本發(fā)明涉及動物模型技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用長期高尿酸血癥誘導(dǎo)小鼠痛風(fēng)模型的方法。

背景技術(shù)：

痛風(fēng)是長期嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄障礙導(dǎo)致血尿酸增高的一種異質(zhì)性、代謝性疾病。當(dāng)血液中尿酸濃度超過人體生理溶解閾值時，就會形成尿酸鹽結(jié)晶并沉積于關(guān)節(jié)及相關(guān)等組織中，表現(xiàn)為急慢性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)畸形和痛風(fēng)石等臨床特征，常累及腎臟引起慢性間質(zhì)性腎炎和尿酸結(jié)石，導(dǎo)致急性和慢性腎衰竭。

痛風(fēng)常伴隨肥胖癥，高脂血癥、高血壓癥、2型糖尿病及心血管病等疾病，遺傳因素、性激素、飲食習(xí)慣、酒精等均可促進痛風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展，痛風(fēng)已嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和水平。近年來痛風(fēng)的患病率呈逐年上升趨勢，該病癥已成為威脅人類健康的又有一重大疾病。

引起尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的因素有很多，血尿酸水平是診斷痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一項重要指標(biāo)，當(dāng)體內(nèi)血尿酸水平急劇變化容易導(dǎo)致滑液中的尿酸沉積形成針狀結(jié)晶；pH降低容易引起尿酸鹽的沉積，關(guān)節(jié)腔及其周圍組織血液供應(yīng)相對較少，當(dāng)pH降低時，容易引起急性痛風(fēng)的發(fā)作；結(jié)締組織的損傷促使關(guān)節(jié)腔滑囊表面關(guān)節(jié)尿酸液結(jié)晶脫落，引起痛風(fēng)發(fā)作，除此之外，激素，蛋白多糖，溫度等的變化也會引起痛風(fēng)的發(fā)作。

動物疾病模型在研究人類致病機理中起到了關(guān)鍵作用。直接在動物關(guān)節(jié)處注射單鈉尿酸鹽結(jié)晶是最快的建模方法，但是該方法只能從表面上模擬痛風(fēng)的部分癥狀與人類痛風(fēng)的發(fā)病機制完全不同。目前尚無通過長期高尿酸血癥誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的動物模型。針對這一動物模型的探索和建立.將對該領(lǐng)域的研究具有重大價值。

高尿酸血癥(高尿酸血癥不一定引起痛風(fēng))建模的常用方法主要有尿酸酶基因敲除法、飼喂或灌胃或腹腔注射造模劑法以造模劑包括尿酸、尿酸前體(黃嘌呤或次黃嘌呤)、尿酸酶抑制劑(如氧嗪酸鉀)或抑制尿酸排泄的藥物，在建模過程中也可以兩種藥物同時使用。其中最常用的建模方法是通過尿酸酶抑制劑抑制模型動物體內(nèi)尿酸轉(zhuǎn)化為尿囊素。直接向小鼠關(guān)節(jié)腔注射單鈉尿酸鹽結(jié)晶是最快的痛風(fēng)建模方法。

敲除尿酸酶基因的小鼠壽命會大大縮短，并不適合作為模型小鼠來建立高尿酸血癥引起的痛風(fēng)模型；腹腔注射造模劑制備高尿酸血癥模型維持時間較短，其尿酸水平一般在4h時為最高，因此不能用于建立由長期高尿酸血癥誘導(dǎo)的小鼠痛風(fēng)模型的建立；直接向小鼠關(guān)節(jié)腔注射單鈉尿酸鹽結(jié)晶是最快的建模方法，但是該方法并未造成血尿酸的升高與人類痛風(fēng)的發(fā)病機制不同，不能用于對痛風(fēng)的生理、病理研究。目前尚無由長期高尿酸血癥誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的動物模型。針對這一動物模型的探索和建立，將對該領(lǐng)域的研究具有重大價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問題是提供一種利用長期高尿酸血癥誘導(dǎo)小鼠痛風(fēng)模型的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：所提供的一種利用長期高尿酸血癥誘導(dǎo)小鼠痛風(fēng)模型的方法，包括如下步驟：

