本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學領域，具體涉及龍血素C在制備防治阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆、抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用。
背景技術：
：隨著世界人口的老齡化與經(jīng)濟的發(fā)展，老年人的生活質(zhì)量受到越來越多的重視。老年癡呆癥是一種嚴重影響老年人生活質(zhì)量的疾病，主要的類型有阿爾茨海默病(A1zheimer’sdisease,AD)及血管性癡呆(Vasculardementia,VD)，其中AD約為老年癡呆總?cè)藬?shù)的50％-60％，VD占10％-20％。目前老年癡呆癥治療藥物的數(shù)量非常有限。帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)包括靜止性振顫、僵硬、動作遲緩、姿勢反射異常等，嚴重者喪失生活自理能力。目前治療帕金森病的藥物在短期內(nèi)可改善癥狀，但均不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)病理改變，而長期用藥帶來的異動癥等副作用顯著?，F(xiàn)代社會中，工作和生活節(jié)奏逐步加快，人們所承受的壓力與挑戰(zhàn)(應激因素)也逐漸增加。嚴重或持久的應激，特別是慢性應激，嚴重影響著人類的身心健康，誘發(fā)許多軀體或精神疾病(如抑郁癥)。抑郁癥已經(jīng)成為現(xiàn)代社會嚴重的精神衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，就疾病負擔而言，預計到2020年，抑郁癥將上升為僅次于心臟病的第二大疾患。綜上，探尋潛在的阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆、抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治藥物具有重要的醫(yī)學意義和社會意義。龍血素C是從傳統(tǒng)中藥血竭(Dragon’sBlood)中分離鑒定的單體化合物。血竭是一味歷史悠久的名貴中藥。其性味甘咸、平，入心、肝經(jīng)，具有散瘀定痛、活血生肌等功能。現(xiàn)代研究證實，血竭具有抗炎止痛、抗真菌、抗心律失常、增強機體免疫等多種藥理作用。龍血素C的英文名為LoureirinC，CAS號為116384-24-8，分子式為C16H16O4，化學名為4,4'-二羥基-2-甲氧基二氫查耳酮(4,4'-dihydroxy-2-methoxydihydrochalcone)，結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：動物模型選擇依據(jù)：(1)將興奮性氨基酸——喹啉酸(quinolinicacid；QA)注入動物Meynert基底核會造成局部興奮性氨基酸大量聚集，持續(xù)作用于NMDA受體，引起大量Ca2+內(nèi)流，導致Ca2+超載，繼而產(chǎn)生大量氧化應激產(chǎn)物，引發(fā)細胞炎癥，線粒體功能紊亂。此外Meynert基底核是膽堿能神經(jīng)元聚集最豐富的地方，該模型會造成膽堿能神經(jīng)元變性、死亡，膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，繼而引起認知及記憶能力減退，即喹啉酸可以引起類似AD的病理改變和認知障礙。(2)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)靜脈或腹腔注射后可通過血腦屏障，在腦內(nèi)由單胺氧化酶(MAO-B)代謝為毒性產(chǎn)物MPP+，再經(jīng)多巴胺轉(zhuǎn)運體選擇性攝入黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，引起震顫、運動遲緩、肢體僵直、姿勢反射異常等表現(xiàn)，補充左旋多巴能改善以上癥狀，MPTP可造成經(jīng)典的PD模型。(3)腦梗塞所引起的缺血-再灌注是誘發(fā)血管性癡呆的主要原因之一。小鼠反復腦缺血再灌模型是通過夾閉頸總動脈造成腦供血供氧不足，引發(fā)急性腦損傷，通過再灌注時的鈣超載和呼吸爆發(fā)(氧自由基過剩)等機制造成遲發(fā)性腦損傷。該模型腦損傷指標明顯，記憶障礙顯著，是一種經(jīng)典的VD模型。(4)慢性不可預見輕度應激性抑郁模型(chronicunpredictablemildstress，CMS)與其他動物模型相比更能模擬人類日常生活中所遭遇的各種刺激，與臨床抑郁癥具有更強的病因?qū)W關聯(lián)性。