本發(fā)明涉及血紅蛋白氧載體類的血液代用品技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

輸血作為一種生命救治的重要手段，在臨床手術(shù)、抗災(zāi)及戰(zhàn)傷救治中應(yīng)用廣泛。但受血源緊張、血液儲存期短及血源性疾病傳播等原因的影響，傳統(tǒng)輸血技術(shù)愈來愈無法滿足在緊急狀況下的需求。因此，合成能大規(guī)模生產(chǎn)的安全有效的血液代用品一直受到研究者的關(guān)注。

能否模擬紅細(xì)胞的攜氧功能是評價血液代用品有效性的重要標(biāo)準(zhǔn)。這一功能是通過紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白和氧氣的結(jié)合與解離的動態(tài)平衡而實現(xiàn)的。血紅蛋白能夠作為氧載體正是由于血紅蛋白的載氧釋氧能力能夠滿足機(jī)體在急性失血性休克等條件下的供氧需求。然而脫離了紅細(xì)胞的無基質(zhì)血紅蛋白由于容易解聚成二聚體，體內(nèi)循環(huán)周期短，直接與血管壁接觸導(dǎo)致血管收縮，而無法作為理想的氧載體。因此，為了克服無基質(zhì)血紅蛋白的缺陷，當(dāng)今血液代用品領(lǐng)域的研究者們致力于將具有良好生物相容性的包材包裹血紅蛋白，形成與紅細(xì)胞類似具有立體結(jié)構(gòu)的復(fù)合微囊，這種復(fù)合微囊既保持了血紅蛋白的功能，又避免了血紅蛋白與周圍組織及血液中其他成分直接作用，可有效防止血管收縮，避免腎毒性。

近年來，微囊包裹類血紅蛋白用作氧載體(也可稱為“微囊包裹類血紅蛋白氧載體”)的研發(fā)已經(jīng)取得一定進(jìn)展。例如，研究者們成功地以聚乳酸、聚碳酸酯、聚乙二醇等高分子材料及其嵌段共聚物為包材制得了具備一定載氧功能的微囊狀氧載體。然而，這種微囊狀氧載體由于囊內(nèi)缺乏紅細(xì)胞所含有的還原酶系統(tǒng)，血紅蛋白易發(fā)生自氧化，從而損害其攜氧功能，輸注機(jī)體后易導(dǎo)致周圍細(xì)胞及組織的氧化損傷。

目前微囊包裹類血紅蛋白氧載體的制備方法主要有復(fù)乳法和納米沉積法。復(fù)乳法是將血紅蛋白原液分散于含有聚合物包材的有機(jī)溶液中，通過高速攪拌得到初乳，將初乳與含有穩(wěn)定劑的外水相混合后形成復(fù)乳，再通過旋蒸或抽提去除復(fù)乳中的有機(jī)溶劑；在去除有機(jī)溶劑的過程中溶于其中的聚合物包材發(fā)生凝聚或固化，包裹血紅蛋白形成微囊復(fù)合物。納米沉積法是將高分子材料分散于水溶性有機(jī)溶劑中作為油相，以加入了一定量表面活性劑的血紅蛋白原液為水相，在磁力攪拌下，將油相滴加到水相中形成乳液，再通過旋蒸或抽提去除乳液中的有機(jī)溶劑，去除過程中高分子材料沉積于血紅蛋白表面，形成納米微囊?？梢?，復(fù)乳法和納米沉積法的反應(yīng)體系都比較復(fù)雜，都需通過旋蒸或抽提等繁瑣操作去除有機(jī)溶劑。

因此，尋找具備一定抗氧化性能的包材包裹血紅蛋白，抑制血紅蛋白自氧化進(jìn)程，維持其載氧功能，其制備工藝簡單、高效、適合大規(guī)模生產(chǎn)，對于血液代用品的研發(fā)具有深刻意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，第一方面，提供一種可降低血紅蛋白氧化損傷的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體，由聚多巴胺包裹血紅蛋白得到，所述氧載體為聚多巴胺包裹血紅蛋白形成的納米微囊。

