本發(fā)明涉及一種金英黃歸注射劑的制備方法，屬于獸藥
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：經(jīng)皮給藥導致有效成分揮發(fā)或減少、口服給藥劑量大，此外還存在藥物在胃腸道易被破壞的“首過效應”及某些藥物難以通過“血乳屏障”等缺點。中藥注射劑是我國所獨有的新型中藥劑型，以注射給藥的方式，改變了傳統(tǒng)劑型的給藥途徑，具有起效快、生物利用度高等特點，能較好地發(fā)揮中藥治療急病重癥的作用，成為中藥臨床應用的突破口。但是，由于其組方復雜、成分難以確定、制備工藝相對落后、質(zhì)量檢驗標準低等原因，近年來，有關不良反應的報道日益增多。因此，改善制備工藝、提高檢驗標準是控制中藥注射劑質(zhì)量促進中醫(yī)藥事業(yè)蓬勃發(fā)展的關鍵問題?，F(xiàn)有的金英黃歸注射劑制備工藝復雜，有效成分丟失較多，成品不穩(wěn)定，易生成沉淀，因此，研究一種解決上述問題的金英黃歸制劑，顯得尤為必要。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種金英黃歸注射劑的制備方法，操作簡單易實現(xiàn)，制備的金英黃歸注射劑有效成分含量高。為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，原料藥中加入乙醇浸泡，隨后回流提取，過濾；藥渣加乙醇回流提取，過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到75％～85％，進行醇沉，在4℃下放置16～20h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液，再加入輔料制成注射劑。具體地，前述金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，原料藥中加入50％～60％乙醇浸泡25～35min，隨后回流提取2～3h，多層紗布過濾；藥渣加50％～60％乙醇回流提取1～2h，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到75％～85％，進行醇沉，在4℃下放置16～20h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液；混合液中加入明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置2～3h，使沉淀沉降，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置2～3h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，再加入活性炭，煮沸15～30min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。優(yōu)選地，前述金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，原料藥中加入50％乙醇浸泡30min，隨后回流提取2h，多層紗布過濾；藥渣加50％乙醇回流提取1.5h，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到80％，進行醇沉，在4℃下放置16h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液；混合液中加入明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置2h，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置2h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH值至7.2，再加入活性炭，煮沸15min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。前述金英黃歸注射劑的制備方法中，原料藥中加入乙醇浸泡，原料藥與乙醇的料液比為1g︰9～15mL。前述金英黃歸注射劑的制備方法中，藥渣加乙醇回流提取，藥渣與乙醇的料液比為1g︰8～12mL。前述金英黃歸注射劑的制備方法中，混合液的濃度為1.00g·mL-1。前述金英黃歸注射劑的制備方法中，明膠溶液的濃度為0.05～0.10g·mL-1。前述金英黃歸注射劑的制備方法中，亞硫酸鈉的加入量為藥液總質(zhì)量的0.10％～0.20％。前述金英黃歸注射劑的制備方法中，活性炭的加入量為藥液總質(zhì)量的0.10％～0.50％。前述金英黃歸注射劑的制備方法中，原料藥的用量，按照重量份數(shù)計為：金銀花80～100份、蒲公英80～100份、瓜蔞80～100份、連翹60～80份、芙蓉花40～60份、大黃20～40份、黃芪20～40份和當歸10～30份。為了確保本發(fā)明方案的合理、有效，發(fā)明人進行了一系列實驗。一、原料與儀器1、主要藥物金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、大黃、黃芪、當歸于2013年購自貴陽市同濟堂藥店(藥品GMP證號:黔J0190)，金銀花為忍冬科植物忍冬LoniceraejaponicaThunb.