本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，涉及化合物sclerotiorin在制備抗結核病藥物中的應用。

背景技術：

結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，通常影響肺部，是全世界最主要的致命傳染病之一。結核病在世界的各個地方都會發(fā)生，主要集中在亞非拉地區(qū)，全世界約有三分之一的人口有潛伏性結核。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2015全球結核病控制報告，在2015年，共有960萬人患結核病，150萬人死于結核病。雖然在過去的二十年，中國結核病例及死亡率持續(xù)大幅下降，但中國在世界十大結核病高發(fā)國家中排名第三，僅次于印度、印尼。結核病是一種可治可防的疾病，標準的抗結核藥物已經(jīng)使用了數(shù)十年，但結核分枝桿菌對這些藥物的耐藥性正在不斷增長。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在2014年全世界約有48萬人患耐多藥結核病，其中超過一半的病例發(fā)生在印度、中國和俄羅斯。在中國，耐藥性結核病呈不斷上升的趨勢。目前，結核病防治形勢仍十分嚴峻，抗結核藥物的研制與開發(fā)迫在眉睫。

結核分枝桿菌是一種胞內(nèi)病原菌，細菌進入肺部后會被巨噬細胞吞噬，在細胞內(nèi)生長增殖。由于細菌高脂質(zhì)含量的細胞壁，抗生素類藥物難以滲透細菌發(fā)揮作用。細菌生長緩慢加上細胞壁的保護作用，細菌在遇上逆境時可進入休眠狀態(tài)，代謝活動降低，生長幾乎停止，抵抗外界不良生長環(huán)境，不易被抗菌藥物殺滅，能夠在宿主細胞內(nèi)長期潛伏，使得結核菌很難完全清除。另外，結核分枝桿菌能夠通過向細胞內(nèi)分泌效應蛋白，調(diào)整宿主的信號途徑，讓自已能夠躲避宿主的免疫反應，成功在宿主內(nèi)生長繁殖；最大程度的抑制結核分枝桿菌在宿主體內(nèi)生成是防治結核病。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，提供化合物sclerotiorin在抑制細胞內(nèi)結核分枝桿菌生長的應用。

本發(fā)明的第二個目的是提供sclerotiorin聯(lián)合一線抗生素抑制巨噬細胞內(nèi)結核分枝桿菌生長的應用。

本發(fā)明的第三個目的是提供化合物sclerotiorin在制備抗結核藥物中的應用。

本發(fā)明的第四個目的是提供化合物sclerotiorin與一線抗生素聯(lián)合在制備抗結核病的藥物中的應用。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種抑制結核分枝桿菌胞內(nèi)增殖的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：

化合物sclerotiorin在抑制細胞內(nèi)結核分枝桿菌生長的應用，所述化合物sclerotiorin的結構式為：

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前期研究發(fā)現(xiàn)化合物sclerotiorin具有很好的抑制PKnG酶活性的效果，但后期研究：利用化合物sclerotiorin對結核分枝桿菌的抑菌圈實驗和最小抑制濃度（MIC）實驗，以檢測化合物對細胞外結核分枝桿菌的生長抑制。實驗發(fā)現(xiàn)，胞外結核分枝桿菌在sclerotiorin的處理下沒有形成抑菌圈，并且在MIC測定時，最高的化合物濃度（100mg/L）下菌仍然生長，檢測孔顏色反應為粉色，說明化合物對菌的生長沒有抑制作用，因此抑制PKnG酶并不一定就能夠減少結核分枝桿菌的增殖。

本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)化合物sclerotiorin能夠抑制哺乳動物巨噬細胞內(nèi)結核分枝桿菌的增殖，所述化合物sclerotiorin可以是來源于海洋微生物天然代謝活性產(chǎn)物。

化合物sclerotiorin與利福平或者異煙肼聯(lián)合，也能夠顯著抑制巨噬細胞的增殖；具體地，化合物sclerotiorin與利福平或者異煙肼聯(lián)合對巨噬細胞J774A.1內(nèi)的牛型結核桿菌BCG的增殖具有更強的抑制作用：在單獨使用20μM，40μM，80μM濃度化合物sclerotiorin時，細胞內(nèi)結核菌數(shù)減少了23%，58%，81%；在單獨使用0.005mg/L，0.025mg/L，0.05mg/L利福平時，細胞內(nèi)結核菌數(shù)減少了51%，76%，85%；在單獨使用0.01 mg/L，0.05 mg/L，0.1 mg/L異煙肼時，細胞內(nèi)結核菌數(shù)減少了13%，30%，45%。當40 μM化合物sclerotiorin與0.025mg/L利福平聯(lián)合，胞內(nèi)抑菌率達84%，比單獨使用同濃度sclerotiorin或利福平的抑菌率明顯提高，且與單獨0.05mg/L利福平的效果相當。當40 μM化合物sclerotiorin與0.05 mg/L異煙肼聯(lián)合，胞內(nèi)抑菌率達45%，比單獨使用同濃度異煙肼的抑菌率明顯提高，與單獨0.1 mg/L異煙肼的效果相當。