該氧載體平均粒徑分布為6nm-16nm，氧載體的多分散系數(shù)PDI為0.15-0.70，氧載體氧飽和度為50％時的氧分壓P50值為11mmHg-17mmHg；

其中，氧載體的平均粒徑分布優(yōu)選6.2-15.3nm，更優(yōu)選6.9nm-11.5nm，最優(yōu)選7.4nm；氧載體的多分散系數(shù)PDI優(yōu)選0.154-0.664，更優(yōu)選0.179-0.331，最優(yōu)選0.243。

第二方面，本發(fā)明提供一種制備上述聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的方法，包括以下步驟：

(1)提取血紅蛋白，得到血紅蛋白原液；

(2)配制多巴胺溶液；

(3)將步驟(1)的血紅蛋白原液與步驟(2)的多巴胺溶液混合，進(jìn)行多巴胺的聚合反應(yīng)及聚多巴胺包裹血紅蛋白的負(fù)載反應(yīng)，得到聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體。

步驟(3)血紅蛋白原液中血紅蛋白與多巴胺的質(zhì)量比為(2-61)：1，優(yōu)選(2-15)：1，更優(yōu)選(4-13)：1，最優(yōu)選為5:1。

步驟(3)具體為：

在溫度為2-6℃下(優(yōu)選4℃)，將步驟(1)得到的血紅蛋白原液與步驟(2)得到的多巴胺溶液混合后，加入Tris-HCl緩沖液(1mol/L,pH8.5)反應(yīng)0.5-24h(優(yōu)選為2-12h，更優(yōu)選為2-5h，最優(yōu)選為3.5h)，直至無游離血紅蛋白，停止反應(yīng)，得到聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體。

Tris-HCl緩沖液的加入體積為多巴胺溶液體積的2％-4％。

步驟(1)具體為：

將新鮮的牛全血于4℃，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，棄去上清液，經(jīng)超濾和濃縮得到紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞置于蒸餾水中低滲裂解得到血紅蛋白初產(chǎn)品，通過陰離子交換色譜提取出濃度為24.4mg/ml的血紅蛋白原液；

步驟(2)具體為：

將多巴胺溶于水中，制成濃度為0.4mg/ml-12.5mg/ml(優(yōu)選2.0mg/ml-12.5mg/ml，更優(yōu)選2.0mg/ml-5.0mg/ml，最優(yōu)選4.88mg/ml)的多巴胺溶液。

步驟(3)具體為：

在溫度為2-6℃下(優(yōu)選4℃)，將步驟(1)得到的血紅蛋白原液與步驟(2)得到的多巴胺溶液等體積混合后，向反應(yīng)體系中加入1mol/L，pH8.5的Tris-HCl緩沖液反應(yīng)0.5-24h(優(yōu)選為2-12h，更優(yōu)選為2-5h，最優(yōu)選為3.5h)，直至檢測不到游離血紅蛋白時停止反應(yīng)；多巴胺迅速發(fā)生自身氧化聚合，形成聚多巴胺，同時負(fù)載于血紅蛋白表面，得到黑色的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體。

第三方面，本發(fā)明提供一種聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體，是由上述方法制備得到。

第四方面，本發(fā)明提供上述聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體或上述方法制備得到的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體在血液代用品中的應(yīng)用，將所述氧載體應(yīng)用在輸血過程(創(chuàng)傷、失血、貧血、手術(shù)等引起的)中，部分或全部替代紅細(xì)胞發(fā)揮攜/放氧功能，其氧飽和度為50％時的氧分壓P₅₀在11.00mmHg以上。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的微囊粒徑較小，為納米級別，分布均勻，體系穩(wěn)定，無團(tuán)聚現(xiàn)象。

(2)本發(fā)明的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體不會引起紅細(xì)胞聚集，不引起溶血，不會影響凝血功能，不會造成細(xì)胞毒性，具有良好的血液相容性和生物安全性。

(3)本發(fā)明的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體不會破壞血紅蛋白的化學(xué)組成及二級結(jié)構(gòu)，保證了其生理功能的正常發(fā)揮。