的干燥花蕾，蒲公英為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.的干燥全草，瓜蔞為葫蘆科植物栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim.的干燥果實，連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果實，大黃為蓼科植物藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根，黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge.的干燥根莖，當歸為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根，芙蓉花為錦葵科植物木芙蓉(HibiscusmutabilisL.)的花，2013年10月采自貴陽花溪濕地公園。綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：119753-201314，純度>96.65)，連翹酯苷A對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：HN1116XA13，純度≥98％)。2、主要試劑無水乙醇、無水亞硫酸鈉、明膠、氫氧化鈉等有機化學試劑，均為國產(chǎn)分析純、化學純或色譜純試劑。3、主要實驗儀器AgilentTechnologies1260Infinity液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗機，上海冠特超聲儀有限公司；回流提取裝置，河南一恒儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；MultiskanGo型全波段酶標儀，Thermo公司；賽多利斯TE64電子分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。二、金英黃歸注射劑制備工藝的確定1、醇沉工藝的選擇1.1、醇沉條件的篩選采用L9(34)正交實驗考察乙醇濃度、醇沉時間、醇沉溫度3個因素對提取效果的影響。以綠原酸和連翹酯苷A的含量為評價指標，正交試驗設計及結(jié)果見表1和表2。表1正交實驗因素及水平表2正交實驗設計及結(jié)果1.2、醇沉次數(shù)的篩選對每次醇沉后得到的沉淀(藥渣)進行反復醇沉，每次醇沉得到的上清液與上一次的上清液合并，以其中綠原酸和連翹酯苷A的含量評價指標，篩選出最合適的醇沉次數(shù)。實驗結(jié)果見表3。表3醇沉次數(shù)的篩選結(jié)果綜合醇沉條件的篩選和醇沉次數(shù)的篩選試驗，實驗結(jié)果表明：醇沉的最佳條件是乙醇濃度為80％，放置4℃醇沉16～20h。在醇沉后可以將藥渣回收醇沉一次，合并濾液，這樣可以提高有效成分的含量。2、鞣質(zhì)去除方法選擇2.1、醇溶液調(diào)pH值法按照本發(fā)明的方法制備金英黃歸注射劑時，在采用最佳醇沉濃度醇沉后，用40％NaOH調(diào)pH至7.5～8.0，再冷藏過夜、過濾去除沉淀。然后對樣品進行鞣質(zhì)檢查，即取樣液1.00mL，加稀醋酸1滴，再加明膠氯化鈉試液(含明膠1wt.％、氯化鈉10wt.％的水溶液)4～5滴，不得出現(xiàn)渾濁或沉淀。實驗結(jié)果明顯出現(xiàn)沉淀，表明此法對本藥液除鞣質(zhì)效果不好。2.2、明膠沉淀法按照本發(fā)明的方法制備金英黃歸注射劑時，在采用最佳醇沉濃度醇沉后，隨后加入濃度為0.10g·mL-1的明膠溶液于該藥液中，至不產(chǎn)生沉淀為主，靜置2h，濾過除去沉淀，濾液濃縮后加無水乙醇至濃度達到>75％，以除去過量的明膠。然后對樣品進行鞣質(zhì)檢查，實驗結(jié)果無渾濁或沉淀現(xiàn)象出現(xiàn)，表明此法可用于該藥液鞣質(zhì)的去除。3、輔料的選擇結(jié)合本注射劑的理化性質(zhì)，加入抗氧化劑作為輔料即可。本發(fā)明中選用亞硫酸鈉作為輔料。中國藥典規(guī)定中藥注射劑中抗氧化劑(亞硫酸鈉)的含量為0.10％～0.20％，因此，本發(fā)明中亞硫酸鈉的加入量為藥液總質(zhì)量的0.10％～0.20％。優(yōu)選為0.15％。4、pH值的選擇按照本發(fā)明的方法制備金英黃歸注射劑，在加入輔料后量取等量的該注射劑6份，分別調(diào)pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，綜合藥液的澄明度、溶解度及所用機體所需pH值觀察試驗結(jié)果。結(jié)果表明當pH值為7.0與7.5時溶液的澄明度、溶解度最好，故將金英注射劑的pH值定為7.0～7.5。5、滅菌方法的選擇將按照本發(fā)明的方法制備金英黃歸注射劑，并加入輔料和調(diào)好pH值后所得成品藥液作為實驗對象。5.1、高壓濕熱滅菌法將所得成品藥液用立式壓力蒸汽滅菌器以115℃的條件滅菌15min，滅菌之后按中國藥典規(guī)定方法(2010年版一部附錄ⅪH)進行無菌檢查及進行綠原酸和連翹酯苷A的含量測定。