(1)建立高尿酸血癥誘導(dǎo)痛風(fēng)動物模型

(2)小鼠痛風(fēng)動物模型的鑒定分析

優(yōu)選的，所述步驟(1)中所述的建立小鼠痛風(fēng)模型的方法包括以下步驟：將小鼠隨機分配，分為實驗造模組和空白對照組；其中，實驗造模組的小鼠，喂高脂飼料進行飼養(yǎng)，同時每天腹腔注射40mg/mL氧嗪酸鉀200uL，每隔4天在小鼠后腳掌處注射1％醋酸溶液；空白對照組小鼠的小鼠，喂食普通飼料，每隔4天在后腳掌注射1％醋酸溶液。

優(yōu)選的，所述步驟(2)所述的對小鼠痛風(fēng)動物模型的鑒定分析包括以下項目：

(A)對建模小鼠后肢關(guān)節(jié)進行腫脹程度的觀察。

(B)模型小鼠行為學(xué)觀察：

對模型小鼠后肢腫脹程度，熱敏感程度，抓握能力，四肢關(guān)節(jié)腔尿酸鹽含量四個方面進行測定。

(C)對成模小鼠后肢病理切片驗證。

優(yōu)選的，所述的氧嗪酸鉀為尿酸氧化酶抑制劑。

優(yōu)選的，所述小鼠選用雄性小鼠。

優(yōu)選的，所述實驗造模組和空白對照組的小鼠飼養(yǎng)時間為70天。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明克服了現(xiàn)有的模型構(gòu)建技術(shù)的缺陷，提供一種與人類患病機理相似的，由長期高尿酸血癥誘導(dǎo)形成的小鼠痛風(fēng)動物模型，用于痛風(fēng)發(fā)病機理的研究，具體方法為通過誘導(dǎo)肥胖型小鼠長期保持較高的尿酸水平，損壞并破壞模型動物后肢關(guān)節(jié)及其pH環(huán)境的基礎(chǔ)上建立小鼠痛風(fēng)動物模型。

本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明在原有的技術(shù)基礎(chǔ)上，對模型動物關(guān)節(jié)進行損傷并破壞其pH環(huán)境，加快了建模時間，并且能更好的模仿人類痛風(fēng)發(fā)病過程，且該方法操作簡便，經(jīng)濟，易于操作。

(2)本發(fā)明為由長期高尿酸血癥誘導(dǎo)建立的痛風(fēng)動物模型，與人痛風(fēng)臨床現(xiàn)象高度相似。

(3)發(fā)明建立得到的動物模型使用方便，極具研究價值和醫(yī)療用途前景。

附圖說明

圖1為痛風(fēng)模型成膜后小鼠后肢腫脹程度的觀察(A為建模前小鼠腳掌,B為痛風(fēng)模型小鼠腳掌)

圖2為痛風(fēng)模型小鼠相關(guān)指標(biāo)的測定；

其中，圖A為小鼠腳掌腫脹程度(mm)，B為小鼠熱痛敏感度(s)，C為小鼠懸掛持續(xù)時間(s)，D為小鼠四肢關(guān)節(jié)腔尿酸鹽含量(nm)。

圖3為小鼠四肢組織病理學(xué)檢查(其中，圖A/B為未做任何處理小鼠的后肢病理切片；C/D均為成模小鼠后肢病理組織切片，橘紅色部分為痛風(fēng)石。)

具體實施方式

為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施方式，進一步闡述本發(fā)明。

建立高尿酸血癥誘導(dǎo)痛風(fēng)動物模型

將雄性小鼠隨機分配，分為實驗造模組和空白對照組；其中，實驗造模組的小鼠，喂高脂飼料進行飼養(yǎng)，同時每天腹腔注射40mg/mL氧嗪酸鉀200uL，每隔4天在小鼠后腳掌處注射1％醋酸溶液；空白對照組小鼠的小鼠，喂食普通飼料，每隔4天在后腳掌注射1％醋酸溶液，連續(xù)喂食70天。