(4)本發(fā)明的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體能夠有效地載氧釋氧，氧親和力較高，還兼有較好的抗氧化性能，能夠有效抑制血紅蛋白的自氧化，可清除各種自由基及紅細(xì)胞內(nèi)的活性氧，解決了當(dāng)前血紅蛋白氧載體容易發(fā)生氧化損傷等的問題。

(5)本發(fā)明的制備工藝簡單、耗時短，僅需將血紅蛋白浸入多巴胺溶液中，調(diào)節(jié)pH至弱堿性后多巴胺即能發(fā)生自身氧化、聚合并負(fù)載于血紅蛋白表面形成納米微囊，避免了有機(jī)溶劑的引入與去除，傳統(tǒng)方法中的揮發(fā)固化、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等繁瑣操作，適于大規(guī)模生產(chǎn)。

因此，本發(fā)明的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體因其簡單的合成工藝，完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)，良好的攜氧能力、血液相容性、生物安全性和抗氧化性，具有廣泛的血液代用品應(yīng)用前景，在醫(yī)藥領(lǐng)域可發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1所示為本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的透射電鏡觀察結(jié)果圖；

圖2所示為本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的粒徑分布圖；

圖3所示為本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的紫外-可見光譜圖；

圖4所示為本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的紅外光譜圖；

圖5所示為本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的圓二色光譜圖；

圖6所示為實施例1聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的紅細(xì)胞聚集實驗結(jié)果；

圖7所示為實施例2聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的溶血實驗結(jié)果；

圖8所示為實施例3聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的凝血實驗結(jié)果；

圖9所示為實施例4聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的體外細(xì)胞毒性實驗結(jié)果；

圖10所示為實施例5聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的氧解離曲線；

圖11所示為實施例6聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的鐵還原能力實驗結(jié)果；

圖12所示為實施例7聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的高鐵血紅蛋白還原能力實驗結(jié)果；

圖13A所示為實施例8聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的ABTS自由基清除能力定性實驗結(jié)果；

圖13B所示為實施例8聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的ABTS自由基清除能力定量實驗結(jié)果；

圖14A所示為實施例9聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的DPPH自由基清除能力定性實驗結(jié)果；

圖14B所示為實施例9聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的DPPH自由基清除能力定量實驗結(jié)果；

圖15所示為實施例10聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的紅細(xì)胞內(nèi)ROS清除能力熒光成像結(jié)果。

具體實施方式

在血液代用品領(lǐng)域，業(yè)者通常使用聚乳酸、聚碳酸酯、聚乙二醇等高分子材料及其嵌段共聚物為包材制得具備一定載氧功能的微囊狀氧載體，由于其在使用中效果不理想，因此發(fā)明人通過大量實驗的摸索與研究，從眾多的載體材料中選擇了具備一定抗氧化性能的包材聚多巴胺。

聚多巴胺目前是廣泛用于生物材料表面改性及藥物包埋與釋放的一種高分子材料。Ruikang Tang等人發(fā)現(xiàn)聚多巴胺可以有效地封閉紅細(xì)胞表面的抗原，避免凝集反應(yīng)，同時紅細(xì)胞一般的生理功能，如運輸O₂和CO₂并未受到影響。Yuzhi Wang等人構(gòu)建了以硅-四氧化三鐵為基底的聚多巴胺分子印記涂層，利用硅-四氧化三鐵基底表面的與血紅蛋白粒徑大小相當(dāng)?shù)慕榭捉Y(jié)構(gòu)固定血紅蛋白，用來篩選和識別牛血紅蛋白。Inkyu Lee等發(fā)現(xiàn)120μg的聚多巴胺涂層可以有效地清除85％的DPPH自由基。

總之，聚多巴胺在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢在于：1.具有類似于貽貝黏附蛋白的結(jié)構(gòu)，黏附性能超強(qiáng)，幾乎能負(fù)載于任何材料的表面；2.制備工藝簡單，將多巴胺加入到弱堿性溶液中即能發(fā)生自身聚合得到聚多巴胺產(chǎn)物；3.生物相容性好，適于生物材料的負(fù)載與改性。

