專利名稱：一種高靈敏中藥注射劑安全性評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥注射劑安全性評價領(lǐng)域，應(yīng)用于不以大分子為有效成分的中藥注射劑安全性評價。
背景技術(shù)：
中藥注射劑最早產(chǎn)生于上世紀四十年代，由錢信忠等學(xué)者開創(chuàng)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。2010年版《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)一部就收錄有燈盞細辛等單方和復(fù)方注射劑。中藥注射劑能提升藥效、使某些中藥的療效得到更好地發(fā)揮，在推進中藥劑型發(fā)展，拓展中藥的應(yīng)用范圍，服務(wù)廣大人民健康等方面的確功不可沒。從技術(shù)上來講，業(yè)界大體上已經(jīng)解決了中藥注射劑的有效性問題(盡管作用機制尚不完全清除)，安全性依然是業(yè)界難題。隨著中藥注射劑的廣泛應(yīng)用，不良反應(yīng)不斷發(fā)現(xiàn)，甚至致死性不良反應(yīng)也屢有報道。近年來發(fā)生的“清開靈注射液事件”、“雙黃連注射液事件”、“魚腥草注射液事件”等說明中藥注射劑的安全性不容忽視，受到業(yè)界甚至公眾的廣泛關(guān)注。中藥的療效最早來自口服和外用，沒有注射給藥方式。大多中藥注射劑的研發(fā)也源自口服劑的療效，如清開靈注射液、雙黃連注射液、丹參注射液和燈盞細辛注射液?？诜軌蛭盏闹兴幊煞只旧隙紝儆谛》肿游镔|(zhì)，因為大分子物質(zhì)不易吸收。中藥注射劑具有生物提取物的特征，目前的制備流程沒有大分子物質(zhì)去除工藝。因此，中藥注射劑包含有小分子物質(zhì)和小量或微量的大分子物質(zhì)。大分子和小分子尚無統(tǒng)一的分子量界限，但學(xué)術(shù)界對于“分子量越大口服越難吸收”的觀點深入人心。以2010年版《中國藥典》二部收載的2271個藥物(品種)為例，在治療全身性疾病的口服化學(xué)藥物中，分子量大于500的較少見，超過1000的則罕見(只有環(huán)孢素、維生素B12、腺苷鈷胺、依托紅霉素4個，但吸收不太理想 )，超過3000的則沒有。分子量與吸收的關(guān)系實際上已經(jīng)在藥物設(shè)計方面得到了廣泛應(yīng)用。一般認為中藥注射劑中可能含有的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)(縮合鞣質(zhì))、多糖、核酸和樹脂均視為大分子物質(zhì)，2000年版《中國藥典》也對其中的蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)和樹脂開始進行檢查。因此，我們推測，中藥注射劑的療效來自所含的小分子物質(zhì)，與分子量大于3000的物質(zhì)幾乎無關(guān)。由于中藥注射劑具有生物提取物的特征，因此在提取的過程中不可避免地帶來一些生物大分子，比如植物蛋白質(zhì)、核酸等，還有可能帶入鞣質(zhì)、樹脂、多糖等大分子。這些大分子口服是不能直接吸收的，必須經(jīng)過消化道的降解才可能以小分子吸收。蛋白質(zhì)是抗原性最強的常見物質(zhì)，而且分子量越大抗原性越強，越容易引起過敏反應(yīng)或類過敏。據(jù)此推測，中藥注射劑含有的微量蛋白質(zhì)是導(dǎo)致過敏或類過敏等特有不良反應(yīng)的主要原因，其他大分子如多糖、核酸、鞣質(zhì)、樹脂等也可能參與了這些不良反應(yīng)。因此中藥注射劑的安全性很大程度上取決于所含的大分子成分。來自中藥的大分子化學(xué)成分對人體影響較大的主要可分為四類，對中藥注射劑安全性的主要影響分子如下:
熱原:多為細菌的細胞壁的脂多糖成分，分子量較大，能引起恒溫動物發(fā)熱、休克、甚至死亡。蛋白質(zhì):多為植物蛋白，部分為動物蛋白或微生物蛋白。蛋白質(zhì)類物質(zhì)是抗原性較強的化學(xué)物質(zhì)，能引起各種過敏反應(yīng)(包括1、I1、II1、IV型)。由于與人的種屬差異較大，中藥注射劑含有的蛋白質(zhì)類大分子的抗原性均較強。鞣質(zhì):鞣質(zhì)是引起中藥注射劑注射后疼痛的主要物質(zhì)之一。鞣質(zhì)后蛋白質(zhì)結(jié)合為更大的分子復(fù)合物后，可增強蛋白質(zhì)的過敏性。多糖:蛋白多糖或糖蛋白本身就具有很強的抗原性，一般高于原有的蛋白質(zhì)。單純的多糖能夠通過“免疫佐劑”效應(yīng)增強免疫的作用，即也能增強過敏反應(yīng)。核酸:具有免疫調(diào)節(jié)作用，多通過“免疫佐劑”效應(yīng)增強過敏反應(yīng)?，F(xiàn)有中藥注射劑的生產(chǎn)工藝中，一般都采用“醇水法”或“水醇法”制備中藥注射劑的原料?！按妓ā敝饕遣捎靡掖继崛≈兴幉模厥杖軇┖笤偌铀コ恋砗笾频?；而“水醇法”則主要是采用水提取藥材，適當濃縮后然后用80%左右的乙醇沉淀，將上清液制備成原料。除此之外還有“酸提堿沉法”等。然而，這些方法制得的原料均不同程度地含有大分子雜質(zhì)，如含有蛋白質(zhì)、多糖、核酸、鞣質(zhì)等。根據(jù)2010年版《中國藥典》記載，目前中藥安全性檢查的項目主要有:熱原或內(nèi)毒素檢查；異常毒性檢查；降壓物質(zhì)檢查；過敏反應(yīng)檢查；溶血與凝集檢查。除溶血與凝集檢查外，其他四項檢查直接與大分子物質(zhì)有關(guān)。目前中藥注射劑的不良反應(yīng)率總體上在3_10%，其中主要是變態(tài)反應(yīng)(社會上也常稱之為“過敏”)，發(fā)生率占其中的75%左右。變態(tài)反應(yīng)的表現(xiàn)多種多樣，如血壓下降、過敏性休克、皮疹、蕁麻疹等，以靜脈注射的中藥注射劑更為嚴重。變態(tài)反應(yīng)是一種病理性免疫反應(yīng)，在抗原的刺激下才能發(fā)生?！吨袊幍洹芬?guī)定有安全性評價檢測，即中藥注射劑上市前必須進行相關(guān)的動物安全性檢測，檢測的方法是直接用中藥注射液成品進行檢測。由于動物對某些抗原性的反應(yīng)敏感性和人有差別，而且目前中藥注射劑的不良反發(fā)生率在10%以下，屬于低概率事件，因此《中國藥典》規(guī)定的檢測方法靈敏度有限，很難評價目前“合格”的中藥注射劑品種，推動中藥注射劑產(chǎn)品質(zhì)量的提高。由于傳統(tǒng)中藥應(yīng)用過程無“注射”給藥方式，中藥注射劑大規(guī)模使用歷史較短，導(dǎo)致很多中藥注射劑的安全性問題不容易發(fā)現(xiàn)?！吨袊幍洹凡捎脛游餀z測法來評價中藥注射劑的安全性，然而動物檢測的靈敏度往往偏低，用中藥注射劑成品直接檢測中藥注射劑的安全性往往得不到應(yīng)有的陽性反應(yīng)。為了進一步發(fā)現(xiàn)評價中藥注射劑的安全性，發(fā)明能提高中藥注射劑安全性評價靈敏度的方法有望解決此問題。在此我們以發(fā)明一種方法，以提高中藥注射劑安全性評價傳統(tǒng)方法的靈敏性。本專利的研究受國家自然科學(xué)基金委會(編號:81160495)支持。

發(fā)明內(nèi)容
作為用于全身治療的傳統(tǒng)中藥，大分子物質(zhì)很難吸收產(chǎn)生全身作用；相反，如果直接進入機體反而可能導(dǎo)致變 態(tài)反應(yīng)等安全性問題。富集中藥注射劑中的大分子物質(zhì)后，用富含大分子的中藥注射劑代替原注射劑能更靈敏地評價原注射劑的安全性。本發(fā)明利用此原理，在安全性評價時，先用分子篩富集傳統(tǒng)中藥注射劑的大分子物質(zhì)，用富含大分子的中藥注射劑代替中藥注射劑原液再進行安全性評價，以提高中藥注射劑安全性評價的靈敏性。本方法適用于基于傳統(tǒng)療效研發(fā)中藥注射劑(包括中藥注射液和注射用中藥粉針劑)的安全性評價。本發(fā)明中采用的分子篩膜是截留分子量3lT30k的膜，材質(zhì)不限；截留的方式可以米用正壓，也可以米用負壓。


圖1為本發(fā)明方法的實施流程示意圖。
具體實施例方式實施示例I用富含大分子清開靈注射液評價清開靈注射液的安全性。