臨床研究表明，長期暴露于不可控、不可預見的生活事件的人更容易罹患抑郁障礙。此外，在抗抑郁藥物研發(fā)方面，因為抗抑郁藥物的療效需要用藥一定時間后方可作出評價，這就需要用于此類研究的動物模型具有與臨床相似的時間特性，即動物的抑郁行為必須能持續(xù)數(shù)周以上時間，這也是本抑郁模型的獨特優(yōu)勢。綜上，采用以上動物模型考察龍血素C防治阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆及抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用有充分理論依據(jù)。迄今為止，未見有龍血素C防治阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆及抑郁癥的記載和報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明是提供龍血素C的新用途，即用于防治阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆、抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本發(fā)明分別通過阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆、抑郁癥動物模型(大鼠Meynert基底核注射喹啉酸模型，小鼠腹腔注射MPTP模型，小鼠雙側(cè)頸總動脈反復缺血再灌注模型，小鼠慢性不可預知溫和應激性抑郁模型)，觀察龍血素C對上述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治作用。研究結(jié)果表明，龍血素C對上述疾病的動物模型均顯示出防治作用。本發(fā)明以Wistar大鼠和ICR小鼠為實驗動物，造模方法和給藥方案如下：(1)擬AD模型：Wistar大鼠兩側(cè)Meynert基底核(位置：前囟后1.4mm、矢狀線旁±2.4mm、顱骨下6.8mm)均注入2μL(含喹啉酸120nmol)喹啉酸溶液，假手術組注入等體積PBS溶液。造模當日開始灌胃給藥，龍血素C設置3個劑量0.112mg/kg、0.224mg/kg和0.448mg/kg。給藥第8天開始依次進行Y迷宮、新物體辨別和Morris水迷宮實驗，之后，采集大腦皮層組織，檢測代表突觸結(jié)構(gòu)與功能的突觸相關蛋白，生長相關蛋白-43(GAP43)、突觸后致密物質(zhì)-95(PSD95)和突觸素(SYP)的表達水平。(2)擬PD模型：ICR小鼠按照20mg/kg體重的劑量腹腔注射MPTP，每間隔3小時注射一次，共注射4次，一天內(nèi)完成。造模后開始灌胃給藥，龍血素C設置3個劑量0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.6mg/kg。給藥第14天開始依次進行轉(zhuǎn)棒實驗、爬竿實驗、平衡木實驗和曠場實驗。(3)血管性癡呆模型：分離ICR小鼠雙側(cè)頸總動脈，用動脈夾夾閉20min，放開10min，再夾閉20min，距尾尖1cm處放8-10滴血。造模后開始灌胃給藥，龍血素C設置3個劑量0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.6mg/kg。給藥第8天開始依次進行Y迷宮、Morris水迷宮和被動回避實驗，采集海馬組織。檢測突觸相關蛋白GAP43、PSD95和SYP的表達水平。(4)抑郁模型：對照組ICR小鼠群養(yǎng)于標準實驗室條件下，自由攝水及攝取飼料。模型組ICR小鼠單籠單只飼養(yǎng)，每日被動接受限水、限食、游泳、禁水、禁食、45度斜籠、濕籠等刺激中的1種，刺激時間不固定，隨機安排28天，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使小鼠不能預料刺激的發(fā)生。造模期間開始灌胃給藥。給藥第29天開始依次進行糖水偏愛實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、曠場實驗。實驗結(jié)果，龍血素C高劑量顯著提高擬AD和VD動物Y迷宮實驗自發(fā)交替反應率、新物體辨別的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)、Morris水迷宮實驗的目標象限游泳時間、被動回避實驗逃避潛伏期等，Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)龍血素C高劑量組小鼠腦內(nèi)GAP43、PSD95和SYP蛋白表達顯著提高，以上結(jié)果提示龍血素C改善了擬AD和VD動物學習記憶障礙，對動物腦內(nèi)神經(jīng)細胞具有保護作用。