因此，本發(fā)明還提供化合物sclerotiorin與一線抗生素聯(lián)用在抑制細胞內(nèi)結核分枝桿菌生長的應用，所述一線抗生素為利福平或者異煙肼；所述化合物sclerotiorin的結構式為：

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本發(fā)明還提供化合物sclerotiorin在制備抗結核藥物中的應用，所述化合物sclerotiorin的結構式為：

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本發(fā)明還提供化合物sclerotiorin與一線抗生素聯(lián)用在制備抗結核病的藥物中的應用，所述一線抗生素為利福平或者異煙肼；所述化合物sclerotiorin的結構式為：

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本發(fā)明還提供一種抑制結核分枝桿菌胞內(nèi)增殖的方法，是將20～40μM化合物sclerotiorin與0.005～0.05mg/L利福平或者0.01～0.1mg/L異煙肼共處理感染10⁶CFU的結核分枝桿菌的細胞。

具體地，上述方法可以是：以小鼠肺泡巨噬細胞J774A.1為宿主細胞，用牛型結核桿菌（Mycobacterium bovis）BCG菌株對細胞進行感染，感染結束后使用20～40μM sclerotiorin與0.005～0.05mg/L利福平或者0.01～0.1mg/L異煙肼共處理細胞，72小時后裂解細胞，將裂解液涂布于7H10平板上，37℃倒置培養(yǎng)3～4周，對平板上長出的結核菌落進行計數(shù)以測定胞內(nèi)細菌的增殖情況。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)化合物sclerotiorin能夠抑制結核分枝桿菌在細胞內(nèi)的增殖，且與利福平或者異煙肼聯(lián)合，能夠有效地減少巨噬細胞內(nèi)結核分枝桿菌的增殖，化合物sclerotiorin是從海洋微生物分離的天然代謝活性小分子產(chǎn)物，其結構已被解析，可通過大規(guī)模發(fā)酵分離生產(chǎn)，來源豐富，生產(chǎn)成本低；在40μM 化合物sclerotiorin與0.025mg/L利福平處理下，或者在40μM 化合物sclerotiorin與0.05 mg/L異煙肼處理下，細胞內(nèi)的結核分枝桿菌數(shù)量分別減少了84%、45%，且在減少抗生素用量的前提下達到相當?shù)男Ч槐景l(fā)明具有結核病治療的臨床應用潛力。

附圖說明

圖1為單獨使用不同濃度化合物sclerotiorin處理后細胞內(nèi)結核菌數(shù)；其中，橫坐標對應化合物sclerotiorin的濃度，分別為0 μM，20μM，40μM，80μM，縱坐標是細胞內(nèi)結核菌數(shù)（菌落形成單位，CFU）。

圖2為化合物sclerotiorin與利福平聯(lián)合處理后細胞內(nèi)結核菌數(shù)；其中，橫坐標是利福平的濃度，縱坐標是細胞內(nèi)活菌數(shù)（菌落形成單位，CFU），化合物sclerotiorin濃度為0 μM，20μM，40μM。

圖3為化合物sclerotiorin與異煙肼聯(lián)合處理的細胞內(nèi)結核菌數(shù)；其中，橫坐標是異煙肼的濃度，縱坐標是細胞內(nèi)活菌數(shù)（菌落形成單位，CFU），化合物sclerotiorin濃度為0 μM，20μM，40μM。

圖4為化合物sclerotiorin與鏈霉素聯(lián)合處理的細胞內(nèi)結核菌數(shù)；其中，橫坐標是鏈霉素的濃度，縱坐標是細胞內(nèi)活菌數(shù)（菌落形成單位，CFU），化合物sclerotiorin濃度為0 μM，20μM，40μM。

圖5為化合物sclerotiorin與乙胺丁醇聯(lián)合處理的細胞內(nèi)結核菌數(shù)；其中，橫坐標是乙胺丁醇的濃度，縱坐標是細胞內(nèi)活菌數(shù)（菌落形成單位，CFU），化合物sclerotiorin濃度為0 μM，20μM，40μM。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

化合物sclerotiorin用DMSO進行溶解，母液濃度為20mM，在-20℃避光下保存。

利福平用DMSO進行溶解，母液濃度為50 mg/mL，在20℃避光下保存。

異煙肼用去離子水溶解，抽濾、滅菌，母液濃度為10 mg/mL，在20℃避光下保存。

牛型結核桿菌（Mycobacterium bovis）BCG菌株的培養(yǎng)：培養(yǎng)結核分枝桿菌所用的7H9（美國BD公司產(chǎn)品）和7H11（美國BD公司產(chǎn)品）培養(yǎng)基，均添加了終濃度為0.5%的甘油和10%的OADC增菌液（美國BD公司產(chǎn)品）。另外，7H9培養(yǎng)基還需添加0.05% Tween 80。牛型結核桿菌BCG接種于7H11平板上，37℃倒置培養(yǎng)2～3周，直至平板上長出一層菌苔。

