本發(fā)明涉及一種佐劑，尤其是一種用于疫苗的復合佐劑，還涉及含有復合佐劑的疫苗及疫苗的制備方法，屬于免疫學領域。
背景技術：
近年來，隨著疫苗研究的不斷深入，特別是分子生物學技術的迅速發(fā)展，研制出的新型基因工程疫苗純度高、特異性強，但分子小，免疫原性相對較弱，難以產生有效的免疫應答，因此應用佐劑來增強其免疫原性就顯得尤為重要。
現(xiàn)有疫苗佐劑存在有價格昂貴、增強免疫應答效果不夠顯著等缺點，目前，已認證應用于人類的佐劑仍寥寥無幾，鋁鹽佐劑就是其中之一。鋁鹽佐劑在提高抗體水平和安全方面已獲得長期的實踐證實，目前的研究認為鋁佐劑是利用包裹抗原使抗原緩慢釋放后，不斷刺激免疫系統(tǒng)，誘導持續(xù)高效免疫應答的機制從正面增強機體抵御病原體的能力。但這樣的正面促進作用并不完全，因為在免疫應答過程中，機體為避免免疫過激導致的損傷會產生許多免疫負調控分子，抑制免疫細胞的功能，減弱免疫細胞對抗原的清除作用。吲哚胺-2,3雙加氧酶(Indolea mine-2,3 dioxygenase,IDO)就是其中一類免疫抑制分子，炎癥環(huán)境中，IDO大量表達后，直接抑制T細胞的活化和增殖，同時促進調節(jié)性T細胞的作用，影響免疫應答。那么對該類分子活性的抑制，將會排除其對免疫細胞的干擾，促進機體對抗原有效的正向應答。
4-苯基咪唑(4-Phenylimidazole,4-PI) ，是一種類白色-淡黃色粉末狀固體化合物，價格便宜溶解性好，安全，化學上常用作有機合成中間體，目前主要用于藥物研發(fā)早期階段合成篩選小分子酶制劑的中間體片段，是生物化學研究中血紅素的配體，吲哚胺-2,3雙加氧酶(Indoleamine-2,3 dioxygenase,IDO)的非競爭性抑制劑，能夠與IDO活性部位血鐵紅素結合，抑制IDO的活性，解除其對T細胞活化增殖的抑制，恢復甚至加強機體對病毒的自主免疫。
利用病毒抗原結合IDO抑制劑，輔助疫苗共同作用機體，可能會誘導針對病毒的高效免疫應答，促進疫苗的接種，IDO抑制劑具有佐劑研究的價值，將為病毒性肝炎的控制與治療提供更廣闊的前景，目前，尚未出現(xiàn)將IDO非競爭性抑制劑和鋁鹽復合用于疫苗佐劑的研究報道。
技術實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有疫苗佐劑存在的價格昂貴、促進免疫應答效果不顯著等問題，本發(fā)明提供一種經濟、有效、安全、穩(wěn)定的復合佐劑、含有該復合佐劑的疫苗以及該疫苗的制備方法，具體方案如下：
一種復合佐劑，所述復合佐劑包括吲哚胺-2,3雙加氧酶的非競爭性抑制劑和鋁鹽，所述吲哚胺-2,3雙加氧酶的非競爭性抑制劑是4-苯基咪唑，所述鋁鹽是的氫氧化鋁，所述復合佐劑是0.5-1.5mg的4-苯基咪唑+300μg的氫氧化鋁，該含量以每單份疫苗液用量計，4-苯基咪唑分子式為C9H8N2，與現(xiàn)有合成佐劑性質不同，4-苯基咪唑能解除吲哚胺-2,3雙加氧酶對免疫功能的抑制作用，抑制免疫的負調控，促進免疫應答。
進一步地，作為一個優(yōu)選，所述的4-苯基咪唑含量為1mg；
一種包括所述的復合佐劑的疫苗，所述疫苗還包括疫苗液、75%乙醇和PBS，所述75%乙醇的用量為3.8-10.4μL。
所述75%乙醇是指質量濃度為75%的醫(yī)用乙醇。
本申請還包括一種所述的疫苗的制備方法，包括如下步驟：
（1）準備75%乙醇、疫苗液；
（2）在75%乙醇中加入0.5-1.5mg的4-苯基咪唑，待4-苯基咪唑完全溶解后加入300μg的氫氧化鋁，混合均勻，得復合佐劑混合液；
（3）在步驟（2）的混合液中加入每單份疫苗液；
（4）往步驟（3）的含復合佐劑的疫苗中加入1×PBS（磷酸鹽緩沖液）至300μL，混合均勻，得到含復合佐劑的疫苗。
進一步地，所述75%乙醇的用量為3.8-10.4μL。
進一步地，所述的PBS的PH=7.4。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點和效果：（1）本申請的復合佐劑原料易得，疫苗制備工藝簡單，成本低，性能穩(wěn)定，毒副作用小，既能促進機體的免疫正調節(jié)又能抑制免疫負調控，有效提高了免疫應答水平，在免疫劑量范圍內使用是安全可靠的；（2）4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑也能夠有效的誘導抗原特異性的體液免疫應答，顯著增強抗原特異性的體液免疫反應，效果優(yōu)于無佐劑、單一佐劑和鋁佐劑組。
具體實施方式
下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件，文中所述的較佳條件實施方法僅作示范之用。
實施例1
本例提供的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗是：用3.8μL75%乙醇溶解500μg 4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份HAV抗原（即動物實驗使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份HAV抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的甲肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑為市購產品，分子式為C9H8N2，分子量約為144.18，購自西格瑪奧德里（上海）貿易有限公司；HAV抗原為市購的滴度為256EU/mL 18EU HAV抗原液，購自中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所。
實施例1所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗的免疫試驗和效果如下：
A、免疫
將6-8周齡、18-22g的清潔級ICR小鼠隨機分為4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組7只；所用氫氧化鋁為常用的氫氧化鋁膠體佐劑，在人體中的劑量為1.8-2.7mg。
對4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑組：注射實施例1的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗至小鼠體內，注射劑量為每只小鼠300μL，其中300μL疫苗中含有4-苯基咪唑500μg，氫氧化鋁復合300μg，甲肝抗原18EU。