雖然聚多巴胺已應(yīng)用于多種生物材料表面，但其在血液代用品領(lǐng)域的應(yīng)用尚未見報道。發(fā)明人利用聚多巴胺簡單的制備工藝，超強(qiáng)的黏附性能和良好的生物相容性，使得其發(fā)揮成為良好的血紅蛋白氧載體的潛力。特別地，聚多巴胺具備一定的自由基清除能力，因而能減輕氧載體氧化損傷、血紅蛋白自氧化等副作用。

制備本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的方法，包括以下步驟：

(1)、血紅蛋白的提?。簩⑿迈r的牛全血于4℃，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min。棄去上清液，經(jīng)超濾和濃縮得到紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞置于蒸餾水中低滲裂解得到血紅蛋白初產(chǎn)品。通過陰離子交換色譜提取出濃度為24.4mg/ml的血紅蛋白原液。

(2)、多巴胺溶液的配制：配制0.4mg/ml-12.5mg/ml(優(yōu)選2.0mg/ml-12.5mg/ml，更優(yōu)選2.0mg/ml-5.0mg/ml，最優(yōu)選4.88mg/ml)的多巴胺溶液。

(3)、聚多巴胺的聚合和負(fù)載：在溫度為2-6℃下(優(yōu)選4℃)，將步驟(1)得到的血紅蛋白原液與步驟(2)得到的多巴胺溶液等體積混合后，向反應(yīng)體系中加入Tris-HCl緩沖液(1mol/L,pH8.5)反應(yīng)0.5-24h(優(yōu)選為2-12h，更優(yōu)選為2-5h，最優(yōu)選為3.5h)，多巴胺迅速發(fā)生自身氧化聚合，形成聚多巴胺，同時負(fù)載于血紅蛋白表面，得到黑色的聚多巴胺包裹血紅蛋白的納米微囊，即聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體；Tris-HCl緩沖液的加入體積為多巴胺溶液體積的2％-4％。每隔0.5h通過血氣分析儀測定反應(yīng)體系內(nèi)游離血紅蛋白的含量，當(dāng)檢測不到游離血紅蛋白時停止反應(yīng)，得到懸浮有黑色聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的氧載體溶液(氧載體呈黑色是由包裹在血紅蛋白表面的聚多巴胺呈黑色所致，因氧載體微粒尺寸很小，離心難以使其沉降，因此沒有進(jìn)行分離操作)。

以下結(jié)合具體實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明進(jìn)行限制。

實施例：

按上述方法制備得到一系列聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體，見表1；并列出氧載體的平均粒徑分布、多分散系數(shù)PDI(PDI為反映納米粒子分散性的指標(biāo)，其數(shù)值越小，表明納米粒子粒徑越集中，分散越均一)和氧載體的P50值。

表1實施例聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的參數(shù)

由表1中數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明提供的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體平均粒徑分布為6nm-16nm，氧載體的多分散系數(shù)PDI為0.15-0.70，氧載體的P50值為11mmHg-17mmHg。其中，氧載體的平均粒徑分布優(yōu)選6.2-15.3nm，更優(yōu)選6.9nm-11.5nm，最優(yōu)選7.4nm；氧載體的多分散系數(shù)PDI優(yōu)選0.154-0.664，更優(yōu)選0.179-0.331，最優(yōu)選0.243。

實驗一：物理特征表征

采用透射電鏡觀察實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的形貌特征，采用動態(tài)光散射測定本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的粒徑分布情況。以實施例3的結(jié)果為例，氧載體的形貌特征見圖1，粒徑分布情況見圖2(圖中Hb是血紅蛋白原液(Hemoglobin)的英文簡稱，Hb@PDA是聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的簡稱，其它圖中也表示此含義)。

圖1表明：本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體為納米級的微囊，這些微囊呈均勻分布的球形粒子，體系穩(wěn)定，無團(tuán)聚現(xiàn)象。圖2表明：本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的粒徑分布區(qū)間為6-8nm，粒徑分布圖在7nm處出現(xiàn)一單一、集中的峰，說明氧載體尺寸均一可控。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗二：化學(xué)特征表征