與模型組相比，龍血素C高劑量顯著延長擬PD動物轉(zhuǎn)棒實驗的潛伏期、縮短爬竿實驗的轉(zhuǎn)身時間和下降時間、提高平衡木實驗得分、增加水平和垂直運動，以上結(jié)果提示龍血素C改善了擬PD動物運動障礙。龍血素C高劑量顯著延長動物的糖水偏愛分數(shù)，縮短強迫游泳實驗不動時間、懸尾實驗不動時間，增加水平和垂直運動，以上結(jié)果提示龍血素C改善了動物的抑郁癥狀。綜上，龍血素C可以有效改善阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆、抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀。本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領域公知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為藥物使用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问?。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射和穴位注射等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。例如為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、單硬脂酸甘油脂、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成份本發(fā)明化合物龍血素C與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。例如，將本發(fā)明化合物龍血素C制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑、分散劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、增溶劑和pH調(diào)節(jié)劑。如稀釋可選用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等；增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基β-環(huán)糊精等；pH調(diào)節(jié)劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等。如制備凍干粉針劑，還可以加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。此外，如需要也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或香料等。這些輔料是本領域常用的。本發(fā)明所用的無菌介質(zhì)都可以通過本領域技術人員眾所周知的標準技術制得?？蓪⑺鼈儨缇缤ㄟ^經(jīng)由細菌過濾器過濾、通過向組合物中加入滅菌劑、通過將組合物放射處理、或通過將組合物加熱滅菌。還可以在臨用前將它們制成無菌可注射介質(zhì)。為了達到用藥目的，增加防治效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。當然用于實施本發(fā)明化合物的給藥途徑取決于疾病和需要防治的部位。因為本發(fā)明化合物的藥動學和藥效學特征會有某種程度的不同，因此，在組織中獲得治療濃度的最優(yōu)選方法是逐漸增加劑量并監(jiān)測臨床效果。對于這樣的逐漸增加治療劑量，初始劑量將取決于給藥途徑。對于任何特定患者，本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如疾病的嚴重程度，患者的性別、年齡、性格及個體反應，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的防治劑量可以有較大范圍的變化。根據(jù)所治療患者的病癥，可能必須對劑量做出某些改變，并且在任何情況下，都由醫(yī)師決定個體患者的合適劑量。給藥劑量是指不包括載體重量在內(nèi)(當使用載體時)的化合物的重量。