對氫氧化鋁佐劑組：將氫氧化鋁300μg與甲肝抗原18EU混合后1×PBS加至300μL，經皮下多點注射到小鼠體內，注射劑量為每只小鼠300μL。
對無佐劑組：將甲肝抗原18EU與1×PBS混合至300uL，再經皮下多點注射到小鼠體內，注射劑量為每只小鼠300μL。
對空白組：僅注射1×PBS，注射劑量為每只小鼠300uL。
免疫方案：在第0周經皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。
B、ELISA檢測血清抗－HAV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測血清抗-HAV IgG水平，按KPL公司生產的小鼠IgG ELISA試劑盒說明書進行檢測操作。
C、數據分析
對所獲得的實驗數據以Graphpad prism5統(tǒng)計軟件進行t檢驗，以P<0.05為差異的統(tǒng)計學意義。
通過數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均檢測到抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。4-苯基咪唑500μg+氫氧化鋁組在免疫后4、8、16周，產生的抗體水平都高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；免疫后8、12、16周檢測到的抗體水平都比單一佐劑組高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；且全程中與鋁佐劑對照組抗體水平相當；而鋁佐劑組在免疫后12、16周抗體水平高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。表明4-苯基咪唑+氫氧化鋁可增強HAV抗原特異性體液免疫應答，效果優(yōu)于無佐劑組和單一佐劑組，與鋁佐劑相當。
表1為使用實施例1提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗-HAV IgG水平（抗體效價值）。
表1
實施例2
本例提供的含有氫氧化鋁+4-苯基咪唑復合佐劑的甲肝疫苗是：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份HAV抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份HAV抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的甲肝疫苗。其中，4-苯基咪唑+氫氧化鋁、HAV抗原獲得方式同實施例1。
本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗的免疫試驗同實施例1，結果見表2。
表2為使用實施例2提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗-HAV IgG抗體水平。
表2
通過數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均檢測到抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。4-苯基咪唑1mg+氫氧化鋁組在每個檢測階段的抗體滴度都最高，并都顯著高于無佐劑組和單一佐劑組(P<0.05)，差異都有統(tǒng)計學意義；且在第4周產生的抗體水平高于鋁佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，直至16周后抗體水平均仍和鋁佐劑對照組相當；單一佐劑組在每個檢測階段抗體水平與無佐劑組相當；而鋁佐劑組在免疫后12、16周抗體水平高于單一佐劑組和無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表2。表明4-苯基咪唑1mg+氫氧化鋁組可增強HAV抗原特異性體液免疫應答，具有佐劑效應，其體液免疫增強效果高于無佐劑、單一佐劑和鋁佐劑組。
實施例3
本例提供的含有氫氧化鋁+4-苯基咪唑復合佐劑的甲肝疫苗是：用10.4μL75%乙醇溶解1.5mg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份HAV抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份HAV抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的甲肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氫氧化鋁、HAV抗原獲得方式同實施例1。本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的甲肝疫苗的免疫試驗同實施例1，結果見表3。
表3為使用實施例3提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗-HAV IgG
抗體水平。
表3
通過數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均檢測到抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。4-苯基咪唑1.5mg+氫氧化鋁組在免疫12周后，產生的抗體水平較高，在免疫后16周產生的抗體水平高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；免疫后8、12、16周檢測到的抗體水平都比單一佐劑組高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；除第12周外，其它檢測時間段與鋁佐劑對照組抗體水平相當；而鋁佐劑組在免疫后12、16周抗體水平高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表3。表明4-苯基咪唑+氫氧化鋁可增強HAV抗原特異性體液免疫應答，效果優(yōu)于無佐劑組和單一佐劑組，具有佐劑效應。