采用分光光度計測定實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體在220-650nm處的紫外-可見光譜，采用紅外光譜儀測定本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體2000cm^-1-500cm^-1的紅外光譜，分析其化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)特征。通過圓二色譜(譜帶寬度：2nm；波長范圍：250–190nm；樣品池規(guī)格：1cm)分析實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體內(nèi)血紅蛋白二級結(jié)構(gòu)的完整性。以實施例2的結(jié)果為例，紫外-可見光譜見圖3，紅外光譜見圖4，圓二色譜圖見圖5。

圖3表明血紅蛋白原液(Hb)在414nm、540nm、574nm出現(xiàn)特征峰，聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體(Hb@PDA)不僅保留了血紅蛋白的特征峰，還在279nm處的存在特征峰，這是聚多巴胺的吸收所致，說明了Hb@PDA中聚多巴胺的存在。

圖4表明血紅蛋白原液(Hb)在1643cm^-1、1528cm^-1處有特征吸收，1643cm^-1處的特征峰是血紅蛋白中的C-O伸縮振動所致，1528cm^-1處的特征峰是血紅蛋白中的N-H彎曲振動所致；而聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體(Hb@PDA)保留了血紅蛋白原液的紅外光譜特征的同時，在875cm^-1和809cm^-1處出現(xiàn)了新的特征吸收，875cm^-1和809cm^-1處的特征峰是聚多巴胺中苯環(huán)的5、3取代基的伸縮振動所致。

圖3與圖4的結(jié)果共同表明聚多巴胺成功地負(fù)載了血紅蛋白，且血紅蛋白的結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。

圖5可以看出聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體(Hb@PDA)與血紅蛋白原液(Hb)均在194、210和224nm處有特征峰，這是血紅蛋白所含有的α螺旋結(jié)構(gòu)所致。用圓二色譜儀測試軟件計算得到二者所含有的α螺旋結(jié)構(gòu)的比例較接近，分別為93.1％和94.8％，這說明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體保持了血紅蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗三：血液相容性——紅細(xì)胞聚集實驗

分別將960μl 400μg/mL的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體、960μl 4％琥珀酰明膠(GEL:16000-26600Da,PI 4.5±0.3，購于貝朗醫(yī)療有限公司，)和960μl生理鹽水與40μl的2％紅細(xì)胞懸浮液相混合，即為實驗組、陽性對照組和陰性對照組。于37℃下孵育1h后，用電鏡觀察紅細(xì)胞聚集情況，以實施例1的結(jié)果為例，見圖6，其中從左至右分別對應(yīng)實驗組、陰性對照組和陽性對照組。

圖6可以看出，陽性對照組中可觀察到多個紅細(xì)胞的堆積群，聚集現(xiàn)象明顯；而實驗組和陰性對照組中，視野下的紅細(xì)胞均呈均勻的分散狀態(tài)，未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。說明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體不會引起紅細(xì)胞的聚集，不改變紅細(xì)胞的流變特性。

實驗四：血液相容性——溶血實驗

分別取實施例1-10的濃度分別為200μg/mL、400μg/ml的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體溶液各0.2ml與1ml生理鹽水混合孵育1h，隨后分別加入0.2ml紅細(xì)胞懸液，再孵育1h，作為實驗組。將0.2ml紅細(xì)胞懸液與1ml生理鹽水的混合液作為陰性對照組，0.2ml紅細(xì)胞懸液與1ml蒸餾水的混合液作為陽性對照組。然后分別以3000rpm離心10min，棄去沉淀物。分別測定實驗組、陰性對照組、陽性對照組離心后的上清液在545nm處的吸光度，記為D_t、D_-、D₊,溶血率＝(D_t-D_-)/(D₊-D_-)×100％，以實施例2的結(jié)果為例，見圖7。

由圖7可知：陰性對照組的溶血率為0，陽性對照組的溶血率為0.95％，而加入了200μg/ml和400μg/ml聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體后的紅細(xì)胞懸液的溶血率僅為0.02％，說明本發(fā)明的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體不會引起溶血。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗五：血液相容性——凝血實驗