小鼠痛風(fēng)動物模型的鑒定分析

(A)對建模小鼠后肢關(guān)節(jié)進行腫脹程度的觀察

由圖1所示，通過對實驗造模組小鼠造模前后的關(guān)節(jié)腫脹程度進行觀察，可以發(fā)現(xiàn)，模型小鼠相比于建模前，后肢關(guān)節(jié)明顯紅腫，并且部分小鼠出現(xiàn)塊狀突起。

(B)模型小鼠行為學(xué)觀察：

對實驗造模組與空白對照組小鼠從后肢腫脹程度，熱敏感程度，抓握能力，四肢關(guān)節(jié)腔尿酸鹽含量四個方面進行觀察、測定、對比后發(fā)現(xiàn)，模型小鼠腳掌腫脹、熱敏感度更高、抓握能力下降，四肢關(guān)節(jié)腔尿酸鹽含量增加。

由圖2A所示，模型組小鼠腳掌腫脹程度明顯高于空白對照組小鼠，證明模型小鼠腳掌腫脹；

圖2B所示，將小鼠放入到55℃的熱板上后，相比于空白對照小鼠，模型小鼠在更短的時間內(nèi)舔舐腳掌，說明模型小鼠熱痛敏感度更高；

圖2C所示，在相同的條件下，模型小鼠對鼠籠架的抓握時間較短，遠不如空白組小鼠抓握鼠籠架的時間長，說明模型小鼠的抓握能力要低于空白試驗組小鼠。

圖2D所示，實驗組小鼠四肢關(guān)節(jié)腔內(nèi)的尿酸鹽含量明顯高于空白對照組小鼠，實驗組小鼠在經(jīng)過長期注射氧嗪酸鉀懸浮液后，有更多的尿酸鹽沉積在其四肢關(guān)節(jié)腔中。

因此，我們認(rèn)為，模型組小鼠關(guān)節(jié)處已有痛風(fēng)病變發(fā)生。

(C)對成模小鼠后肢病理切片驗證

為了進一步驗證小鼠后肢中是否含有尿酸鈉晶體，對部分后腳掌關(guān)節(jié)處出現(xiàn)塊狀腫脹的小鼠，制作病理切片，通過六胺銀染色檢驗該物質(zhì)所含成分。

圖3A\B是空白小鼠后肢石蠟病理切片，由于該小鼠后肢關(guān)節(jié)中不含有尿酸鹽成分，因此經(jīng)六胺銀染色后，未發(fā)現(xiàn)有尿酸鹽成分；圖3C\D是模型組小鼠后肢關(guān)節(jié)石蠟切片，經(jīng)六胺銀染色后，出現(xiàn)橙紅色染色組織，由于模型小鼠白色結(jié)晶物質(zhì)為混合物，因此導(dǎo)致經(jīng)六胺銀染色后，痛風(fēng)部位是被染成橙紅色。在上圖所示的各組小鼠病理切片可知，實驗組小鼠已成功建模，經(jīng)六胺銀染色后，可清楚的看到成模小鼠后肢有尿酸鹽晶體的沉積物。

綜合上述，本發(fā)明所涉及的小鼠痛風(fēng)動物模型建立的方法更接近人類痛風(fēng)疾病的發(fā)病機制，可以最大程度上的模擬臨床上形成的痛風(fēng)疾病，有利于研究人類痛風(fēng)疾病的發(fā)病機制以及治療藥物靶點的設(shè)計。本發(fā)明建立的動物模型使用方便，極具研究價值和醫(yī)藥用途的前景。

顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進行的各種非實質(zhì)性的改進，或未經(jīng)改進將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。