinase表達(dá)載體構(gòu)建：所用原核表達(dá)載體為pET32a；

5)Acetate kinase重組蛋白表達(dá)；

6)重組Enolase過(guò)鎳柱純化。

本發(fā)明的有益效果是：高致病性豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)其蛋白enolase具有較好的免疫原性，保護(hù)率達(dá)到30％-40％，免疫小鼠和仔豬后能誘導(dǎo)較高抗體水平。攻毒保護(hù)力實(shí)驗(yàn)表明該蛋白能夠增強(qiáng)小鼠和仔豬對(duì)豬葡萄球菌的抵抗力，將其作為亞單位疫苗能夠預(yù)防豬葡萄球菌感染。

附圖說(shuō)明

圖1A為豬葡萄球菌蛋白ENO的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及其免疫原性分析結(jié)果；

圖1B為分離純化后的Acetate kinase重組蛋白(ACK)。

圖2為用純化Acetate kinase重組蛋白(ACK)處理后的BALB/c小鼠的血清細(xì)胞因子水平，其中，圖2A為注射ACK第3小時(shí)的結(jié)果；圖2B為注射ACK第24小時(shí)的結(jié)果。

圖3A，第一次免疫后28天ACK的抗體的水平；

圖3B，ACK免疫應(yīng)答小鼠的存活率。

具體實(shí)施方式

一種高致病性豬葡萄球菌的蛋白在作為預(yù)防豬葡萄球菌感染引起的豬滲出性表皮炎的亞單位疫苗中的應(yīng)用。所述豬葡萄球菌的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

制備所述的高致病性豬葡萄球菌的蛋白作為亞單位疫苗的方法為：將豬葡萄球菌的分泌蛋白中加入弗氏佐劑、賦形劑、凍干穩(wěn)定劑，攪拌均勻，即成。

所述高致病性豬葡萄球菌的蛋白的制備方法為：

1)細(xì)菌培養(yǎng)：將凍存的豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)菌種劃線接種于LB平板上，37℃振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)。2)基因組DNA提?。簩⑸鲜雠囵B(yǎng)菌液按照細(xì)菌基因組提取試劑方法提取基因組DNA；

2)基因組DNA提?。簩⑸鲜雠囵B(yǎng)菌液按照細(xì)菌基因組提取試劑方法提取基因組DNA；

3)Acetate kinase基因克?。阂陨鲜鯠NA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增應(yīng)，反應(yīng)體系：10×PCR buffer緩沖液2.5-5ul，Mg²⁺試劑5-10ul，PCR引物5-10ul，Taq DNA聚合酶2-5ul，加純化水補(bǔ)足至25ul；反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s、45℃30s、72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

4)Acetate kinase表達(dá)載體構(gòu)建：以pET32a為原核表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)酶切連接轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒，得到含目的基因的重組質(zhì)粒；

5)Acetate kinase重組蛋白表達(dá)：用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)重組蛋白；

6)重組Enolase過(guò)鎳柱純化。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.豬葡萄球菌的蛋白的免疫原性驗(yàn)證：

鑒定蛋白質(zhì)的免疫原性驗(yàn)證為了驗(yàn)證鑒定通過(guò)免疫蛋白質(zhì)組學(xué)分析獲得蛋白質(zhì)的免疫原性，取豬葡萄球菌的蛋白ACK進(jìn)行生物功能驗(yàn)證。通過(guò)SDS-PAGE分析，該ACK蛋白在大腸桿菌中高度正確地表達(dá)，如圖3所示。通過(guò)Westernblot分析證明重組ACK蛋白可與針對(duì)ZC-4的豬血清反應(yīng)，如圖3A所示。這表明這種蛋白表現(xiàn)出免疫原性。

使用Ni2+的瓊脂糖凝膠柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化后的免疫原性，結(jié)果如圖3B所示。

圖1A中，泳道：M，10kDa的-170kDa的預(yù)染蛋白分子量標(biāo)記；1，通過(guò)1mM IPTG誘導(dǎo)重組ACK；4，重組蛋白ACK的免疫印跡分析(與S.hycius感染的陽(yáng)性血清反應(yīng))。

圖1B中，泳道：M，10kDa的-170kDa的預(yù)染蛋白分子量標(biāo)記；2，純化的重組ACK。

2.豬葡萄球菌的蛋白對(duì)小鼠的免疫功能驗(yàn)證：

用純化的豬葡萄球菌的蛋白(ACK)對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行注射，收集小鼠血液樣本，并對(duì)收集的小鼠血液樣本的細(xì)胞因子水平進(jìn)行測(cè)定，并在第3小時(shí)和第24小時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)芯片測(cè)定白細(xì)胞介素(IL)-6，IL-8，IL-12和INF-γ，在第3小時(shí)和第24小時(shí)這兩組小鼠G-CSF和MCP-5的水平顯著升高(P<0.05)，IL-12p40p70顯著增加(P<0.05)。結(jié)果如圖2所示。

3.豬葡萄球菌的蛋白(ACK)作為對(duì)S.hycius亞單位疫苗在小鼠體內(nèi)的血免疫保護(hù)試驗(yàn)：

于0，7，14，21和28天從免疫小鼠和對(duì)照小鼠的尾靜脈收集血液，通過(guò)ELISA測(cè)量這些時(shí)間內(nèi)抗體的水平。28天第一次免疫后(圖3A)得到的值。結(jié)果表明，治療組的抗體水平明顯高于PBS中的抗體水平，PBS組的血清是作為陰性對(duì)照，HIS治療組和PBS組無(wú)顯著差異(P<0.05)。

為了評(píng)估針ACK蛋白疫苗對(duì)S.hycius ZC-4感染的預(yù)防效果，用300uL2.8×10⁹CFU/毫升ACK對(duì)S.hycius小鼠進(jìn)行免疫應(yīng)答。PBS和他組小鼠在免疫12小時(shí)死亡，24小時(shí)后，兩組有83.3％(5/6)和80％(4/5)的死亡率。而在ACK免疫組小鼠開(kāi)始挑戰(zhàn)后12小時(shí)后死亡，24小時(shí)后，他們有60％(3/5)的死亡率。ACK，HIS和對(duì)照組有5只小鼠，PBS組有6只小鼠，對(duì)照組不感染S.hycius ZC-4，于免疫后0，6，20，48，60，72小時(shí)觀察到的生命或死亡情況(圖3B)。

上述結(jié)果表明，用ACK免疫小鼠后可以預(yù)防小鼠感染豬葡萄球菌S.hycius ZC-4。

以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過(guò)上述的說(shuō)明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說(shuō)明書(shū)上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來(lái)確定其技術(shù)性范圍。