一般來講，本發(fā)明中藥學成分的使用劑量是本領域技術人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當?shù)恼{(diào)整，以達到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預防或治療目的?？梢允菃我粍┝啃问浇o藥或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥；這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。本發(fā)明提供了龍血素C的新應用——在制備防治阿爾茨海默病、帕金森病、血管性癡呆、抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用。附圖說明圖1龍血素C對Meynert基底核注射喹啉酸大鼠Y迷宮實驗自發(fā)交替反應率的影響圖2龍血素C對Meynert基底核注射喹啉酸大鼠新物體辨別實驗1h、24h優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)的影響圖3龍血素C對Meynert基底核注射喹啉酸大鼠Morris水迷宮實驗目標象限游泳時間的影響圖4龍血素C對Meynert基底核注射喹啉酸大鼠大腦皮層突觸相關蛋白表達的影響A：龍血素C對SYP蛋白表達的影響B(tài)：龍血素C對PSD95蛋白表達的影響C：龍血素C對GAP43蛋白表達的影響圖5龍血素C對腹腔注射MPTP小鼠轉(zhuǎn)棒實驗潛伏期的影響圖6龍血素C對腹腔注射MPTP小鼠爬竿實驗轉(zhuǎn)身時間和下降時間的影響圖7龍血素C對腹腔注射MPTP小鼠平衡木實驗得分的影響圖8龍血素C對腹腔注射MPTP小鼠曠場實驗水平和垂直運動的影響圖9龍血素C對雙側(cè)頸總動脈反復缺血再灌注小鼠Y迷宮實驗自發(fā)交替反應率的影響圖10龍血素C對雙側(cè)頸總動脈反復缺血再灌注小鼠Morris水迷宮實驗目標象限游泳時間、游泳路程的影響圖11龍血素C對雙側(cè)頸總動脈反復缺血再灌注小鼠被動回避實驗逃避潛伏期的影響圖12龍血素C對雙側(cè)頸總動脈反復缺血再灌注小鼠海馬突觸相關蛋白表達的影響A：龍血素C對SYP蛋白表達的影響B(tài)：龍血素C對PSD95蛋白表達的影響C：龍血素C對GAP43蛋白表達的影響圖13龍血素C對抑郁小鼠糖水偏愛分數(shù)的影響圖14龍血素C對抑郁小鼠強迫游泳實驗不動時間的影響圖15龍血素C對抑郁小鼠懸尾實驗不動時間的影響圖16龍血素C對抑郁小鼠曠場實驗水平和垂直運動的影響。具體實施方式下面的實施例可以幫助本領域的技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1龍血素C對大鼠Meynert基底核注射喹啉酸致AD模型的影響雄性Wistar大鼠，體重270-290克，隨機分為5組，每組12只。5組分別為假手術組、模型組、龍血素C低劑量組(0.112mg/kg)、中劑量(0.224mg/kg)和高劑量組(0.448mg/kg)。大鼠用3.5％的水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，剪去顱頂切口區(qū)毛發(fā)，酒精消毒，并將頭部固定于腦立體定位儀上，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠Meynert基底核位置(前囟后1.4mm、矢狀線旁±2.4mm、顱骨下6.8mm)，標記后用微型牙鉆鉆開顱骨，將10μL微量進樣器移入并注射。除假手術組外，每組大鼠兩側(cè)Meynert基底核均注入2μL(含喹啉酸120nmol)喹啉酸溶液(用0.01mol/L，pH7.4PBS緩沖液溶解)，緩慢推注1min，留針6min，假手術組注入等體積PBS溶液。造模當日動物蘇醒后開始灌胃給藥，假手術組和模型組給予等量的溶劑。給藥第8天開始依次進行Y迷宮、新物體辨別和Morris水迷宮實驗，行為學實驗期間繼續(xù)給藥，每天1次直至行為學結(jié)束，處死動物，采集大腦皮層組織。檢測突觸相關蛋白GAP43、PSD95和SYP表達。①大鼠Y迷宮實驗給藥第8天，各組大鼠進行Y迷宮實驗。大鼠Y迷宮實驗旨在考察龍血素C對大鼠自發(fā)交替活動和工作記憶的影響。裝置由三個夾角為120°的木制支臂組成，分別為A、B、C三臂。實驗時將大鼠放入A臂末端，讓其自由出入三個臂，記錄8min內(nèi)每只大鼠進入三個臂的總次數(shù)及進臂順序，以連續(xù)進入三個不同的臂為一次正確交替反應，記錄正確交替反應次數(shù)。用自發(fā)交替反應率(％)反映空間工作記憶能力。實驗結(jié)果如圖1所示：與假手術組相比，模型組自發(fā)交替反應率顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組自發(fā)交替反應率顯著增加，提示龍血素C能夠顯著提高擬AD大鼠的工作記憶能力。