實驗結(jié)果見表4。5.2、0.22μm濾膜過濾法將所得成品藥液采用水系的0.22μm無菌濾膜過濾，然后進行綠原酸和連翹酯苷A的含量測定。實驗結(jié)果表明采用0.22μm濾膜過濾法更適合金英注射劑的滅菌。實驗結(jié)果見表4。表4滅菌后綠原酸與連翹酯苷A的含量變化6、金英注射劑成型工藝路線綜上，篩選出的成型工藝路線為：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，原料藥中加入50％～60％乙醇浸泡25～35min，隨后回流提取2～3h，多層紗布過濾；藥渣加50％～60％乙醇回流提取1～2h，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到75％～85％，進行醇沉，在4℃下放置16～20h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液；混合液中加入明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置2～3h，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置2～3h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，再加入活性炭，煮沸15～30min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。三、金英黃歸注射劑的檢查1、安全性試驗1.1、溶血試驗：取健康大白鼠血液放于燒杯中，用玻璃棒攪動血液(以除去纖維蛋白質(zhì))，加入0.90％氯化鈉溶液約10倍量搖勻，每分鐘1500轉(zhuǎn)離心15min，除去上清液。沉淀的紅細胞再用0.9％氯化鈉溶液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9％氯化鈉溶液制成2％的混懸液，供試驗用。將潔凈玻璃試管5支，編號為1、2、3、4、5號，其中1、2號為供試品(本發(fā)明注射劑)管，3號為陰性對照管，4號為陽性對照管，5號為供試品對照管。按下列方法加樣，混勻后，立即置37±0.5℃的恒溫箱中進行溫育，3h后觀察溶血與凝聚反應。試驗方案見表5。表5實驗結(jié)果：如試管中的溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或少量紅細胞殘留，表明有溶血現(xiàn)象。如紅細胞全部下沉，上清液無色澄明，或上清液雖有色澄明，表明無溶血發(fā)生。若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細胞凝聚發(fā)生。結(jié)果顯示，1、2號和5號肉眼觀察無明顯差異，供試品管(本發(fā)明注射劑)與陽性對照管相比，雖有輕微的溶血現(xiàn)象，但溶血現(xiàn)象不是很明顯，表明該注射劑符合肌肉注射溶血性試驗要求。1.2、急性毒性試驗(1)腹腔給藥：選取體重20±2g的健康SPF級小鼠20只，雌雄各半。按5g/Kg的量腹腔注射濃度為0.50g·mL-1的本發(fā)明注射劑。正常飼養(yǎng)2個星期，觀察小鼠的死亡率。實驗結(jié)果顯示，20只小鼠死亡數(shù)為0，表明本發(fā)明注射劑沒有表現(xiàn)出急毒現(xiàn)象。(2)尾靜脈給藥：選取體重20±2g的健康SPF級小鼠20只，雌雄各半。每只尾靜脈緩慢注射0.2mL的本發(fā)明注射劑。正常飼養(yǎng)2個星期，觀察小鼠的死亡率。實驗結(jié)果顯示，20只小鼠死亡數(shù)為0，表明本發(fā)明注射劑沒有表現(xiàn)出急毒現(xiàn)象。2、初步穩(wěn)定性考察取本發(fā)明注射劑，分別進行影響因素試驗、加速試驗和留樣觀察。2.1、影響因素試驗2.1.1、強光照射試驗取本發(fā)明注射劑，除去外包裝后分別置于培養(yǎng)皿中，使藥液面﹤1cm，在(4500±500)LX光照度下放置10d，分別于第5d、10d取樣測定，并與0d結(jié)果比較，分別考察本發(fā)明注射劑的澄明度、性狀、pH值和含量測定，進行三個平行實驗，結(jié)果取平均值。結(jié)果表明，本發(fā)明注射劑在光照條件下放置10d，pH值和外觀澄明度指標則未發(fā)生明顯改變，但綠原酸和連翹酯苷A的含量降低了，且連翹酯苷A的含量變化比綠原酸的含量變化大，說明強光對連翹酯苷A的影響較綠原酸大。實驗結(jié)果見圖1、表6。表6強光照射試驗結(jié)果2.1.2、高溫試驗取本發(fā)明注射劑，除去外包裝后置于試管中，在60℃條件下放置10d，分別與第5d、10d取樣測定，并與0d結(jié)果比較，分別考察本品的澄明度、性狀、pH值和含量測定，進行三個平行實驗，結(jié)果取平均值。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明注射劑在高溫條件下放置10d，高溫能明顯降低綠原酸的含量，但不會隨著時間的增加而一直降低，高溫對連翹酯苷A的影響比較小，其含量降低比較少，此外，高溫也對pH值有一定的影響使其降低。實驗結(jié)果見圖2、表7。