塞北紫堇有效部位及其制備方法和應(yīng)用，屬于植物提取物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

塞北紫堇（Corydalis impatiens( Pall.) Fisch）為罌粟科紫堇屬植物塞北紫堇的干燥全草。塞北紫堇分布在青海、西藏、甘肅、四川等地，為藏成藥中常用藥材，收載于《中華本草》藏藥卷，藏語名稱為“帕下嘎”或譯為“帕夏嘎”或“巴夏嘎”，具有除熱消腫、活血散瘀功效，用于熱性諸癥?！抖饶副静荨吩疲合[，治跌打損傷?！端{(lán)琉璃》云：“治膽囊炎，時疫感冒?！薄陡事侗静菝麋R》云：“治五臟熱，血熱，瘡癤等。”《度母本草》云：“玉冬塞爾高在山的陰陽兩面均長，葉厚而極油潤。莖綠色，細(xì)而柔初?；S色美麗。果實狀似拉拉卜（蛇床果實）?！薄端幟C萃》云：“葉及花狀似冬日絲葉（黃花紫堇），花黃色，莖具四棱而長?！薄端{(lán)琉璃》云：“葉細(xì)而稀疏，莖中空，具紅色光澤，花綠黃色狀似戴勝鳥之頭?！薄陡事侗静菝麋R》云：“根淡黃色，細(xì)長，上下部均有分支。葉青色具黃色光澤而油潤。狀似甲門（罌粟）葉，葉緣具大小不等的凹痕，先生葉的葉柄長，莖部及分枝上的葉幾乎無柄?；S色、唇形，頂生，花落后狀似肉蠅?！?/p>

腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一，惡性腫瘤的防治已成為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重要課題。惡性腫瘤就是人們所說的癌癥。癌癥作為目前人類死亡的首要原因，對其治療仍局限于癌癥疾病的多樣性及反復(fù)性。然而，盡管不同的癌癥的致癌原因可能不盡相同，但其組織觀察均表現(xiàn)出相似的細(xì)胞周期紊亂以及迅速不可控制的細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移。因此，對參與細(xì)胞周期調(diào)控的一些家族蛋白的研究在推動癌癥治療中成為重要因素。組蛋白去乙?；福℉DAC）是一類蛋白酶，對染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。一般情況下，組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。在癌細(xì)胞中，HDAC的過度表達(dá)導(dǎo)致去乙?；饔玫脑鰪?qiáng)，通過恢復(fù)組蛋白正電荷， 從而增加DNA與組蛋白之間的引力， 使松弛的核小體變得十分緊密， 不利于特定基因的表達(dá)， 包括一些腫瘤抑制基因。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACi）則可通過提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙酰化，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡及分化相關(guān)蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化，成為一類新的抗腫瘤藥物。HDACi不僅對多種血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤具有良好的治療作用，而且具有腫瘤細(xì)胞相對較高選擇性和低毒的優(yōu)點(diǎn)。

申請人在研究中發(fā)現(xiàn)：目前抗腫瘤藥物的原料較少，特別是用于制備抑制HDAC1酶藥物的中藥原料較為匱乏。塞北紫堇植物主要含有生物堿、多酚類、黃酮、三萜類、鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分，現(xiàn)有技術(shù)中主要有活血散瘀、利氣止痛、清熱消炎之功。目前，尚未見到關(guān)于塞北紫堇抑制HDAC1酶的活性方面的研究和應(yīng)用的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供塞北紫堇有效部位及其制備方法和應(yīng)用，該塞北紫堇有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該塞北紫堇有效部位，其特征在于：選自塞北紫堇總生物堿提取物。

該塞北紫堇有效部位的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：將塞北紫堇全草粉碎，加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取，將所得提取液濃縮、干燥，得浸膏；將浸膏加質(zhì)量百分比濃度2%的鹽酸水溶液提取，除去脂溶性雜質(zhì)后，加氨水調(diào)pH至 9~10，最后用氯仿多次萃取，將所得萃取液濃縮、干燥，得塞北紫堇總生物堿提取物。

本制備方法中石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的萃取順序非常重要，在萃取順序被顛倒的情況下得到的有效部位對抑制HDAC1酶的活性并不明顯。發(fā)明人分析，因三種萃取劑所能萃取的成份有一些是相互包含的，只有在本發(fā)明萃取順序下，利用上述萃取劑依次萃取同一浸膏分散液，前萃取步驟將浸膏分散液內(nèi)本相互抑制的成份萃取出其中的一種后，下一步萃取才能得到具有一直HDAC1酶的活性的有效部位。

所述的回流提取為超聲波輔助回流提取。

所述的回流提取的具體操作為：將粉碎后的塞北紫堇全草加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液超聲波提取0.5~2小時，過濾并回流提取1~3次、每次0.5~2小時，合并提取液，即得。

