本發(fā)明屬于新型組織修復(fù)生物材料的加工領(lǐng)域，具體涉及藍鯊魚皮膠原的制備及藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的制備。

背景技術(shù)：

人體健康容易受到各類疾病的威脅，而口腔疾病是其中的一類多發(fā)疾病。人的口腔由于手術(shù)和各種常見口腔疾病，極易造成口腔創(chuàng)傷和組織缺損，牙周病就是其中的一種。牙周病是指發(fā)生在牙支持組織(牙周組織)的疾病，它作為常見的口腔疾病，是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一，也是危害人類牙齒和全身健康的主要口腔疾病。因此，牙周病的治療一直是臨床重點研究領(lǐng)域。目前，牙周組織引導(dǎo)再生技術(shù)(GTR)是當今先進的牙周治療方法，牙周組織引導(dǎo)再生技術(shù)是利用一種組織引導(dǎo)再生膜放置于牙根和牙齦組織瓣之間，以達到物理性阻擋牙齦結(jié)締組織細胞和上皮組織細胞與牙根先接觸，保證由根方殘余的牙周膜組織來源細胞和牙槽骨細胞優(yōu)先占據(jù)根面并在其上伸長和向冠方爬行。目前，這種類型的膜材料主要包括不可降解材料和可降解材料兩大類，不可降解材料由于不能被組織吸收，需要二次手術(shù)取出，增加了病人的痛苦。而可降解材料一般是自體或異體取材，取部分人體組織作為修復(fù)材料，移植到有缺損的口腔組織或創(chuàng)面上，但存在來源受限，增加手術(shù)風險，免疫原性等問題。因此，開發(fā)一種來源廣泛的可降解牙周組織引導(dǎo)再生膜對于這類疾病的治療具有重要意義，而目前市場上的牙周組織引導(dǎo)再生膜材料在設(shè)計和性能上均存在各種不足。

膠原蛋白主要可分為陸生膠原和水生膠原兩種，大部分的陸生和水生膠原都屬于I型膠原，膠原由于其結(jié)構(gòu)組成，具有優(yōu)良的細胞相容性、血液相容性，無免疫原性，可生物降解，能夠促進細胞的增殖分化，促進組織再生。目前經(jīng)常使用的膠原多為陸生膠原，提取自牛、豬等陸生哺乳動物的肌腱、皮、骨等部位，但是由于哺乳動物的傳染病等因素，安全性受到威脅，部分國家已經(jīng)開始限制陸生膠原的使用。而隨著海洋資源的開發(fā)及工業(yè)化加工技術(shù)的發(fā)展，魚皮資源日益豐富，從魚皮中提取安全衛(wèi)生的膠原蛋白逐漸受到廣泛關(guān)注。這其中，藍鯊魚皮膠原與陸生膠原相比，具有很多的特異性優(yōu)勢，包括優(yōu)異的細胞相容性和血液相容性，降解產(chǎn)物易被人體吸收利用，促進細胞的生長。

到目前為止，國內(nèi)外的研究者報道了多種膠原蛋白的提取方法?？偟膩碚f，依據(jù)提取介質(zhì)的不同，魚類膠原蛋白的提取方法可分為五類：熱水法、堿法、酸法、鹽法以及酶法。不論哪種方法，其基本原理都是根據(jù)膠原蛋白的特性改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，把膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)或基質(zhì)中分離出來。在很多情況下，單一的提取方法達不到預(yù)期目標，有很多缺點，不利于實際的工業(yè)化生產(chǎn)。例如：熱水提取法：由于提取溫度較高，膠原蛋白易于變性；堿提取法：提取速度快而且徹底，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變異；酸提取法：可以最大程度地保持其三股螺旋結(jié)構(gòu)，但產(chǎn)品得率較低、溶劑殘留、提取時間較長、步驟繁瑣，而且提取后的廢液排放對環(huán)境會造成一定影響；鹽析法：提取所得的膠原蛋白需透析去除鹽份，工藝繁雜，得率較低；酶提取法：提取的溶出率高并且能降低膠原的抗原性，但水解不夠徹底、成本較高，可能會引起膠原蛋白結(jié)構(gòu)部分發(fā)生變化，易獲得小分子肽，影響純化產(chǎn)品的品質(zhì)。本工藝采用新型的等電點提取法，可以高效簡便的獲得高純度、大分子魚皮膠原蛋白，便于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