將1ml貧血小板血漿與50μl 4mg/ml的實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體溶液混合孵育1h，作為實驗組；將1ml貧血小板血漿與50μl的生理鹽水混合孵育1h，作為陽性對照組；然后測定實驗組和對照組的凝血時間，以實施例3的結(jié)果為例，見圖8。

圖8表明：與對照組相比，加入了聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體后，血漿的凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)及纖維蛋白原含量(Fbg)均未發(fā)生明顯變化，說明本發(fā)明的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體不會對血小板的凝血功能造成影響。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗六：生物安全性——細(xì)胞毒性檢測

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)接種于96孔板中，于37℃、5％CO₂條件下預(yù)培養(yǎng)24h，分別加入PBS緩沖液(對照組)、濃度分別為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml的實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體(具體加樣情況見表3，實驗組)，孵育24h后向各孔中分別加入cck-8溶液(購自碧云天生物技術(shù)研究所)，再孵育2h，測定各組在450nm處的吸光度值。聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體組的測定值記為D_t，PBS組的測定值記為D₊，不含HUVEC的孵育體系(空白組)的測定值記為D-。細(xì)胞存活率＝(D_t-D-/D₊-D-)×100％，以實施例4的結(jié)果為例，見圖9。

表3各組加樣的組分及各組分體積

圖9表明：與對照組相比，濃度不超過1mg/ml的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的孵育體系的細(xì)胞存活率均未發(fā)生變化，說明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體不會造成細(xì)胞毒性，具有較好的生物安全性。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗七：聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的功能評價——攜放氧功能

將4mg/ml實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體溶液1.5ml與4ml pH7.4的Hemoscan緩沖液(購自北京凱正生物工程有限責(zé)任公司)混勻，控制反應(yīng)體系的溫度為37℃，用血氧分析儀測定反應(yīng)體系的氧解離曲線及P50(氧飽和度為50％時的氧分壓)。采用同樣的方法得到血紅蛋白原液的氧解離曲線和P50。以實施例5的結(jié)果為例，氧解離曲線及P50見圖10，其中Hb@PDA表示本發(fā)明的氧載體，Hb表示血紅蛋白原液。

圖10表明：本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體與血紅蛋白原液的氧解離曲線相似，說明其具備載氧釋氧的能力。P50值是血紅蛋白氧飽和度達(dá)50％時對應(yīng)的氧分壓，P50值越低，氧親和力越高。聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的P50值為13.86mmHg，血紅蛋白原液的P50為25.38mmHg，這說明血紅蛋白經(jīng)聚多巴胺包裹后對氧氣的親和力提高了，更適于局部缺血組織的供氧，避免氧載體未到達(dá)需氧組織之前就提前釋放氧氣，具有更高的生物利用度。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗八：聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的功能評價——鐵還原能力和高鐵血紅蛋白還原能力

鐵還原能力：

鐵還原能力的檢測原理為：在酸性條件下Fe³⁺可與TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪)形成復(fù)合物Fe³⁺-TPTZ，而抗氧化物可將Fe³⁺-TPTZ還原為藍(lán)色的Fe²⁺-TPTZ，在593nm測定藍(lán)色的Fe²⁺-TPTZ的吸光度，從而反映抗氧化物的鐵還原能力。

分別將5μl不同濃度實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體溶液、血紅蛋白原液和10mM Trolox溶液(Trolox即水溶性維生素E，是公知的抗氧化試劑)與FRAP工作液180μl(即Ferric Reducing Ability of Plasma工作液，由TPTZ溶液15μl、TPTZ稀釋液150μl、檢測液15μl混合而成，購于碧云天生物技術(shù)研究所)混合后孵育5min，分別作為實驗組、陰性對照組和陽性對照組，具體加樣情況見表4，然后分別測定各組在593nm的吸光度，以實施例6的結(jié)果為例，見圖11。