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比##p<0.01；與模型組相比***p<0.001，N＝12。②大鼠新物體辨別實驗給藥第9天，各組大鼠進行新物體辨別實驗。大鼠新物體辨別實驗旨在考察龍血素C對大鼠形象辨別記憶的影響。實驗裝置為一黑色塑料圓形開放場，直徑約60cm，高20cm。本實驗分為適應階段和測試階段。適應階段每次將2～3只大鼠放入開放場中，讓其自由探索3min以適應環(huán)境，每天2次，進行2天。第3天進行測試，每次將一只大鼠放入開放場中先自由探索3min，后取出大鼠，將2個相同的物體(A1,A2)置于開放場中央，放入大鼠，記錄5min內(nèi)探索兩物體的時間(tA1,tA2)。1h后，將A2物體換成新物體B，將大鼠再次放入，記錄探索兩物體的時間(tA1,tB)。24h后，將物體B換成物體C，將大鼠再次放入，記錄探索兩物體所用的時間(tA1,tC)。探索的判定標準為大鼠用鼻子指向物體并距離物體1cm以內(nèi)，或觸及鼻子、舔物體、或用前爪觸碰物體。計算對新物體的優(yōu)先指數(shù)(Preferentialindex)及辨別系數(shù)(Discriminationindex)。優(yōu)先指數(shù)計算公式如下：優(yōu)先指數(shù)(1h)＝tB/(tA1+tB)優(yōu)先指數(shù)(24h)＝tC/(tA1+tC)辨別系數(shù)計算公式如下：辨別系數(shù)(1h)＝(tB-tA1)/(tA1+tB)辨別系數(shù)(24h)＝(tC-tA1)/(tA1+tC)實驗結(jié)果如圖2所示：與假手術組相比，模型組大鼠1h及24h測試階段的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)均顯著降低，提示模型組大鼠形象記憶能力減弱。與模型組相比，龍血素C組1h及24h優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)均顯著增加，提示龍血素C能顯著改善擬AD大鼠形象辨別記憶障礙。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與假手術組相比###p<0.001；與模型組相比**p<0.01，***p<0.001，N＝12。③大鼠Morris水迷宮實驗給藥第13天，各組大鼠進行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮實驗旨在考察龍血素C對空間學習記憶障礙的影響。水迷宮裝置由直徑為1.5米、高為50厘米的黑色不銹鋼圓形水池和一個直徑為10厘米的圓形金屬平臺組成，平臺可自由移動位置。實驗前向水池中注水(水溫24±1℃)，使水面高于平臺1厘米。訓練階段，每天上下午各進行1次訓練，歷時6天。平臺置于第四象限，將大鼠面向池壁放入水中，記錄90秒，90秒內(nèi)如果大鼠找到平臺則讓其在平臺上休息10秒。如果90秒未找到平臺，將大鼠引導至平臺上休息10秒。給藥第19天進行測試，撤除平臺，讓大鼠自由游泳90秒。迷宮系統(tǒng)自動記錄大鼠在原平臺象限(目標象限)停留的時間。實驗結(jié)果如圖3所示：與假手術組相比，模型組目標象限游泳時間顯著減少，提示模型組大鼠空間記憶能力下降。與模型組相比，龍血素C組目標象限游泳時間顯著增加，提示龍血素C能劑量依賴地改善造模大鼠的空間記憶障礙。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與假手術組相比###p<0.001；與模型組相比*p<0.05，***p<0.001，N＝12。④Westernblot檢測突觸相關蛋白表達腦組織低溫充分勻漿，重懸于蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40分鐘，4℃下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取上清。采用Bradford法進行蛋白定量。40μg蛋白提取物加入上樣緩沖液，沸水浴加熱5分鐘，充分變性。10％SDS-PAGE電泳分離蛋白→半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜→5％脫脂奶粉封閉2小時→一抗孵育，4℃過夜→PBS洗脫→二抗室溫孵育2小時→ECL法顯影。實驗結(jié)果如圖4所示：與假手術組相比，模型組大鼠大腦皮層GAP43、PSD95和SYP蛋白表達水平顯著降低；與模型組相比，龍血素C組顯著提高GAP43、PSD95和SYP蛋白表達水平，提示龍血素C具有神經(jīng)突觸保護作用。