殼聚糖是自然界中存在的天然堿性多糖，是甲殼素的脫乙酰基產(chǎn)物，甲殼素在自然界中含量僅次于纖維素，來源廣泛。殼聚糖作為一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性、可降解性、抗菌性、促愈性、無毒、對粘膜無刺激性，可以促進黏膜粘附，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

靜電紡絲技術(shù)是目前制備納米纖維最簡單有效的方法，在靜電紡絲過程中，紡絲溶液置于針管當中，被微量推進控制裝置推出至針頭，在高壓電場的作用下，紡絲溶液從針頭噴出，經(jīng)過電場的拉伸，溶劑揮發(fā)形成纖維，最后被收集在接地的收集裝置上。不同的收集裝置可以制備出不同類型的試樣。采用平板接收裝置可以制備出具有小孔徑、高孔隙率的納米纖維膜。通過靜電紡絲制備的納米纖維膜可以模擬細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能，有利于細胞的粘附、增殖和分化。

公開號CN 1562388 A公開了一種口腔組織補片，由人的異體或哺乳動物的膜狀或片狀組織經(jīng)脫細胞處理而成的具有三維空間框架結(jié)構(gòu)的細胞外基質(zhì)。該種方法制備的組織補片材料由于脫除了抗原細胞，有效解決了異體排異問題。但該種方法存在取材復(fù)雜、來源受限，且存在哺乳動物的傳染病等安全性威脅。公開號CN 101791431 A公開了一種以人工合成聚酯類聚合物或天然生物可降解高分子材料為原料，通過靜電紡絲工藝制備了負載有生長因子的納米結(jié)構(gòu)薄膜材料，具有抑制炎癥和促進組織再生的優(yōu)勢，但人工合成材料的降解產(chǎn)物會對組織的生長產(chǎn)生不良影響。實用新型專利授權(quán)號CN205073351 U公開了一種口腔補片，以脫細胞質(zhì)基質(zhì)作為基底層，通過物理吸附或蛋白膠粘合的方式固定一層蛋白質(zhì)疏松層。該種方法制備的口腔補片具有組織相容性好，可逐步降解和厚度適宜等優(yōu)點，但材料的柔順性和貼合性較差，難以在復(fù)雜創(chuàng)面情況下進行有效貼合。公開號CN 1107742 A公開了一種組織引導(dǎo)再生膠原膜，通過酶消化法從哺乳動物結(jié)締組織中提取膠原，再經(jīng)冷凍干燥法成型。這種材料可降解吸收，不需要二次手術(shù)取出，具有良好的理化性能和生物相容性。公開號CN 103191085 A提供了一種雙層復(fù)合再生膜的制備方法，由可降解高分子纖維網(wǎng)與凍干膠原膜復(fù)合而成，凍干膠原膜中復(fù)合有納米銀離子和抗生素藥物。用于組織修復(fù)可促進傷口的愈合，提高引導(dǎo)膜的機械強度。公開號CN 103071189 A公開了將膠原經(jīng)過溶解、離心、凍干、交聯(lián)后制備成組織引導(dǎo)再生用膠原膜的方法。該方法具有工藝簡單、成本低的優(yōu)點，且制備的膠原膜具有良好的力學性能。公開號CN 105079877 A公開了將絲素蛋白經(jīng)過冷凍干燥和氨基酸交聯(lián)增塑制備牙周補片的方法，該種方法制備的牙周補片具有良好的柔韌性和機械強度，且制備工藝簡單，適于規(guī)模化生產(chǎn)。以上專利采用冷凍干燥的方法制備組織引導(dǎo)再生材料雖然具有良好的生物相容性和機械性能，但都不能很好的模仿細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，且由于孔徑較大，難以起到細胞屏蔽和引導(dǎo)細胞貼壁生長的作用。