表760℃高溫試驗結(jié)果2.2、加速試驗取本發(fā)明注射劑三批(樣1：20150421、樣2：20150429、樣3：20150506)，置于35℃、相對濕度為75％條件下放置6個月，分別于0、1、2、3、6月時分別取樣測定，并與0月時樣品數(shù)據(jù)比較。實驗結(jié)果見表8、圖3-5。表8加速實驗結(jié)果2.3、留樣考察取本發(fā)明注射劑三批(樣1：20150421、樣2：20150429、樣3：20150506)，分別置于4℃和室溫條件下放置6個月，分別于0、1、2、3、6月時分別取樣測定，并與0月時樣品數(shù)據(jù)比較。實驗結(jié)果見表9-10、圖6-11。表9冰箱4℃實驗結(jié)果表10室溫留樣實驗結(jié)果本發(fā)明注射劑經(jīng)強光照射、高溫、低溫等影響因素試驗及加速試驗，留樣考察6個月，表明本發(fā)明注射劑對光和熱敏感，應在避光低溫的條件下保存，其性狀、溶液的澄明度與顏色、有關物質(zhì)、含量等指標才無明顯變化。四、工藝改進前、后生物活性和有效成分含量對比傳統(tǒng)的金英黃歸注射劑的制備方法為：將8味中藥按比例混合，稱取一定量，加入50％乙醇浸泡30min，回流提取2h，多層紗布過濾。藥渣再加50％乙醇，回流提取1.5h，多層紗布過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味后定容至1.00g·mL-1。加入石油醚萃取，水相濃縮至1.00g·mL-1。加乙醇于溶液中連續(xù)進行3次醇沉，溶液中乙醇的濃度依次為70％、75％及80％，于4℃進行醇沉24h，取80％乙醇醇沉后的上清進行52℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，將無醇的濃縮液加入注射用水，制備成1.00g·mL-1的溶液，為澄明透亮的淡黃色液體狀。加0.50％活性炭，煮沸，攪拌15min，過濾到熱源處理后的容器中，制備成1.00g·mL-1的注射成品，調(diào)pH值為7.2，然后過0.22μm濾膜除菌，即得傳統(tǒng)工藝金英黃歸注射劑。1、工藝改進前后注射劑的抑菌試驗1.1、金黃色葡萄球菌標準菌液準備菌液準備主要包括復壯與計數(shù)，操作過程全部在超凈工作臺內(nèi)進行。(1)將金黃色葡萄球菌菌種接種于10％NaCl胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃下在恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h。(2)移液槍吸取1.00mL菌液用滅菌生理鹽水進行十倍梯度稀釋，稀釋8個梯度，每個梯度吸取100.00μL于營養(yǎng)瓊脂平板上，用L棒輕輕攤勻，培養(yǎng)24h,進行菌落計數(shù)。(3)通過計算，選出每毫升菌液的活細菌數(shù)量級為108/mL的菌液保存待用。本實驗所選出每毫升菌液的活細菌數(shù)為3.08×108/mL(原菌液稀釋五倍)。1.2、最小抑菌濃度(MIC)的測定采用試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)，此試驗需在無菌操作臺上進行，具體操作如下：(1)取無菌10.00mL小試管9支分成A、B組,每管中加入10％NaCl胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基1.00mL，在A組第1支試管中加金英黃歸湯1.00mL，用微量移液器混勻，吸取混勻液1.00mL至第2管混勻，依次到第7管，再從第7管吸出1.00mL混合液棄之，第8管做陽性對照(加菌液不加中藥)，第9管做陰性對照(加中藥不加菌液)，B組操作同A組，只是將藥液換成金英注射劑。此時1到7號管內(nèi)藥液的濃度分別相當于500.00mg·mL-1、250.00mg·mL-1、125.00mg·mL-1、62.50mg·mL-1、31.25mg·mL-1、15.63mg·mL-1、7.81mg·mL-1生藥濃度。(2)分別向各組的1至8號試管中加入0.10mL菌液，第9支試管中加入0.10mL普通肉湯培養(yǎng)基。(3)將各組1至9號試管置于37℃條件下培養(yǎng)18h，觀察并記錄結(jié)果。若有絮狀沉淀，則有細菌生長，若無絮狀沉淀，則細菌生長受到抑制。與對照組比較，以肉眼觀察無絮狀沉淀的試管藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。(4)結(jié)果的判斷標準:由于中草藥對細菌的MIC國內(nèi)目前尚無統(tǒng)一的標準，本實驗參照同類實驗的標準作為判斷標準。即當MIC<7.81mg·mL-1生藥濃度時為高度敏感；當MIC在15.63mg·mL-1～62.50mg·mL-1生藥濃度時為中度敏感；當MIC為62.50mg·mL-1～250.00mg·mL-1生藥濃度時為較敏感；當MIC>250.00mg·mL-1生藥濃度時為不敏感。在本試驗中，傳統(tǒng)工藝金英黃歸注射劑對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為較敏感，其MIC為125.00mg·mL-1。而本發(fā)明的注射劑對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為不敏感，其MIC為500.00mg·mL-1。