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與假手術組相比#p<0.05；與模型組相比*p<0.05，**p<0.01，N＝5。實施例2龍血素C對小鼠腹腔注射MPTP致PD模型的影響雄性ICR小鼠，體重22-25克，隨機分為5組，每組10只。5組分別為對照組、模型組、龍血素C低劑量組(0.15mg/kg)、中劑量組(0.3mg/kg)和高劑量組(0.6mg/kg)。按照20mg/kg體重的劑量腹腔注射MPTP，每間隔3小時注射一次，共注射4次，一天內(nèi)完成。造模后給藥組連續(xù)灌胃給藥，每天一次，直到處死動物，對照組和模型組給予同體積溶劑。給藥第14天進行轉(zhuǎn)棒實驗、第15天進行爬竿實驗、第16天進行平衡木實驗、第17天進行曠場實驗。①小鼠轉(zhuǎn)棒實驗給藥第12天，各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒儀進行訓練，設定轉(zhuǎn)速5圈/分鐘，300秒/次，3次/天；給藥第13天，各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒儀進行訓練，設定轉(zhuǎn)速10圈/分鐘，300秒/次，3次/天；給藥第14天對各組小鼠進行測試，轉(zhuǎn)棒儀設定轉(zhuǎn)速30圈/分鐘，200秒/次，共測試3次。記錄測試時小鼠從轉(zhuǎn)棒儀掉落的時間，取均值——即潛伏期。實驗結(jié)果如圖5所示：與對照組相比，模型組潛伏期顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組潛伏期顯著延長，提示龍血素C能夠顯著改善PD小鼠的運動障礙。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，N＝10。②小鼠爬竿實驗給藥第15天，在水平桌面上設置一垂直于桌面的粗糙塑料桿，直徑10mm、高30cm。將小鼠頭部向上置于塑料桿頂端，小鼠將自動轉(zhuǎn)身直至頭部向下，并沿塑料桿下降到桌面。記錄小鼠轉(zhuǎn)向所需的時間和下降到桌面(以雙前足均接觸桌面為準)的時間。實驗結(jié)果如圖6所示：與對照組相比，模型組轉(zhuǎn)身時間和下降時間均顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組轉(zhuǎn)身時間和下降時間顯著延長，提示龍血素C能夠顯著改善PD小鼠的運動障礙。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，N＝10。③小鼠平衡木實驗給藥第16天，將一100cm長、直徑10mm的鋼質(zhì)圓桿兩端固定于直徑20cm、高30cm的圓形平臺上。實驗時，將小鼠放于鋼桿中央，測試時間為60s，記錄小鼠在桿上的平衡時間(即從抓桿到落下的時間)。若小鼠在60s內(nèi)仍在桿上或逃至兩端的平臺之一，則記錄時間為60s。每只小鼠分別在桿上連續(xù)測試3次。評分標準：0分：動物從桿上掉下；1分：60s內(nèi)動物未從桿上落下，但也未移動；2分：60s內(nèi)動物未從桿上落下，且在桿上移動，但未達到平臺；3分：60s內(nèi)動物未從桿上落下，且在40-59s內(nèi)到達平臺；4分：60s內(nèi)動物未從桿上落下，且在20-39s內(nèi)到達平臺；5分：60s內(nèi)動物未落下，且在20s內(nèi)到達平臺。記錄并計算出每只小鼠在桿上3次的積分均值。實驗結(jié)果如圖7所示：與對照組相比，模型組得分顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組得分顯著增加，提示龍血素C能夠顯著改善PD小鼠的平衡能力。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比#p<0.05；與模型組相比*p<0.05，N＝10。④小鼠曠場實驗給藥第17天，進行曠場實驗，以考察小鼠的探索行為，實驗裝置為一個長、寬、高均為50cm的無蓋木箱，木箱底部被分為25個邊長為2cm的正方形。實驗時間共20min，將小鼠置于木箱底部一角，適應15min后，觀察記錄最后5min小鼠的水平運動(四肢跨越的格子數(shù))及垂直運動(小鼠以后肢站立的次數(shù))。實驗結(jié)果如圖8所示：與對照組相比，模型組水平運動和垂直運動均顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組水平運動和垂直運動顯著增加，提示龍血素C能夠顯著改善PD小鼠的運動障礙。