表4各組加樣情況

圖11中右上角的小圖表明：本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體在593nm處的特征吸收不僅比陰性對照組的血紅蛋白原液顯著增強(qiáng)，也比陽性對照組顯著增強(qiáng)，說明本發(fā)明的氧載體不僅具備的鐵還原能力，其還原能力比Trolox更強(qiáng)。圖11的大圖說明：隨著聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體加入量的增多，593nm處的特征吸收逐漸增強(qiáng)，說明增加氧載體的用量有利于提高其抗氧化效果。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

高鐵血紅蛋白還原能力：

鐵還原能力檢測表明的是聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體對其囊內(nèi)的血紅蛋白的卟啉鐵的還原作用，能夠抑制其自氧化進(jìn)程；而高鐵血紅蛋白還原能力檢測表明的是氧載體對周圍環(huán)境中的高鐵血紅蛋白的還原作用，從而能夠間接提示其對整個機(jī)體或輸注后的周圍組織有一定的減弱氧化損傷的效果，因此還進(jìn)行了高鐵血紅蛋白還原能力檢測：分別將1mL 4mg/ml實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體溶液與1mL高鐵血紅蛋白混合作為實驗組、將2mL血紅蛋白原液作為陽性對照組、2mL高鐵血紅蛋白作為陰性對照組，三組于室溫下混合孵育30min，采用分光光度計測定各組在370-670nm下的紫外-可見光譜。以實施例7的結(jié)果為例，見圖12，其中右側(cè)的兩幅小圖是對大圖中450-650nm區(qū)間的局部放大圖。

圖12表明：血紅蛋白原液在414nm、540nm、574nm處存在特征峰，而高鐵血紅蛋白在406nm和500nm處存在特征峰。將高鐵血紅蛋白與聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體混合孵育后，與高鐵血紅蛋白組相比，光譜特征發(fā)生以下改變：406nm處的特征峰紅移至414nm，更接近血紅蛋白原液的光譜特征；500nm處的特征峰消失；出現(xiàn)了540nm和574nm的特征峰。以上改變反映了高鐵血紅蛋白與氧載體的混合液更接近血紅蛋白原液的光譜特征，說明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體具有一定的還原高鐵血紅蛋白的能力。

血紅蛋白的載氧-釋氧功能是借助其含有的亞鐵離子與氧氣結(jié)合-釋放的動態(tài)過程實現(xiàn)的。當(dāng)血紅蛋白發(fā)生自氧化時，亞鐵離子被氧化為正鐵離子，即成為了高鐵血紅蛋白。而高鐵血紅蛋白無法與氧氣穩(wěn)定結(jié)合，喪失了攜氧功能，且血紅蛋白自氧化常伴隨血紅素的降解，導(dǎo)致鐵離子釋放，造成周圍細(xì)胞和組織的損傷。本發(fā)明中的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體具備的高鐵血紅蛋白還原能力，即將無法結(jié)合氧氣的正鐵離子還原為可發(fā)揮攜氧功能的亞鐵離子，減少血紅蛋白自氧化對其攜氧功能的損害。這初步反映了其可還原輸注及循環(huán)部位的周圍環(huán)境中的高鐵血紅蛋白，具有減弱機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的意義。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗九：聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的功能評價——ABTS自由基清除能力

ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)自由基在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟聲谎趸删G色的ABTS⁺，抗氧化物存在時ABTS⁺的產(chǎn)生會被抑制，在734nm或405nm測定ABTS⁺的吸光度即可計算出抗氧化物的總抗氧化能力。分別將10μl實施例1-10的含聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體0.3μg、0.7μg、1.0μg、1.4μg、1.7μg的氧載體溶液、血紅蛋白原液、Trolox溶液與200μlABTS工作液(由ABTS溶液100μl和氧化劑100μl溶液混合而成，購于碧云天生物技術(shù)研究所)混合孵育5min，作為實驗組，測定實驗組在690-810nm下的紫外-可見光譜。采用PBS緩沖液作陰性對照，按照同上操作進(jìn)行。記實驗組的吸光度為A_t，陰性對照組的吸光度為A，清除率(％)＝(A-A_t)/A×100％。以實施例8的結(jié)果為例，見圖13A和圖13B，其中，圖13A中的三條線分別是Hb、Trolox和氧載體，而圖13B中是不同含量的氧載體溶液。