目前關(guān)于對牙周組織引導(dǎo)再生膜材料的研究當中，以自體或異體的脫細胞質(zhì)基質(zhì)和各種可降解材料的凍干膜為主。使用脫細胞質(zhì)基質(zhì)制備組織引導(dǎo)再生材料會存在材料來源受限，取材和制備過程繁瑣，容易受到哺乳動物的傳染病及各種病毒性疾病的威脅。用天然材料如膠原等的凍干膜制備的組織引導(dǎo)再生材料由于孔徑較大、孔的連通性差等問題，難以較好的模擬細胞質(zhì)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能，不利于細胞的粘附生長和組織間營養(yǎng)物質(zhì)的運輸。除了天然材料，使用合成可降解材料時會存在降解產(chǎn)物的炎癥反應(yīng)等問題。因此，在開發(fā)牙周組織引導(dǎo)再生材料時，除了要使用具有優(yōu)良生物相容性的天然可降解材料之外，還應(yīng)該要盡可能的模擬細胞質(zhì)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，以達到最佳的引導(dǎo)組織再生效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有材料和制備技術(shù)的不足，提出一種藍鯊魚皮膠原的制備提純方法，并以制備的藍鯊魚皮膠原為原料復(fù)合殼聚糖、PEO其中的一種或多種制備具有仿細胞質(zhì)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的制備方法，其特征在于，包括：制備藍鯊魚皮膠原，利用藍鯊魚皮膠原或藍鯊魚皮膠原以及殼聚糖和PEO中的至少一種進行靜電紡絲，得到藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜。

優(yōu)選地，所述的藍鯊魚皮膠原的制備方法包括：

第一步：去除藍鯊皮下肌肉和脂肪組織，在蒸餾水下清洗浸泡0.5-1h，將魚皮剪成直徑3-5mm碎片，過濾備用；

第二步：將魚皮置于0.25-0.5mol/L NaOH溶液中脫脂處理，用磁力攪拌器攪拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏8-16h，取出后用蒸餾水清洗過濾；

第三步：將魚皮置于70％-90％的乙醇溶液中進行脫糖處理，用磁力攪拌器攪拌2-6h，取出后用蒸餾水清洗過濾；

第四步：將魚皮用粉碎機粉碎，置于0.25-0.5mol/L冰醋酸溶液中水解處理，用磁力攪拌器攪拌4-12h，置于0-6℃的冰箱中冷藏2-8h，得到提取物；

第五步：采用等電點技術(shù)，將上述提取物，先經(jīng)過紗網(wǎng)過濾，取濾液，在濾液中滴加0.25-0.5mol/LNaOH溶液至等電點時，可見白色棉絮狀物析出，將其過濾取沉淀物，蒸餾水清洗后擠干封裝，冷凍干燥保存，即為藍鯊魚皮膠原。

更優(yōu)選地，經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳檢測所得的藍鯊魚皮膠原為I型膠原，相對分子量為100-300KDa。

優(yōu)選地，所述的利用藍鯊魚皮膠原進行靜電紡絲的具體步驟包括：

步驟A：在溶劑中加入藍鯊魚皮膠原，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，得到紡絲液，所述溶劑為六氟異丙醇10-90vol％和余量的乙酸的混合溶液；

步驟B：在紡絲電壓為4-30KV，紡絲液給進速率為0.5-1.5ml/h、接收距離為10-30cm、環(huán)境溫度為15-40℃、相對濕度為10-60％的條件下進行靜電紡絲，將得到的納米纖維膜置于真空干燥箱中干燥后，得到藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜；

所述的利用藍鯊魚皮膠原以及PEO進行靜電紡絲的具體步驟包括：

步驟a：在溶劑中加入藍鯊魚皮膠原，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解后加入PEO，再次攪拌至完全溶解，得到紡絲液，所述溶劑為六氟異丙醇0-90vol％、去離子水0-60vol％和余量的乙酸的混合溶液；

步驟b：在紡絲電壓為4-30Kv，紡絲液給進速率為0.5-1.5ml/h、接收距離為10-30cm、環(huán)境溫度為15-40℃、相對濕度為10-60％的條件下進行靜電紡絲，將得到的納米纖維膜置于真空干燥箱中干燥后，得到藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜；

所述的利用藍鯊魚皮膠原以及殼聚糖和PEO進行靜電紡絲的具體步驟包括：

步驟1：在體積分數(shù)為10-90％的乙酸水溶液中加入殼聚糖，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，記為A液；在六氟異丙醇80-90vol％和余量乙酸的混合溶液中加入藍鯊魚皮膠原，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，記為B液；將A液和B液以0.8-1∶1的體積比混合，用磁力攪拌器攪拌均勻后再加入PEO，再次用磁力攪拌器攪拌均勻，得到紡絲液；或者，在體積分數(shù)為10-60％的乙酸水溶液中依次加入殼聚糖、藍鯊魚皮膠原和PEO，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，得到紡絲液；