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，**p<0.01，N＝10。實施例3龍血素C對小鼠雙側(cè)頸總動脈反復缺血再灌注致血管性癡呆模型的影響雄性ICR小鼠，體重22-25克，隨機分為5組，每組10只。5組分別為假手術組、模型組、龍血素C低劑量組(0.15mg/kg)、中劑量組(0.3mg/kg)和高劑量組(0.6mg/kg)。首先腹腔注射阿托品(1mg/kg)，5min后腹腔注射3.5％水合氯醛麻醉，背位固定。分離雙側(cè)頸總動脈，用動脈夾夾閉20min，放開10min，再夾閉20min，距尾尖1cm處放8-10滴血。假手術組只分離雙側(cè)頸總動脈，不夾閉不放血。造模當日動物蘇醒后開始灌胃給藥，假手術組和模型組給予等量的溶劑。給藥第8天開始依次進行Y迷宮、Morris水迷宮和被動回避實驗，行為學實驗期間繼續(xù)給藥，每天1次直至行為學結(jié)束，處死動物，采集大腦海馬組織。檢測突觸相關蛋白GAP43、PSD95和SYP表達。①小鼠Y迷宮實驗給藥第8天，各組小鼠進行Y迷宮實驗。小鼠Y迷宮實驗旨在考察龍血素C對小鼠自發(fā)交替活動和工作記憶的影響。裝置由三個夾角為120°的木制支臂組成，分別為A、B、C三臂。實驗時將小鼠放入A臂末端，讓其自由出入三個臂，記錄10min內(nèi)每只小鼠進入三個臂的總次數(shù)及進臂順序，以連續(xù)進入三個不同的臂為一次正確交替反應，記錄正確交替反應次數(shù)。用自發(fā)交替反應率(％)反映空間工作記憶能力。實驗結(jié)果如圖9所示：與假手術組相比，模型組自發(fā)交替反應率顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組自發(fā)交替反應率顯著增加，提示龍血素C能夠顯著提高血管性癡呆小鼠的工作記憶能力。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與假手術組相比#p<0.05；與模型組相比*p<0.05，N＝10。②小鼠Morris水迷宮實驗給藥第9天，各組小鼠進行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮實驗旨在考察龍血素C對空間學習記憶障礙的影響。水迷宮裝置由直徑為1.2米、高為50厘米的黑色不銹鋼圓形水池和一個直徑為10厘米的圓形金屬平臺組成，平臺可自由移動位置。實驗前向水池中注水(水溫24±1℃)，使水面高于平臺1厘米。訓練階段，每天上下午各進行1次訓練，歷時5天。平臺置于第四象限，將小鼠面向池壁放入水中，記錄60秒，60秒內(nèi)如果小鼠找到平臺則讓其在平臺上休息10秒。如果60秒未找到平臺，將小鼠引導至平臺上休息10秒。給藥第16天進行測試，撤除平臺，讓小鼠自由游泳60秒。迷宮系統(tǒng)自動記錄小鼠在原平臺象限(目標象限)停留的時間及路程。實驗結(jié)果如圖10所示：與假手術組相比，模型組目標象限游泳時間和路程顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組目標象限游泳時間和路程顯著增加，提示龍血素C能夠顯著提高血管性癡呆小鼠的空間記憶能力。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與假手術組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，N＝10。③小鼠被動回避實驗給藥第15天，各組小鼠進行被動回避實驗。被動回避實驗旨在考察龍血素C對學習能力的影響。實驗裝置分明、暗兩室。兩室大小均為15厘米×10厘米×11厘米，兩室之間有一直徑為3厘米大小的半圓形門。兩室底部均鋪以銅柵，暗室底部銅柵可以通電，電壓強度由穩(wěn)壓器控制。將小鼠背向門口放入明室，適應環(huán)境3分鐘，然后通以30V電壓。小鼠進入暗室立即遭到電擊，然后從門口逃回明室，如此訓練5分鐘。1小時后測驗，記錄第一次進入暗室的潛伏期，以此作為記憶成績。實驗結(jié)果如圖11所示：與假手術組相比，模型組進入暗室的逃避潛伏期顯著縮短；而與模型組相比，龍血素C組進入暗室的潛伏期顯著增加，提示龍血素C能夠顯著提高血管性癡呆小鼠的學習記憶能力。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與假手術組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，N＝10。④Westernblot檢測海馬突觸相關蛋白表達方法同實施例1④。實驗結(jié)果如圖12所示：與假手術組相比，模型組小鼠海馬GAP43、PSD95和SYP蛋白表達水平顯著降低；與模型組相比，龍血素C組顯著提高GAP43、PSD95和SYP蛋白表達水平，提示龍血素C具有神經(jīng)突觸保護作用。