實施例4
本例提供的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗是：用3.8μL75%乙醇溶解500μg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份乙肝表面抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份乙肝表面抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的乙肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氫氧化鋁獲得方式同實施例1，乙肝表面抗原為常規(guī)的含乙肝表面抗原1μg的市購產品，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所。
本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗的免疫試驗同實施例1，效果見表4。
表4為使用實施例4提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗-乙肝表面抗原 IgG抗體水平。
表4
通過數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均檢測到抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。在免疫后的4、8、16周，4-苯基咪唑500μg+氫氧化鋁組產生的抗體水平都明顯高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；免疫后8、16周檢測到抗體水平都比單一佐劑組高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；除12周外，4-苯基咪唑500μg+氫氧化鋁組產生的抗體水平都略高于鋁佐劑組；鋁佐劑組產生的抗體水平只在12周、16周高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表4。表明氫氧化鋁+4-苯基咪唑復合佐劑可增強乙肝表面抗原特異性體液免疫應答，效果優(yōu)于無佐劑組和單一佐劑組，具有佐劑效應。
實施例5
本例提供的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗是：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份乙肝表面抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份乙肝表面抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的乙肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氫氧化獲得方式同實施例1，乙肝表面抗原為常規(guī)的含乙肝表面抗原1μg的市購產品，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所。
本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗的免疫試驗同實施例1，效果見表5。
表5為使用實施例5提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗體水平。
表5
實施例6
本例提供的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗是：用10.4μL
75%乙醇溶解1.5mg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份乙肝表面抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份乙肝表面抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的乙肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氫氧化鋁獲得方式同實施例1，乙肝表面抗原為常規(guī)的含乙肝表面抗原1μg的市購產品，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所。
本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的乙肝疫苗的免疫試驗同實施例1，效果見表6。
表6為使用實施例6提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗體水平。
表6
通過數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均檢測到抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。在免疫后8、16周，4-苯基咪唑1.5mg+氫氧化鋁組產生的抗體水平高于無佐劑組和單一佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；除12周外，4-苯基咪唑1.5mg+氫氧化鋁組產生的抗體水平都與鋁佐劑對照組相當；鋁佐劑組產生的抗體水平只在12、16周高于無佐劑(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表6。表明氫氧化鋁+4-苯基咪唑復合佐劑可增強乙肝表面抗原特異性體液免疫應答，效果優(yōu)于無佐劑組和單一佐劑組，具有佐劑效應。
實施例7
本發(fā)明提供的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的疫苗是：用3.8μL75%乙醇溶解500μg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份狂犬病毒抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的狂犬疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份狂犬病毒抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的狂犬疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氫氧化鋁獲得方式同實施例1；狂犬病毒抗原為常規(guī)的含狂犬病毒抗原0.125IU的市購產品，購自大連漢信生物制藥有限公司。