1.3、最低殺菌濃度(MBC)的測定(1)測出最低抑菌濃度(MIC)后，從沒有絮狀沉淀生成的試管中，用移液槍分別吸取0.10mL涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板上(每個濃度做3個平行試驗)，在電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h，觀察細菌生長情況。(2)結(jié)果判定標準：LB平板中，生長的菌落數(shù)小于5個菌落的藥液最低濃度，即為最低殺菌濃度(MBC)。在本試驗中，傳統(tǒng)工藝金英黃歸注射劑的MBC為250.00mg·mL-1，本發(fā)明注射劑的MBC>500.00mg·mL-12、工藝改進前后注射劑的抗炎試驗：2.1、對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹抑制實驗：取體重20±2g的昆明小白鼠80只，隨機分成4組，每組20只，分別為空白組、陽性組、實驗組1(傳統(tǒng)工藝金英黃歸注射劑)、實驗組2(本發(fā)明注射劑)?？瞻捉M每天灌胃0.30mL的生理鹽水，陽性組每天灌胃濃度為0.30g·mL-1的地塞米松0.30mL，實驗組1每天灌胃濃度為0.30g·mL-1的傳統(tǒng)工藝金英黃歸注射劑0.30mL，實驗組2每天灌胃濃度為0.30g·mL-1的本發(fā)明注射劑0.30mL。連續(xù)灌胃7天。在第7天給藥1h后，以每只小鼠二甲苯用量為0.03mL，均勻涂于左耳前后兩面，右耳作為對照。致炎后30min將小鼠處死，沿耳廓線剪下兩耳，用直徑9mm的不銹鋼打孔器在同一部位分別打下耳片，隨即用電子分析天平稱重，以左右耳的重量之差為腫脹度，并計算各組腫脹抑制率，用腫脹抑制率表示各中藥抗炎強度。計算公式：腫脹抑制率＝(空白組平均兩耳重量差-藥物組平均兩耳重量差)/空白組平均兩耳重量差×100％。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果見表11。表11注：“*”表示與空白組差異顯著(P<0.05)。2.2、對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增加實驗取體重20±2g的昆明小白鼠80只，隨機分成4組，每組20只，分別為空白組、陽性組、實驗組1(傳統(tǒng)工藝金英黃歸注射劑)、實驗組2(本發(fā)明注射劑)。空白組每天灌胃0.30mL的生理鹽水，陽性組每天按4mg·kg-1的劑量灌胃撲爾敏，實驗組1每天灌胃濃度為0.30g·mL-1的傳統(tǒng)工藝金英黃歸注射劑0.30mL，實驗組2每天灌胃濃度為0.30g·mL-1的本發(fā)明注射劑0.30mL。連續(xù)灌胃7天。在第7天給藥1h后于尾靜脈注入0.5％伊文思藍生理鹽水溶液0.10mL/10g體重，隨即腹腔注射0.6％醋酸生理鹽水0.20mL/只，20min后小鼠脫勁處死，剪開腹腔皮膚肌肉，用6.00mL生理鹽水數(shù)次洗滌腹腔，吸管吸出洗滌液。合并后加入生理鹽水至10.00mL，3000r·min-1離心15min，取上清液于酶標儀590nm波長處測吸光值(OD值)，并計算各組抑制率。抑制率＝(空白組平均伊文思藍量-藥物組平均伊文思藍量)/空白組平均伊文思藍量×100％。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果見表12。表12注：“*”表示與空白組差異顯著(P<0.05)。通過兩個抗炎試驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明注射劑與傳統(tǒng)工藝的注射劑相比，具有顯著的抑制作用(P<0.05)，表明本發(fā)明注射劑具有較好的抗炎活性。3、工藝改進前后注射劑的有效成分含量通過HPLC測定工藝改進前后注射劑中綠原酸、連翹酯苷A含量。結(jié)果如表13所示。表13成分傳統(tǒng)工藝注射劑本發(fā)明注射劑綠原酸(μg·mL-1)32.4550.84連翹酯苷A(μg·mL-1)37.5048.18由表13可知，與傳統(tǒng)制備工藝相比，采用本發(fā)明制備方法的注射劑，其有效成分含量高。表明本發(fā)明的制備方法能夠顯著減少成品中有效成分的損失。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明提供的一種金英黃歸注射劑的制備方法，工藝簡單，試劑用量少，降低成本，節(jié)約時間，能夠顯著減少成品中有效成分的損失。采用本發(fā)明制備方法制備得到的金英黃歸注射劑，成品穩(wěn)定性好，不易生成沉淀，有效成分含量高，治療效果好，不具任何化學毒性，安全性高，克服了經(jīng)皮給藥導致有效成分揮發(fā)或減少、口服給藥劑量大，且藥物在胃腸道易被破壞的“首過效應”及某些藥物難以通過“血乳屏障”等缺點。