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與假手術組相比#p<0.05，##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，N＝5。實施例4龍血素C對小鼠慢性不可預知溫和應激性抑郁模型的影響雄性ICR小鼠，體重25-30克，隨機分為5組，每組10只。5組分別為對照組、模型組、龍血素C低劑量組(0.15mg/kg)、中劑量組(0.3mg/kg)和高劑量組(0.6mg/kg)。對照組小鼠群養(yǎng)于標準實驗室條件下，自由攝水及飼料。模型組小鼠單籠單只飼養(yǎng)，每日被動接受限水、限食、游泳、禁水、禁食、45度斜籠、濕籠等刺激中的1種，刺激時間不固定，隨機安排28天，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使小鼠不能預料刺激的發(fā)生。造模同時，給藥組連續(xù)灌胃給藥，每天一次，直到處死動物，對照組和模型組給予同體積溶劑。給藥第29天進行糖水偏愛實驗、第30天進行強迫游泳實驗，第31天進行懸尾實驗，懸尾實驗后處死動物，采集大腦皮層。檢測突觸相關蛋白GAP43、PSD95和SYP表達。①小鼠糖水偏愛實驗給藥第29天，各組小鼠進行糖水偏愛實驗。測試前對小鼠禁水禁食18小時，測試時間選取在小鼠活動正常的夜間進行(7:00pm-12:00pm)，且實驗過程保持無光照狀態(tài)。測試時小鼠單籠單只擺放，同時給予飼料和提前稱重、標記的兩個同樣的飲水瓶，分別裝有1％的蔗糖水和清水，使其自由選擇攝取。1小時后，同時取下兩個飲水瓶，并再次稱重記錄。依據(jù)下列公式計算糖水偏愛分數(shù)：糖水偏愛分數(shù)＝糖水攝取量/(糖水攝取量+清水攝取量)×100％實驗結(jié)果如圖13所示：與假手術組相比，模型組糖水偏愛分數(shù)顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組糖水偏愛分數(shù)顯著增加，提示龍血素C能夠顯著提高抑郁小鼠對獎賞的反應性。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，N＝10。②小鼠強迫游泳實驗給藥第30天，各組小鼠進行強迫游泳實驗。強迫游泳實驗通過實驗過程中動物的不動行為反映其行為絕望狀態(tài)，是抑郁模型評價的指標之一。實驗選取小鼠活動正常的夜間進行，實驗過程中保持光線暗淡。首先向透明的圓柱形(高：40cm，直徑：30cm)玻璃容器內(nèi)注入30cm深的清水，水溫保持在25±2℃。測試時將小鼠輕放入水中，首先使其適應游泳1分鐘，從第2分鐘開始記錄后續(xù)5分鐘內(nèi)小鼠的漂浮不動時間。實驗結(jié)果如圖14所示：與假手術組相比，模型組不動時間顯著延長；而與模型組相比，龍血素C組不動時間顯著縮短，提示龍血素C能夠顯著改善抑郁小鼠的行為絕望狀態(tài)。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比#p<0.05；與模型組相比*p<0.05，N＝10。③小鼠懸尾實驗給藥第31天，各組小鼠進行懸尾實驗。懸尾實驗與強迫游泳實驗相似，也是通過實驗過程中動物的不動行為反映其行為絕望狀態(tài)，是抑郁模型評價的指標之一。實驗選取小鼠活動正常的夜間進行，實驗過程中保持光線暗淡。測試時將小鼠尾端約1cm處固定于支架上，使其處于自然的倒懸狀態(tài)。首先使小鼠適應1分鐘，從第二分鐘開始記錄后續(xù)5分鐘內(nèi)小鼠的不動時間。實驗結(jié)果如圖15所示：與假手術組相比，模型組不動時間顯著延長；而與模型組相比，龍血素C組不動時間顯著縮短，提示龍血素C能夠顯著改善抑郁小鼠的行為絕望狀態(tài)。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準誤差表示，與對照組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，N＝10。④小鼠曠場實驗給藥第32天，進行曠場實驗，以考察小鼠的抑郁樣行為。方法同實施例2④。實驗結(jié)果如圖16所示：與對照組相比，模型組水平運動和垂直運動均顯著降低；而與模型組相比，龍血素C組水平運動和垂直運動顯著增加，提示龍血素C能夠顯著改善小鼠的抑郁樣行為。實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，與對照組相比##p<0.01；與模型組相比*p<0.05，**p<0.01，N＝10。當前第1頁1 2 3