步驟2：在紡絲電壓為4-30Kv，紡絲液給進速率為0.5-1.5ml/h、接收距離為10-30cm、環(huán)境溫度為15-40℃、相對濕度為10-60％的條件下進行靜電紡絲，將得到的納米纖維膜置于真空干燥箱中干燥后，得到藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜。

更優(yōu)選地，所述的步驟A中的紡絲液中的藍鯊魚皮膠原的濃度為1-15wt％。

更優(yōu)選地，所述的步驟a中的紡絲液中藍鯊魚皮膠原與PEO的總濃度為3-6wt％，藍鯊魚皮膠原與PEO的質(zhì)量比為2-9∶1；所述的步驟a中的PEO為白色粉末，級別為醫(yī)用級，分子量為400-1000KDa。

更優(yōu)選地，所述的步驟1中的殼聚糖為白色粉末，脫乙酰度＞95％，級別為醫(yī)用級，A液中殼聚糖的濃度為0.8-7.2wt％；B液中藍鯊魚皮膠原的濃度為0.8-7.2wt％；PEO為白色粉末，級別為醫(yī)用級，分子量為400-1000KDa，紡絲液中PEO的濃度為0.4-2wt％。

更優(yōu)選地，所述的步驟B、步驟b和步驟2中的真空干燥溫度為20-140℃，真空干燥時間為12-48h。

更優(yōu)選地，所述的藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜中納米纖維直徑在100-600nm，納米纖維膜孔徑在0.5-6um，孔隙率在60％-90％，厚度在0.2-1.2mm；納米纖維膜的拉伸斷裂強度在5-20MPa，拉伸斷裂伸長率在5％-50％。

更優(yōu)選地，所述的藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的細胞相容性測試結(jié)果表明細胞相容性良好，細胞毒性評級0級。

本發(fā)明還提供了上述制備方法所制備的藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明采用靜電紡絲方法制得藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜，制備的材料具有小孔隙，高孔隙率，高連通性的優(yōu)點，能夠很好的模擬天然細胞質(zhì)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在發(fā)揮阻隔作用的同時不影響組織間營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的運輸，細胞也能夠很好的在膜上面粘附增殖和分化，促進組織的引導(dǎo)再生。采用靜電紡絲的方式制備藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生膜，制備過程安全快捷高效。

2.本發(fā)明的原材料藍鯊魚皮膠原來源廣泛，安全衛(wèi)生。具有優(yōu)良的細胞相容性和血液相容性，還可降解，且降解產(chǎn)物為細胞所必須的氨基酸，使用靜電紡絲的方法加工成納米纖維膜結(jié)構(gòu)，能夠促進細胞的粘附增殖和分化。

3.本發(fā)明的殼聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、抗菌性、促愈性。采用殼聚糖與藍鯊魚皮膠原混紡，由于在混紡膜中與藍鯊魚皮膠原發(fā)生相互作用，可以增加混紡膜的穩(wěn)定性，提高機械性能，還可以促進混紡膜與組織粘膜的粘附，PEO的加入進一步提高了納米纖維膜的機械性能和穩(wěn)定性。

4.本發(fā)明的藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜易與組織粘膜貼合，具有優(yōu)異的柔順性，可適應(yīng)給種類型的牙周組織引導(dǎo)再生需求，殼聚糖和PEO的加入提高了材料的穩(wěn)定性和機械性能。還可以通過交聯(lián)等后處理方式調(diào)節(jié)膜的降解時間，以適應(yīng)不同類型的牙周組織引導(dǎo)再生需求。

5.本發(fā)明所選材料來源廣泛，價廉易得，生物相容性好。材料可降解，避免了二次手術(shù)取出的傷害。制備工藝簡單高效，適宜大批量生產(chǎn)。

6.本發(fā)明方法制備的藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜，可用于臨床口腔疾病如口腔潰瘍、牙周組織缺損等的修復(fù)和治療。

7.本發(fā)明所采用的等電點提取技術(shù)制備藍鯊魚皮膠原，可以高效簡便的制備高純度、結(jié)構(gòu)完整的膠原蛋白，且制備過程污染小、效率高，便于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