所述的回流提取的具體操作為：將粉碎后的塞北紫堇全草加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液超聲波提取0.5小時，過濾并回流提取3次、每次1小時，合并提取液，即得。

該塞北紫堇有效部位的應(yīng)用，其特征在于：在制備抑制HDAC1酶藥物方面的應(yīng)用。

所述制備抑制HDAC1酶藥物，是通過塞北紫堇總生物堿提取物與藥用輔料混合制成的口服制劑或注射制劑。

所述的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑。

所述的口服制劑為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑或溶液劑。

對于本發(fā)明的說明如下：

現(xiàn)有技術(shù)中，塞北紫堇常規(guī)用途為活血散瘀、利氣止痛、清熱消炎，未見其有抗腫瘤功效的相關(guān)報道。申請人通過大量研究發(fā)現(xiàn)：塞北紫堇中的部分提取物還具有抗腫瘤的作用，但是其功效不明顯，不能確定其具體的有效部位。因此采用怎樣制備方法，才能獲得抑制HDAC1酶活性效果最好的有效部位，是必須要解決的問題。申請人通過研究發(fā)現(xiàn)：采用本發(fā)明制備方法，所得的塞北紫堇總生物堿提取物，其抑制HDAC1酶效果較好。

優(yōu)選的，制備的抑制HDAC1酶藥物，為口服制劑或注射制劑?？诜苿┖妥⑸渲苿樽罴呀o藥途徑，此處所述口服制劑為經(jīng)腸胃道給藥制劑，優(yōu)選的，口服制劑為緩釋、控釋型口服制劑。也可以為非腸胃給藥的其他，如呼吸道給藥制劑（噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑）；皮膚給藥制劑（外用溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑）；膜給藥制劑（滴眼劑、 滴鼻劑、眼用軟膏、含漱劑、舌下片劑）；腔道給藥制劑（栓劑）。注射制劑可以為常規(guī)注射制劑。根據(jù)藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)行分類，優(yōu)選的，本發(fā)明的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑；其他的，本發(fā)明的注射劑還可以為微囊注射劑、聚合物膠束注射劑、微乳或亞微乳注射劑、亞微粒注射劑或凝膠注射劑，以上藥物傳遞系統(tǒng)的注射劑能延長藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時間、延長載藥微粒在吸收部位的停留時間、控制藥物在釋放初期的突釋效應(yīng)。藥用輔料包括藥物載體，還包括溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、助懸劑、澄清劑、反絮凝劑、矯味劑、著色劑、防腐劑、化學(xué)滅菌劑、吸附劑、助濾劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、抗粘著劑、緩釋劑、控釋劑、包衣材料、成膜材料、膠囊材料中的至少一種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的塞北紫堇有效部位及其制備方法和應(yīng)用所具有的有益效果是：

1、該塞北紫堇有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。申請人經(jīng)大量研究確定現(xiàn)有技術(shù)中具有活血散瘀、利氣止痛、清熱消炎之功的塞北紫堇，還具有抗腫瘤的功效。設(shè)計最佳制備方法，并通過研究確定其所抑制的酶的種類，申請人首次在HDAC1酶上進(jìn)行藥效篩選，通過大量研究確定塞北紫堇總生物堿提取物均具有較好的抑制HDAC1酶活性，其HDAC1酶存活率35.60%，適宜開發(fā)成抗腫瘤藏藥新藥。申請人在以上發(fā)現(xiàn)問題解決問題的過程中，是付出了大量的創(chuàng)造性勞動的。

2、該塞北紫堇有效部位的制備方法提取方便，提取效率高。制備方法中，申請人設(shè)計加入質(zhì)量百分比濃度65~95%乙醇溶液進(jìn)行超聲波輔助回流提取，提高了提取效率。

3、本發(fā)明拓展了抑制HDAC1酶藥物的原料渠道，擴(kuò)大了塞北紫堇的用途，使塞北紫堇發(fā)展成為抑制HDAC1酶藥物的新原料，可顯著提高塞北紫堇的附加值。

具體實施方式

實施例1~3是本發(fā)明的塞北紫堇有效部位及其制備方法和應(yīng)用的具體實施方式，其中實施例1為最佳實施例。

實施例1

制備方法，包括下述步驟：將塞北紫堇全草粉碎，將粉碎后的塞北紫堇全草加入質(zhì)量百分比濃度75%~80%乙醇溶液超聲波提取0.5小時，過濾并回流提取3次、每次1小時，合并提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加加質(zhì)量百分比濃度2%的鹽酸水溶液提取，除去脂溶性雜質(zhì)后，加氨水調(diào)pH至 9~10，最后用氯仿多次萃取，將所得萃取液濃縮、干燥，得塞北紫堇總生物堿提取物。