圖13A的定性分析結(jié)果顯示：與血紅蛋白原液相比，聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體在734nm處的特征吸收顯著減弱，說明本發(fā)明氧載體能夠抑制ABTS⁺的產(chǎn)生，具有ABTS自由基清除能力；圖中還可看出，本發(fā)明氧載體在734nm處的特征吸收比Trolox減弱得更多，說明本發(fā)明氧載體對ABTS⁺的抑制效果更顯著，具有比Trolox顯著增強(qiáng)的ABTS自由基清除能力。圖13B的定量分析結(jié)果顯示：聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體加入量為1.7μg時的清除率可達(dá)89％，說明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體對ABTS自由基有很好的清除效果。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗十：聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的功能評價——DPPH自由基清除能力

DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基)分子中含多個吸電子的-NO₂和苯環(huán)的大π鍵，氮自由基能夠穩(wěn)定存在。當(dāng)DPPH自由基被清除，其最大吸收波長520nm處的吸光度值隨之減少。分別將10μl實施例1-10的含聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體0.3μg、0.7μg、1.0μg、1.4μg、1.7μg的氧載體溶液、血紅蛋白原液和Trolox溶液與200μl DPPH工作液(取DPPH 0.005g溶于約125mL乙醇溶劑中配制而成，購自Sigma-Aldrich公司)混合孵育30min，作為實驗組，測定實驗組在500-620nm的紫外-可見吸收光譜。采用PBS緩沖液作陰性對照組，按照同上操作進(jìn)行。記實驗組的吸光度為A_t，陰性對照組的吸光度為A，清除率(％)＝(A-A_t)/A×100％。以實施例9的結(jié)果為例，見圖14A和圖14B，圖14A中，三條曲線分別代表血紅蛋白原液、聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體和Trolox溶液。

圖14A的定性分析結(jié)果顯示：與血紅蛋白原液相比，聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體在520nm處的特征吸收顯著減弱，說明本發(fā)明氧載體能夠清除DPPH自由基，具有DPPH自由基清除能力；圖中還可看出，本發(fā)明氧載體在520nm處的特征吸收比Trolox減弱得更多，說明本發(fā)明氧載體對DPPH的清除效果更顯著，具有比Trolox顯著增強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。圖14B的定量分析結(jié)果顯示：聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體含量為1.7μg時的清除率達(dá)49％，說明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體對DPPH自由基有較好的清除效果。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

實驗十一：聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體的功能評價——紅細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)清除能力

DCFH-DA可自由地通過細(xì)胞膜，隨后水解為DCFH，DCFH可被ROS氧化為具有強(qiáng)熒光的DCF。向5ml紅細(xì)胞懸液內(nèi)加入4mg/ml實施例1-10的聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體溶液100μl，攪拌分散，2h后加入33μg/ml的雙氧水3μl，于37℃孵育1h，孵育過程中每隔0.5h加入1mM DCFH-DA溶液2mL，孵育結(jié)束后以1000g離心7min，去除上清后，加入生理鹽水復(fù)懸紅細(xì)胞，重復(fù)3次，作為實驗組。以等量的紅細(xì)胞懸液為陰性對照組，加入雙氧水的紅細(xì)胞懸液作陽性對照組。采用倒置顯微鏡得到熒光成像，通過熒光區(qū)域面積對各組中的ROS產(chǎn)生量進(jìn)行定性監(jiān)測。以實施例10的結(jié)果為例，見圖15，

圖15顯示：陰性對照組由于沒有加入H₂O₂不產(chǎn)生ROS，未出現(xiàn)熒光區(qū)域，與陰性對照組相比，實驗組和陽性對照組可明顯檢測到熒光成像，與陽性對照組相比，實驗組的熒光面積明顯變小，光強(qiáng)變?nèi)?。結(jié)果說明本發(fā)明聚多巴胺包裹血紅蛋白氧載體有效地抑制了紅細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成,從而減少活性氧對細(xì)胞和組織的攻擊，減弱氧化應(yīng)激損傷。

其它實施例也有類似結(jié)果，不再一一贅述。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。