8.本發(fā)明基于靜電紡絲成膜技術(shù)，可以制備出具有仿細胞質(zhì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的膜材料，促進細胞的粘附增殖和分化，而且由于孔隙之間的連通性，不會影響組織之間的營養(yǎng)物質(zhì)的運輸。并且采用靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維膜具有優(yōu)異的柔順性，可適應(yīng)各種類型創(chuàng)面，保證與創(chuàng)面組織的良好貼附。

附圖說明

圖1為實施例2中得到的藍鯊魚皮膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的掃描電鏡圖片

圖2為實施例3中得到的藍鯊魚皮膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的掃描電鏡圖片；

圖3為實施例4中得到的藍鯊魚皮膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的掃描電鏡圖片；

圖4為實施例5中得到的藍鯊魚皮膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的掃描電鏡圖片；

圖5為實施例6中得到的藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的掃描電鏡圖片；

圖6為實施例2中得到的藍鯊魚皮膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜覆蓋子35％冰醋酸溶液誘發(fā)大鼠實驗性口腔潰瘍模型上12天后的透射電鏡結(jié)果；

圖7為實施例2中得到的藍鯊魚皮膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜覆蓋于35％冰醋酸溶液誘發(fā)大鼠實驗性口腔潰瘍模型上12天后的光鏡病理組織學檢查結(jié)果；

圖8為實施例3中得到的藍鯊魚皮膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜覆蓋于35％冰醋酸溶液誘發(fā)大鼠實驗性口腔潰瘍模型上12天后的透射電鏡結(jié)果；

圖9為實施例3中得到的藍鯊魚皮膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜覆蓋于35％冰醋酸溶液誘發(fā)大鼠實驗性口腔潰瘍模型上12天后的光鏡病理組織學檢查結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

以下實施例中所用的殼聚糖為白色粉末，脫乙酰度＞95％，級別為醫(yī)用級。所述的PEO為白色粉末，分子量為400-1000KDa。

實施例1

藍鯊魚皮膠原的制備方法：

第一步：去除藍鯊皮下肌肉和脂肪組織，在蒸餾水下清洗浸泡0.5h。將魚皮剪成直徑3-5mm碎片，過濾備用；

第二步：將魚皮置于0.35mol/L NaOH溶液中脫脂處理，用磁力攪拌器攪拌6h。置于4℃的冰箱中冷藏12h。取出后用蒸餾水清洗過濾；

第三步：將魚皮置于體積分數(shù)為85％的乙醇溶液中進行脫糖處理，用磁力攪拌器攪拌2h，取出后用蒸餾水清洗過濾；

第四步：將魚皮用粉碎機粉碎，置于0.35mol/L冰醋酸溶液中水解處理，用磁力攪拌器攪拌6h，置于4℃的冰箱中冷藏4h，得到提取物；

第五步：采用等電點技術(shù)，將上述提取物，先經(jīng)過紗網(wǎng)過濾，取濾液，在濾液中滴加0.35mol/L NaOH溶液至等電點時(pH7.0)，可見大量白色棉絮狀物析出，將其過濾取沉淀物，蒸餾水清洗后擠干封裝，冷凍干燥保存。所得產(chǎn)物即為藍鯊魚皮膠原。

經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳檢測所得的藍鯊魚皮膠原為I型膠原，相對分子量為130-200KDa。

實施例2

一種藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的制備方法，具體步驟為：

(1)采用實施例1中的方法制備藍鯊魚皮膠原；

(2)利用藍鯊魚皮膠原以及殼聚糖和PEO進行靜電紡絲：

在體積分數(shù)為50％的乙酸水溶液中加入殼聚糖，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，溶液中殼聚糖的濃度為2wt％，記為A液；在90vol％的六氟異丙醇和10vol％乙酸的混合溶液中加入步驟(1)制備的藍鯊魚皮膠原，用磁力攪拌器攪拌24h至其完全溶解，溶液中藍鯊魚皮膠原的濃度為5.2wt％，記為B液。將A液、B液按照0.85∶1的體積比進行混合，用磁力攪拌器攪拌均勻后，加入PEO，再次用磁力攪拌器攪拌均勻使其完全溶解，得到紡絲液，其中PEO的濃度為1.1wt％。將此紡絲液加入到注射器當中并將注射器固定到推進裝置上。設(shè)定紡絲電壓為20Kv，紡絲液給進速率為1.1ml/h，接收距離為20cm。在環(huán)境溫度為28℃，相對濕度為20％的條件下進行靜電紡絲，可以得到納米纖維膜，將此納米纖維膜在37℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到藍鯊魚皮膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜，如圖1所示。