實施例2

制備方法，包括下述步驟：將塞北紫堇全草粉碎，將粉碎后的塞北紫堇全草加入質(zhì)量百分比濃度65~70%乙醇溶液超聲波提取1小時，過濾并回流提取3次、每次1小時，合并提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加加質(zhì)量百分比濃度2%的鹽酸水溶液提取，除去脂溶性雜質(zhì)后，加氨水調(diào)pH至 9~10，最后用氯仿多次萃取，將所得萃取液濃縮、干燥，得塞北紫堇總生物堿提取物。

實施例3

制備方法，包括下述步驟：將塞北紫堇全草粉碎，將粉碎后的塞北紫堇全草加入質(zhì)量百分比濃度90%~95%乙醇溶液超聲波提取2小時，過濾并回流提取2次、每次2小時，合并提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加加質(zhì)量百分比濃度2%的鹽酸水溶液提取，除去脂溶性雜質(zhì)后，加氨水調(diào)pH至 9~10，最后用氯仿多次萃取，將所得萃取液濃縮、干燥，得塞北紫堇總生物堿提取物。

性能測試

取0.4mg干燥后的塞北紫堇總生物堿提取物，溶解于100μL的二甲基亞砜（DMSO）中形成DMSO溶液，超聲5分鐘。取1μL溶解樣品的DMSO溶液，各加入緩沖液99μL，到用于檢測的塞北紫堇總生物堿提取物的緩沖溶液。緩沖液的配方為：50mM/L的Tris-HCl、0.137 mM/L的NaCl、2.7mM/L的KCl、1mM/L的 MgCl₂、0.01%吐溫20，調(diào)緩沖液pH 8.0。

一、抗HDAC1酶實驗。

以實施例1得到的塞北紫堇總生物堿提取物為受試藥物，檢測塞北紫堇總生物堿提取物抑制HDAC1酶的活性。

其方法是：分別另取4μL的塞北紫堇總生物堿提取物的緩沖溶液，置于96孔板中，再分別加入2μL HDAC酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μLH3(1-21)K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665 和5μL H3K9me0 抗體，665nm測值，得實驗組吸光度。將4μL的緩沖液置于96孔板中，再分別加入2μL HDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μL H3(1-21)K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665和5μL H3K9me0 抗體，665nm測值，得對照組吸光度。計算HDAC1酶存活率：存活率（%）=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

表1 塞北紫堇有效部位抑制HDAC1酶的活性測試結(jié)果

表1中* P＜0.01，通過表1可以看出：塞北紫堇總生物堿提取物、塞北紫堇總生物堿提取物、塞北紫堇總生物堿提取物對于HDAC1酶均有較好的抑制效果。

二、抗腫瘤活性測試。

利用MTT法測定塞北紫堇有效部位對人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。取實施例1所得塞北紫堇總生物堿提取物適量，DMSO溶解后，利用MTT法分別測定對人結(jié)腸癌HCT-8、人肝癌Bel7402細(xì)胞、人胃癌BGC-803細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞和人卵巢癌A-2780細(xì)胞生長的抑制率。

實驗方法：將對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰酶-EDTA消化后，配制成一定濃度的單細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞生長速度的差異，按800~2000個/孔接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。24 h后，加入含不同濃度化合物及相應(yīng)溶劑對照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100 μL（DMSO終濃度<0.1%），每種受試化合物設(shè)5~7個劑量組，每組至少設(shè)3個平行孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄上清液，每孔加入100 μL新鮮配制的含0.5mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后，每孔加入200 μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振蕩器振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在參考波長450 nm，檢測波長570 nm條件下測定光密度值(OD)，以溶劑對照處理的腫瘤細(xì)胞為對照組，用以下公式計算化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計算IC₅₀：抑制率=（對照組平均OD值－給藥組平均OD值）÷對照組平均OD值×100%。將制備方法中的浸膏、以及所得的塞北紫堇總生物堿提取物、塞北紫堇總生物堿提取物、塞北紫堇總生物堿提取物進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果見表2。

表2 塞北紫堇有效部位體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

注：1）、 HCT-8為人結(jié)腸癌細(xì)胞，Bel-7402為人肝癌細(xì)胞，BGC-823為人胃癌細(xì)胞，A549為人肺癌細(xì)胞，A2780為人卵巢癌細(xì)胞。2）、>50表明不具有抗細(xì)胞毒活性。通過表2可看出：塞北紫堇總生物堿提取物確實有較好的抗腫瘤的效果。