復(fù)方制劑清開靈注射液(批號:100327.2)，采用離心方式分別經(jīng)截留分子量為10k和30k的膜處理后得到5份樣品，分別為“Q0”、“Q2上”和“Q3上”?！癚0”為正常的清開靈注射液；“Q2”為經(jīng)10 k截留膜去大分子后的注射液；“Q3”為經(jīng)30k截留膜去大分子后的注射液；“Q2上”為10 k截留膜截留獲得的富含大分子注射液，來自10倍體積的原注射液；“Q3上”為30k截留膜截留獲得的富含大分子注射液，來自10倍體積的原注射液。將Iml的注射液樣品冷凍干燥到恒重后測定以上樣品的固體物含量。按照2010年版《中國藥典》一部附錄91 (異常毒性檢查)要求配制以上5種來自清開靈注射液的樣品，取符合要求的35只小鼠隨機分為5組，每只小鼠腹腔注射0.5 ml,觀察20分鐘，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射“Q0” (固體物含量0.0416 mg/ml )、“Q2，，(固體物含量0.0396mg/ml)、“Q3”(固體物含量0.0404 mg/ml)樣品的小鼠未見明顯變化，而注射了“Q2上”(源自10倍體積原液，固體物含量0.0622g/ml)和“Q2上”(源自10倍體積原液，固體物含量
0.0516g/ml)樣品的小鼠分別有5、4只發(fā)生扭體反應(yīng)。表明采用富含大分子的清開靈注射劑可以更加靈敏地評價清開靈注射液的安全性(異常毒性檢查)。實施示例2用富含大分子雙黃連注射液評價雙黃連注射液的安全性。雙黃連注射液(批號:20100324)，采用正壓方式經(jīng)截留分子量為10 k的截留膜處理后得到3份樣品，分別為“S0”、“S2”和“S2上”。SO為正常的中藥注射液A ;“S2”為經(jīng)10k截留膜去大分子后的注射液；“S2上”為10 k截留膜截留獲得的富含大分子注射液，來自10倍體積的原注射液。將Iml的注射液樣品冷凍干燥到恒重后測定以上樣品的固體物含量?！癝0”、“S2”和“S2 上”的固體含量分別為 0.0190 mg/ml,0.0181 mg/ml、0.0231g/ml。按照2010年版《中國藥典》一部附錄92 (過敏反應(yīng)檢查)進行過敏反應(yīng)檢查。按照附錄92要求配制以上3種來自雙黃連注射液的樣品，取符合要求的18只豚鼠隨機分為3組，每只豚鼠隔天腹腔注射0.5 ml，共注射3次，以后正常飼養(yǎng)。第14天靜脈注射以上樣品各0.5 ml，結(jié)果30分鐘內(nèi)發(fā)現(xiàn)注射“SO”、“S2上”樣品的豚鼠未見明顯變化，而注射了 “S2上”的豚鼠有3只呈現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng)。表明采用富含大分子的雙黃連注射劑可以更加靈敏地評價雙黃連注射液的安全性(過敏反應(yīng)檢查)。
權(quán)利要求
1.一種提高中藥注射劑安全性評價的方法，其特征是在用大分子截留膜制備富含大分子中藥注射劑替代原注射劑進行安全性評價。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的中藥注射劑安全性評價提高方法:其特征是該方法所用的為截留分子量為3 1Γ30 k的截留膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所描述的中藥注射劑安全性評價提高方法:其特征是該方法所適用的中藥注射劑為 基于傳統(tǒng)療效開發(fā)的中藥注射劑，包括注射液和注射液用粉針劑。
全文摘要
一種能夠提高中藥注射劑安全性評價的方法，其特征是用大分子截留膜制備富含大分子中藥注射劑替代原注射劑進行傳統(tǒng)的安全性評價。其截留膜的截留分子量為3k~30k，適用于基于傳統(tǒng)療效開發(fā)的中藥注射劑，包括注射液和注射用粉針劑。
文檔編號A61K49/00GK103143038SQ201310072519
公開日2013年6月12日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者段為鋼, 柯瑾, 張陸勇, 江振洲, 呂小滿 申請人:云南中醫(yī)學(xué)院