所制備的藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜厚度為1.1mm，拉伸斷裂強度15MPa，拉伸斷裂伸長率28％。從圖1可以看出所得的膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的纖維直徑為454±30nm，孔徑在3.4±1.1um之間，孔隙率為86±5％。

圖6和圖7為35vol％冰醋酸誘發(fā)大鼠實驗性口腔潰瘍的實驗結(jié)果，給藥12天后，取6只肉眼觀察潰瘍較輕的大鼠麻醉處死，取一小部分嘴唇潰瘍及周圍組織標本，切成1mm³大小組織，用4％多聚甲醛保存做透射電鏡檢查；另取一部分嘴唇潰瘍及周圍組織標本，用10％甲醛液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察潰瘍組織的組織病理學變化。從圖6可以看出：上皮細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，大部分較正常少數(shù)區(qū)域的上皮細胞間隙稍寬，上皮下結(jié)締組織內(nèi)梭形細胞較豐富，偶爾見嗜中性粒細胞及淋巴細胞，其他細胞內(nèi)未見空泡結(jié)構(gòu)；從圖7可以看出，口腔潰瘍部位組織基本痊愈，肉芽組織和纖維化形成較為明顯。此實驗可以證明靜電紡絲膜可顯著加速縮小口腔潰瘍直徑，減輕充血水腫程度，加速口腔潰瘍愈合。

實施例3

一種藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的制備方法，具體步驟為：

(3)采用實施例1中的方法制備藍鯊魚皮膠原；

(4)利用藍鯊魚皮膠原以及殼聚糖和PEO進行靜電紡絲：

在體積分數(shù)為40％的乙酸水溶液中依次加入殼聚糖、步驟(1)制備的藍鯊魚皮膠原、PEO，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，得到紡絲液。溶液中殼聚糖的濃度為1wt％，藍鯊魚皮膠原的濃度為3wt％，PEO的濃度為1wt％。將此紡絲液加入到注射器當中并將注射器固定到推進裝置上。設(shè)定紡絲電壓為16Kv，紡絲液給進速率為0.6ml/h，接收距離為20cm。在環(huán)境溫度為28℃，相對濕度為20％的條件下進行靜電紡絲，可以得到納米纖維膜，將此納米纖維膜在37℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到藍鯊魚皮膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜，如圖2所示。

所制備的藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜厚度為0.6mm，拉伸斷裂強度2MPa，拉伸斷裂伸長率6％。從圖2可以看出所得的膠原/殼聚糖/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的纖維直徑為205±30nm，孔徑在2.4±0.8um之間，孔隙率為76±6％。由于此實例與實例1獲得的靜電紡絲膜的組分相同，因此，可以認為其可顯著加速縮小口腔潰瘍直徑，減輕充血水腫程度，加速口腔潰瘍愈合。

實施例4

一種藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的制備方法，具體步驟為：

(1)采用實施例1中的方法制備藍鯊魚皮膠原；

(2)利用藍鯊魚皮膠原以及PEO進行靜電紡絲：

以六氟異丙醇60vol％和余量的乙酸的混合溶液為溶劑，在溶劑中加入藍鯊魚皮膠原，用磁力攪拌器攪拌24h使其完全溶解后加入PEO，再次攪拌至完全溶解，得到紡絲液，溶液中藍鯊魚皮膠原與PEO的總濃度為4wt％，其中藍鯊魚皮膠原與PEO的質(zhì)量比為4∶1。將此紡絲溶液加入到注射器當中并將注射器固定到推進裝置上。設(shè)定紡絲電壓為12Kv，紡絲液給進速率為1.3ml/h，接收距離為23cm。在環(huán)境溫度為32℃，相對濕度為28％的條件下進行靜電紡絲，可以得到納米纖維膜，將此納米纖維膜在30℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到藍鯊魚皮膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜，如圖3所示。