小鼠肺泡巨噬細胞J774A.1的培養(yǎng)：小鼠肺泡巨噬細胞J774A.1生長在含10%牛血清（FBS，美國Gibco公司產(chǎn)品）的RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司產(chǎn)品），于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁生長的匯聚度達到80%時，進行傳代。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入2 mL RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕晃動以除去未貼壁的細胞。棄上清，加入2 mLRPMI1640培養(yǎng)基，用細胞刮收集瓶中的J774A.1細胞，置于15 mL離心管中，1000 rpm離心3分鐘。棄上清，加入2 mL含10% 牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，充分吹打重懸細胞。將細胞重懸液加入7 mL含10% 牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃的 CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

實施例1 J774A.1胞內(nèi)增殖實驗

當小鼠肺泡巨噬細胞J774A.1貼壁匯聚度達到80%～90%時，棄培養(yǎng)基，加入預熱的RPMI1640培養(yǎng)基把不貼壁的細胞洗脫下來。加入2 mL RPMI1640培養(yǎng)基，用細胞刮收集細胞并置于15 mL離心管中，室溫1000rpm離心3分鐘。棄上清，用1 mL含10% 牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞。取少量重懸細胞，用血球計數(shù)器對細胞計數(shù)，計算細胞密度。用含10% 牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將細胞重懸液的密度調(diào)節(jié)至1×10⁶個/mL，按1 mL/孔將稀釋后的細胞分裝至6孔細胞培養(yǎng)板中。將細胞板置于37℃的 CO₂培養(yǎng)箱過夜，使細胞充分貼壁。

在7H11平板上，刮取2～3周菌齡的牛型結核桿菌BCG菌苔，并用20 mL預熱的PBS緩沖液重懸，加入5 mL玻璃珠渦旋震蕩10分鐘。600 rpm離心10分鐘，保留上清菌液。用預熱的含10% 牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液將菌液稀釋至濃度為1×10⁷ CFU/mL，按100 μL/孔將稀釋后的菌液加入至過夜培養(yǎng)的6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃的 CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時，讓細胞吞噬結核菌。4小時后，棄培養(yǎng)液，按2 mL/孔用預熱的PBS洗細胞3次，將沒有吞入細胞的結核菌洗掉。分別加入3 mL含有不同濃度化合物sclerotiorin、sclerotiorin與利福平、sclerotiorin與異煙肼、sclerotiorin與鏈霉素、sclerotiorin與乙胺丁醇的細胞培養(yǎng)液，置于37℃的 CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時。3天后，按2 mL/孔用預熱的PBS洗細胞3次，加入1 mL 0.05% SDS，靜置5分鐘。將細胞裂解液置于15 mL離心管，渦旋震蕩5分鐘，充分裂解細胞及懸浮菌體。用7H9培養(yǎng)基對裂解液進行適當稀釋，均勻涂布于7H11平板，37℃倒置培養(yǎng)3～4周后，計算菌落數(shù)，結果如表1和表2。

從圖1可以看出，單獨使用20μM，40μM，80μM濃度化合物sclerotiorin時，細胞內(nèi)結核菌數(shù)分別減少23%，58%，81%。

從圖2和表1可以看出，單獨使用0.005mg/L，0.025mg/L，0.05mg/L利福平時，細胞內(nèi)結核菌數(shù)減少了51%，76%，85%；當40 μM化合物sclerotiorin與0.025mg/L利福平聯(lián)合，胞內(nèi)抑菌率達84%，比單獨使用同濃度sclerotiorin或利福平的抑菌率明顯提高，且與單獨0.05mg/L利福平的效果相當。

從圖3和表2可以看出，單獨使用0.01 mg/L，0.05 mg/L，0.1 mg/L異煙肼時，細胞內(nèi)結核菌數(shù)減少了13%，30%，45%。當40 μM化合物sclerotiorin與0.05 mg/L異煙肼聯(lián)合，胞內(nèi)抑菌率達45%，比單獨使用同濃度異煙肼的抑菌率明顯提高，與單獨0.1 mg/L異煙肼的效果相當，當使用化合物sclerotiorin時，可以減少一半抗生素異煙肼的用量。

對比例1

實驗方法同實施例1，不同的是測定化合物sclerotiorin與臨床抗結核藥物鏈霉素的聯(lián)合作用（圖4），結果表明：當把化合物sclerotiorin加入到不同濃度的鏈霉素后，兩種合用藥物的胞內(nèi)活菌數(shù)明顯上升，抑菌率下降，即化合物sclerotiorin與鏈霉素聯(lián)合不能增強胞內(nèi)抑制結核分枝桿菌生長的效果，反而降低藥效，相互拮抗。

對比例2

實驗方法同實施例1，不同的是測定化合物sclerotiorin與臨床抗結核藥物乙胺丁醇的聯(lián)合作用效果（圖5），結果表明：當把化合物sclerotiorin加入到不同濃度的乙胺丁醇后，兩種合用藥物的胞內(nèi)活菌數(shù)增加，抑菌率比單獨用藥有所下降，即化合物sclerotiorin與乙胺丁醇組合不適于聯(lián)合治療。