本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

胰腺纖維化是各種原因所致慢性胰腺炎的共同特征,同時(shí)也是與其伴隨的組織病理學(xué)特點(diǎn),表現(xiàn)為大量成纖維細(xì)胞增生和富含連接組織的細(xì)胞外基質(zhì)。是多種原因?qū)е乱认贀p傷修復(fù)的結(jié)果，近期發(fā)現(xiàn)胰腺星狀細(xì)胞和多種細(xì)胞因子與胰腺纖維化有關(guān)，胰腺纖維化目前發(fā)病率愈來(lái)愈高，急需研發(fā)高效低毒的抗胰腺纖維化藥物。

胰腺纖維化的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問(wèn)題，從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2009年發(fā)表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗胰腺纖維化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗胰腺纖維化活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為70％和30％。

本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗胰腺纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽具有同樣的藥效。

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 化合物Harrisotone A的制備

化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。

實(shí)施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌3h。3h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₅₀Br₃O₆:793.1137；found 793.1134.

實(shí)施例3 Harrisotone A的O-(二乙氨基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙胺(2920mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的淡黃色固體(246.1mg,64％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.13(s,2H),4.19(s,2H),3.52(d,J＝5.3Hz,4H),3.21(s,2H),3.04(s,2H),2.85(s,12H),2.64(d,J＝13.5Hz,4H),2.33(s,3H),2.18(s,1H),2.11(s,2H),2.04(s,1H),1.98(s,1H),1.88(s,1H),1.77(d,J＝5.0Hz,7H),1.70(d,J＝15.5Hz,7H),1.61(s,1H),1.54(s,1H),1.44(s,1H),1.37(s,1H),1.10(s,24H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.18(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.15(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),52.53(s),51.93(s),50.76(s),47.69(s),45.04(s),39.51(s),36.43(s),30.63(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.57(s),18.04(s),12.27(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₈₀N₃O₆:770.6047；found:770.6044。

實(shí)施例4 Harrisotone A的O-(哌嗪基)乙基衍生物的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于16mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和無(wú)水哌嗪(6892mg，80mmol)，混合物加熱回流1h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到化合物IV的淡棕色固體(286.9mg,71％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.21(s,2H),3.53(d,J＝6.2Hz,4H),3.09(s,2H),3.05(s,2H),2.66(s,12H),2.57–2.53(m,4H),2.33(d,J＝15.0Hz,15H),2.24(s,1H),2.14(s,2H),2.10(s,1H),2.00(s,1H),1.88(d,J＝10.5Hz,3H),1.79(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.63(s,1H),1.55(s,1H),1.46(s,1H),1.15–1.05(m,8H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.28(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.25(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),54.35(s),54.16(s),53.66(s),50.78(s),45.24(s),45.06(s),39.49(s),36.45(s),30.61(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.58(s),18.04(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₇₇N₆O₆:809.5905；found:809.5901。

實(shí)施例5 組合物抗胰腺纖維化活性

1材料

1.1動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重180-200g。

1.2組合物劑量：0.9mg/kg。

組合物的制備：將研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的70mg化合物III的粉末和研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的30mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1造模方法：Wistar大鼠以腹腔注射dl-乙硫氨酸250mg/天，連續(xù)2個(gè)月，可出現(xiàn)胰臟腺細(xì)胞減少，間質(zhì)內(nèi)脂肪及結(jié)締組織的增生。

2.2分組及給藥方法

模型大鼠隨機(jī)分為模型組，組合物0.9mg/kg組、化合物III 0.9mg/kg組和化合物IV 0.9mg/kg組，另設(shè)空白對(duì)照組。給藥組于造模開(kāi)始后給藥，口服連續(xù)30天；60天時(shí)解剖動(dòng)物。

2.3檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取胰臟稱重。

2.3.2胰臟羥脯氨酸含量測(cè)定取100mg樣本在水中勻漿，110℃10N HCl中水解20小時(shí)。HCl用氮?dú)鈸]發(fā)，水解產(chǎn)物用雙蒸水溶解后過(guò)濾。取0.5ml液體與3ml枸櫞酸磷酸緩沖液(0.15M枸櫞酸加0.6M磷酸氫二鈉)和0.5ml溶于9M磷酸的1M過(guò)碘酸混合。加1.75ml提取緩沖液(5份甲苯：5份2-甲基-1-丙醇：2份1-丙醇)，震蕩30min，離心。組織相(0.6ml)與Ehrlich,s試劑混合放置15min。在565nm測(cè)定吸收度，用4-羥-1-脯氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，含量以u(píng)g/g組織表示。

2.3.3組織學(xué)檢查胰臟組織用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，染色后鏡檢。對(duì)纖維化情況評(píng)分(0-3分)。

3結(jié)果

3.1組合物對(duì)大鼠胰臟臟器系數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將大鼠處死、解剖，稱量體重和胰臟重并計(jì)算其與體重的比值(胰臟臟器系數(shù))，結(jié)果見(jiàn)表1。組合物對(duì)胰臟臟器系數(shù)的影響，與模型組比較有顯著性差異?；衔颕II和化合物IV對(duì)胰臟臟器系數(shù)的影響，與模型組比較無(wú)顯著性差異。

表1

*表示p<0.05，與模型組比較

3.2胰臟羥脯氨酸含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)各組大鼠進(jìn)行肺部羥脯氨酸含量測(cè)定，結(jié)果如表2。組合物對(duì)羥脯氨酸含量的影響，與模型組比較有顯著性差異?；衔颕II和化合物IV對(duì)羥脯氨酸含量的影響，與模型組比較無(wú)顯著性差異。

表2

*表示p<0.05，與模型組比較

3.3組織學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將大鼠處死、解剖；標(biāo)本常規(guī)包埋、固定、HE染色，鏡檢。

結(jié)果：模型組第60天可見(jiàn)胰導(dǎo)管周?chē)鷩?yán)重炎癥反應(yīng)；嗜中粒細(xì)胞核淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，出血以及偶見(jiàn)胰泡細(xì)胞壞死；胰泡細(xì)胞消失位置及胰泡間出現(xiàn)纖維化。

組合物可減少炎癥反應(yīng)和纖維化。評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表3。組合物對(duì)評(píng)分的影響，與模型組比較有顯著性差異。

表3

*表示p<0.05，與模型組比較；空白對(duì)照組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化評(píng)分都為0.

結(jié)論：本發(fā)明通過(guò)組合物對(duì)大鼠胰腺纖維化的影響，證實(shí)了組合物具有抗胰腺纖維化的作用。因此，組合物可作為活性成分用于制備抗胰腺纖維化的藥物。而化合物III和化合物IV無(wú)此活性，不能用于制備抗胰腺纖維化的藥物。

實(shí)施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。

實(shí)施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。