本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的狂犬疫苗的免疫試驗同實施例1，效果見表7。
表7為使用實施例7提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗體水平。
表7
數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均產生抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。4-苯基咪唑500μg+氫氧化鋁在免疫4、8、16周產生的抗體水平都高于無佐劑組和單一佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；免疫12周后，產生的抗體水平最高，僅次于鋁佐劑對照組，其它檢測時間段抗體水平略高于鋁佐劑對照組；鋁佐劑組產生的抗體水平只在16周高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表7。表明4-苯基咪唑500μg+氫氧化鋁可增強狂犬病毒抗原特異性體液免疫應答，效果優(yōu)于無佐劑組和單一佐劑組，具有佐劑效應。
實施例8
本發(fā)明提供的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的疫苗是：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份狂犬病毒抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的狂犬疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份狂犬病毒抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的狂犬疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氫氧化鋁獲得方式同實施例1；狂犬病毒抗原為常規(guī)的含狂犬病毒抗原0.125IU的市購產品，購自大連漢信生物制藥有限公司。
本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的狂犬疫苗的免疫試驗同實施例1，效果見表8。
表8為使用實施例8提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗體水平。
表8
數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均檢測到抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。4-苯基咪唑1mg+氫氧化鋁組在每個檢測階段的抗體滴度都最高，并都顯著高于無佐劑組和單一佐劑組(P<0.05)，差異都有統(tǒng)計學意義；且在第四周與鋁佐劑組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。其它檢測時間段4-苯基咪唑1mg+氫氧化鋁組的抗體水平比同期鋁佐劑對照組略高；單一佐劑組在每個檢測階段抗體水平與無佐劑組相當；鋁佐劑組產生的抗體水平只在16周高于單一佐劑組和無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表8。表明氫氧化鋁+4-苯基咪唑復合佐劑可增強狂犬病毒抗原特異性體液免疫應答，效果優(yōu)于無佐劑、單一佐劑和鋁佐劑組，且這種效果可持續(xù)一定時間。
實施例9
本發(fā)明提供的含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的疫苗是：用10.4μL75%乙醇溶解1.5mg4-苯基咪唑后，與300μg氫氧化鋁混合得復合佐劑，復合佐劑中按常規(guī)加入每單份狂犬病毒抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的狂犬疫苗。另外還設置單一佐劑組（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常規(guī)加入每單份狂犬病毒抗原（即動物實驗中使用的單次注射劑量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均勻，得含有4-苯基咪唑單一佐劑的狂犬疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氫氧化鋁獲得方式同實施例1；狂犬病毒抗原為常規(guī)的含狂犬病毒抗原0.125IU的市購產品，購自大連漢信生物制藥有限公司。
本例所得含有4-苯基咪唑+氫氧化鋁復合佐劑的狂犬疫苗的免疫試驗同實施例1，效果見表9。
表9為使用實施例9提供的佐劑后，16周內，各實驗組小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗體水平。
表9
數據分析可以看出，除空白組外，各實驗組小鼠免疫4周后，均產生抗-HAV IgG，并隨著時間的延長呈上升趨勢，于第12周后達到峰值，此后逐漸下降。4-苯基咪唑1.5mg+氫氧化鋁組在免疫8、16周后產生的抗體水平高于無佐劑組和單一佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；除12周外，其它檢測時間段的抗體水平與鋁佐劑對照組相當；鋁佐劑組產生的抗體水平只在16周高于無佐劑組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表9。表明4-苯基咪唑1.5mg+氫氧化鋁可增強狂犬病毒抗原特異性體液免疫應答，效果優(yōu)于無佐劑組和單一佐劑組，且佐劑效應與鋁佐劑相當。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。