附圖說明圖1是在強光照射下本發(fā)明注射劑中綠原酸和連翹酯苷A的含量變化圖；圖2是在高溫下本發(fā)明注射劑中綠原酸和連翹酯苷A的含量變化圖；圖3是本發(fā)明注射劑(20150421)加速實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖4是本發(fā)明注射劑(20150429)加速實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖5是本發(fā)明注射劑(20150506)加速實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖6是本發(fā)明注射劑(20150421)冰箱4℃實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖7是本發(fā)明注射劑(20150429)冰箱4℃實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖8是本發(fā)明注射劑(20150506)冰箱4℃實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖9是本發(fā)明注射劑(20150421)室溫放置實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖10是本發(fā)明注射劑(20150429)室溫放置實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖11是本發(fā)明注射劑(20150506)室溫放置實驗中綠原酸、連翹酯苷A的含量變化圖；圖中附圖標記含義：圖1和圖2:1-綠原酸，2-連翹酯苷A。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的介紹。實施例1一種金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，其中，原料藥的用量，按照重量份數(shù)計為：金銀花80～100份、蒲公英80～100份、瓜蔞80～100份、連翹60～80份、芙蓉花40～60份、大黃20～40份、黃芪20～40份和當歸10～30份。原料藥中加入乙醇浸泡，隨后回流提取，過濾；藥渣加乙醇回流提取，過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到75％～85％，進行醇沉，在4℃下放置16～20h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液，混合液的濃度為1.00g·mL-1，再加入輔料制成注射劑。實施例2一種金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，其中，原料藥的用量，按照重量份數(shù)計為：金銀花80份、蒲公英80份、瓜蔞80份、連翹60份、芙蓉花40份、大黃20份、黃芪20份和當歸10份。原料藥中加入60％乙醇浸泡30min，其中原料藥與乙醇的料液比為1g︰15mL。隨后回流提取3h，多層紗布過濾；藥渣加55％乙醇回流提取1h，其中藥渣與乙醇的料液比為1g︰10mL，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到75％，進行醇沉，在4℃下放置20h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液，混合液的濃度為1.00g·mL-1；混合液中加入濃度為0.05g·mL-1的明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置2.5h，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置3h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，亞硫酸鈉的加入量為藥液總質(zhì)量的0.10％，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再加入活性炭，活性炭的加入量為藥液總質(zhì)量的0.10％，煮沸20min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。實施例3一種金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，其中，原料藥的用量，按照重量份數(shù)計為：金銀花100份、蒲公英100份、瓜蔞100份、連翹80份、芙蓉花60份、大黃40份、黃芪40份和當歸30份。原料藥中加入55％乙醇浸泡30min，其中原料藥與乙醇的料液比為1g︰9mL。隨后回流提取2.5h，多層紗布過濾；藥渣加60％乙醇回流提取2h，其中藥渣與乙醇的料液比為1g︰12mL，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到85％，進行醇沉，在4℃下放置18h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液，混合液的濃度為1.00g·mL-1；混合液中加入濃度為0.08g·mL-1的明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置3h，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置2.5h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，亞硫酸鈉的加入量為藥液總質(zhì)量的0.20％，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再加入活性炭，活性炭的加入量為藥液總質(zhì)量的0.20％，煮沸30min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。