三、體外S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實驗。

1、實施例1各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實驗方法如下：

a）5~6周齡昆明小鼠，隨機(jī)選鼠分組，每組10只，每組雌雄各半；分組名稱為：空白對照組，環(huán)磷酰胺組，給藥組；給藥組包括：塞北紫堇總生物堿提取物低、中、高劑量組；對每只小鼠進(jìn)行皮膚消毒；

b）于右前肢皮下接種S₁₈₀瘤液0.2ml（S₁₈₀瘤細(xì)胞數(shù)在2.0×10⁶~2.2×10⁶范圍內(nèi)）；

c）步驟b)接種24小時后給藥；空白對照組灌胃給藥10mL/kg注射用生理鹽水；環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg；給藥組采用灌胃給藥實施例1制得的塞北紫堇總生物堿提取物；首次給藥后，隔日稱小鼠首次體重；每組每天給藥1次，每次給藥劑量詳見下表，連續(xù)給藥14天；

d）末次給藥1小時后，處死小鼠，稱小鼠末次體重，剝瘤塊稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=（空白對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）÷空白對照組平均瘤重×100%，將抑瘤率計算結(jié)果錄入表3。

表3 實施例1對小鼠S₁₈₀實體瘤的影響

2、實施例2各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠方法同實施例1，數(shù)據(jù)錄入表4。

表4 實施例2對小鼠S₁₈₀實體瘤的影響

3、實施例3各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實驗的方法同實施例1，數(shù)據(jù)錄入表5。

表5實施例3對小鼠S₁₈₀實體瘤的影響

經(jīng)申請人統(tǒng)計：給藥組與空白對照組相比，小鼠體重?zé)o顯著性差異（P>0.05）。表3~5中：S₁₈₀是指小鼠腹水瘤細(xì)胞，表3~5中抑瘤率數(shù)值越大表示抗腫瘤效果越好。由表3~5可以看出：首先，實施例1~3均有較好的抗腫瘤效果，實施例1~3各部位的抗腫瘤效果無明顯差別。其次，與空白對照組相比，塞北紫堇總生物堿提取物中、高劑量組、環(huán)磷酰胺化療組，均可顯著抑制S₁₈₀腫瘤的生長。

實施例4

將塞北紫堇有效部位制備為片劑，采用如下步驟：將塞北紫堇總生物堿提取物300mg和淀粉100mg混勻，加質(zhì)量百分比濃度10%的淀粉糊40mg制成軟材，過篩得濕顆粒，干燥得干顆粒，整粒，加硬脂酸鎂4 mg混勻、壓片，即得。

實施例5

微丸膠囊由以下重量份原料組成：塞北紫堇總生物堿提取物30份、卵磷脂5份、牛黃膽酸鈉5份、微晶纖維素30份；

微丸膠囊的制備方法：按配比將塞北紫堇總生物堿提取物、卵磷脂、牛黃膽酸鈉和微晶纖維素混均，倒入乙醇水溶液攪勻獲得軟材，將軟材倒入擠出機(jī)中擠出，經(jīng)滾圓獲得顆粒，擠出轉(zhuǎn)速250r/min，滾圓轉(zhuǎn)速800r/min，滾圓時間20min，干燥、過24~30目篩獲得微丸，將微丸灌裝入膠囊殼內(nèi)，即得。

實施例6

脂質(zhì)體注射劑的制備方法：1）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將50g膽固醇琥珀酸酯、250g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、40g大豆卵磷脂、50g泊洛沙姆-188、和10g塞北紫堇總生物堿提取物溶解于1500ml體積比為1:1的乙醇和正丁醇的有機(jī)溶劑中，攪拌使其溶解獲得混懸液；將混懸液通過減壓濃縮揮去有機(jī)溶劑，獲得磷脂膜；

2）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向磷脂膜中加入8000ml pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，使磷脂膜洗脫并充分溶脹水合，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得塞北紫堇總生物堿提取物的脂質(zhì)體；

3）在無菌條件下，向塞北紫堇總生物堿提取物的脂質(zhì)體中，加入100g海藻糖，攪拌均勻，超聲波處理0.5~1小時，加注射用水定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得塞北紫堇總生物堿提取物的脂質(zhì)體注射劑。

實施例7

納米粒注射劑的制備方法：取25g塞北紫堇總生物堿提取物和100g泊洛沙姆407用3000ml 無水乙醇溶解，加入30ml 1mol/L氯化鋅的乙醇溶液，攪拌混合，超聲波處理0.5~1小時使其溶解，獲得混合液；將混合液減壓濃縮揮去溶劑，放入-20℃冰箱冷凍2小時；取出加注射用水定容，超聲波處理0.5~1小時，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得塞北紫堇總生物堿提取物的納米粒注射劑。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。