所制備的藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜厚度為0.9mm，拉伸斷裂強度10MPa，拉伸斷裂伸長率25％。從圖3中可以看出所得的膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的纖維直徑為358±33nm，孔徑為3.2±1um，孔隙率為(72±6％)。

圖8和圖9為35vol％冰醋酸誘發(fā)大鼠實驗性口腔潰瘍的實驗結(jié)果，給藥12天后，取6只肉眼觀察潰瘍較輕的大鼠麻醉處死，取一小部分嘴唇潰瘍及周圍組織標本，切成1mm³大小組織，用4％多聚甲醛保存做透射電鏡檢查；另取一部分嘴唇潰瘍及周圍組織標本，用10％甲醛液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察潰瘍組織的組織病理學變化。從圖8可以看出：上皮細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，大部分較正常少數(shù)區(qū)域的上皮細胞間隙稍寬，上皮下結(jié)締組織內(nèi)梭形細胞較豐富，偶爾見嗜中性粒細胞及淋巴細胞，其他細胞內(nèi)未見空泡結(jié)構(gòu)；其愈合程度比實例2的愈合程度略差。從圖9可以看出，口腔潰瘍部位組織基本痊愈，肉芽組織和纖維化形成較為明顯。此實驗可以證明靜電紡絲膜可顯著加速縮小口腔潰瘍直徑，減輕充血水腫程度，加速口腔潰瘍愈合。

實施例5

一種藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的制備方法，具體步驟為：

(3)采用實施例1中的方法制備藍鯊魚皮膠原；

(4)利用藍鯊魚皮膠原以及PEO進行靜電紡絲：

以乙酸60vol％和余量的去離子水的混合溶液為溶劑，在溶劑中加入藍鯊魚皮膠原，用磁力攪拌器攪拌24h使其完全溶解后加入PEO，再次攪拌至完全溶解，得到紡絲液，溶液中藍鯊魚皮膠原與PEO的總濃度為4wt％，其中藍鯊魚皮膠原與PEO的質(zhì)量比為4∶1。將此紡絲溶液加入到注射器當中并將注射器固定到推進裝置上。設(shè)定紡絲電壓為14Kv，紡絲液給進速率為0.3ml/h，接收距離為25cm。在環(huán)境溫度為32℃，相對濕度為28％的條件下進行靜電紡絲，可以得到納米纖維膜，將此納米纖維膜在30℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到藍鯊魚皮膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜，如圖4所示。

所制備的藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜厚度為0.5mm，拉伸斷裂強度1MPa，拉伸斷裂伸長率12％。從圖4中可以看出所得的膠原/PEO組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的纖維直徑為198±37nm，孔徑為2.2±1um，孔隙率為(74±4％)。由于此實例與實例3獲得的靜電紡絲膜的組分相同，因此，可以認為其可顯著加速縮小口腔潰瘍直徑，減輕充血水腫程度，加速口腔潰瘍愈合。

實施例6

一種藍鯊魚皮膠原牙周組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的制備方法，具體步驟為：

(1)采用實施例1中的方法制備藍鯊魚皮膠原；

(2)利用藍鯊魚皮膠原進行靜電紡絲：

以六氟異丙醇70vol％和余量的乙酸的混合溶液為溶劑，在溶劑中加入藍鯊魚皮膠原，用磁力攪拌器攪拌24h使其完全溶解，得到濃度為13wt％的紡絲溶液，將此紡絲溶液加入到注射器當中并將注射器固定到推進裝置上。設(shè)定紡絲電壓為10Kv，紡絲液給進速率為1.4ml/h，接收距離為25cm。在環(huán)境溫度為30℃，相對濕度為30％的條件下進行靜電紡絲，可以得到納米纖維膜，將此納米纖維膜在25℃的真空干燥箱中干燥24h，即可得到藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜，如圖3所示。

所制備的藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜厚度為0.8mm，拉伸斷裂強度7.3MPa，拉伸斷裂伸長率22％。從圖1中可以看出，所得的藍鯊魚皮膠原組織引導(dǎo)再生納米纖維膜的纖維直徑為363±35nm，孔徑為3.7±1.2um，孔隙率為78±9％。其比實施例2和實施例3的膠原含量更高，因此可以認為其更加可以減小口腔潰瘍的直徑，減輕充血水腫程度，加速口腔潰瘍的愈合。