實施例4一種金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，其中，原料藥的用量，按照重量份數(shù)計為：金銀花90份、蒲公英90份、瓜蔞90份、連翹70份、芙蓉花50份、大黃30份、黃芪30份和當歸20份。原料藥中加入50％乙醇浸泡30min，其中原料藥與乙醇的料液比為1g︰10mL。隨后回流提取2h，多層紗布過濾；藥渣加50％乙醇回流提取1.5h，其中藥渣與乙醇的料液比為1g︰8mL，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到80％，進行醇沉，在4℃下放置16h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液，混合液的濃度為1.00g·mL-1；混合液中加入濃度為0.10g·mL-1的明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置2h，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置2h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，亞硫酸鈉的加入量為藥液總質(zhì)量的0.15％，調(diào)節(jié)pH值至7.2，再加入活性炭，活性炭的加入量為藥液總質(zhì)量的0.50％，煮沸15min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。實施例5一種金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，其中，原料藥的用量，按照重量份數(shù)計為：金銀花85份、蒲公英95份、瓜蔞90份、連翹75份、芙蓉花55份、大黃25份、黃芪30份和當歸10份。原料藥中加入58％乙醇浸泡30min，其中原料藥與乙醇的料液比為1g︰11mL。隨后回流提取2.2h，多層紗布過濾；藥渣加55％乙醇回流提取1.6h，其中藥渣與乙醇的料液比為1g︰9mL，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到82％，進行醇沉，在4℃下放置17h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液，混合液的濃度為1.00g·mL-1；混合液中加入濃度為0.05g·mL-1的明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置2.6h，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置2.5h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，亞硫酸鈉的加入量為藥液總質(zhì)量的0.16％，調(diào)節(jié)pH值至7.4，再加入活性炭，活性炭的加入量為藥液總質(zhì)量的0.40％，煮沸25min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。實施例6一種金英黃歸注射劑的制備方法，包括以下步驟：按量稱取原料藥金銀花、蒲公英、瓜蔞、連翹、芙蓉花、大黃、黃芪和當歸，其中，原料藥的用量，按照重量份數(shù)計為：金銀花96份、蒲公英82份、瓜蔞88份、連翹65份、芙蓉花45份、大黃35份、黃芪22份和當歸15份。原料藥中加入55％乙醇浸泡30min，其中原料藥與乙醇的料液比為1g︰12mL。隨后回流提取2.8h，多層紗布過濾；藥渣加50％乙醇回流提取1.1h，其中藥渣與乙醇的料液比為1g︰11mL，多層紗布過濾；合并濾液，蒸發(fā)至無醇味后加注射用水定容至1.00g·mL-1得到提取液；在提取液中加入無水乙醇至乙醇濃度達到77％，進行醇沉，在4℃下放置19h，過濾，回收濾液；取藥渣按照上述步驟進行第二次醇沉，過濾，合并兩次濾液，蒸發(fā)乙醇至無醇味，隨后加入注射用水，制備得到混合液，混合液的濃度為1.00g·mL-1；混合液中加入濃度為0.05g·mL-1的明膠溶液至不產(chǎn)生沉淀為止，放置2.3h，過濾去除沉淀，在濾液中加入無水乙醇至乙醇濃度>75％，放置3h，過濾去除沉淀，濾液減壓回收乙醇，殘渣用注射用水溶解定容至1.00g·mL-1，得到藥液，隨后加入亞硫酸鈉，亞硫酸鈉的加入量為藥液總質(zhì)量的0.12％，調(diào)節(jié)pH值至7.3，再加入活性炭，活性炭的加入量為藥液總質(zhì)量的0.30％，煮沸18min，采用0.22μm的水系無菌濾膜過濾至熱源處理后的容器中，得到注射劑。當前第1頁1 2 3