本發(fā)明涉及高分子生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速凝膠化的絲素蛋白溶液及其制備方法。
背景技術(shù)：
組織工程是解決組織器官損傷的修復(fù)和重建潛在的有效途徑。用于組織修復(fù)的支架材料是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的核心內(nèi)容之一。水凝膠是組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。高分子水凝膠聚合物網(wǎng)絡(luò)中充斥大量的水，使得支架材料具備流體的性質(zhì)，這與機(jī)體組織微環(huán)境的液體極其相似。同時(shí)，水凝膠柔軟、潤濕的特征大大減少了材料對(duì)周圍組織的刺激性，提高了材料的組織相容性以及與損傷部位的吻合性，在組織工程和藥物釋放領(lǐng)域具有廣泛和現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用前景。
蠶絲絲素蛋白是由蠶絹絲腺的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性。絲素蛋白由乙氨酸、丙氨酸、絲氨酸等二十種氨基酸組成，可被生物降解且最終降解產(chǎn)物為多肽和游離氨基酸，容易被機(jī)體代謝。因此，絲素蛋白是一種較為理想的制備生物醫(yī)用材料的高分子原料。
絲素蛋白溶液可以形成絲素蛋白水凝膠。在常溫靜置下，絲素蛋白溶液會(huì)逐漸向凝膠化轉(zhuǎn)變，但是其轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變時(shí)間長。在無外界因素的促進(jìn)作用時(shí)，根據(jù)儲(chǔ)存溫度的不同，絲素蛋白的凝膠化過程需要數(shù)周到數(shù)月，即使在溫度達(dá)到接近體內(nèi)環(huán)境溫度37℃時(shí)，其凝膠時(shí)間也需要一周以上。絲素蛋白溶液凝膠化時(shí)間太長制約了絲素蛋白水凝膠的應(yīng)用。
增加絲素蛋白溶液的濃度可以在一定程度上加速絲素蛋白的凝膠速度（Biomacromolecules, 2004, 5(3): 786-792），但濃度的增加必然降低凝膠的含水率和孔隙率，從而限制了凝膠的使用。通過增加外加因素的誘導(dǎo)可以加速絲素蛋白的凝膠化。將絲素蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)至絲素蛋白的等電點(diǎn)時(shí)（pH=4左右），可以加快絲素蛋白的凝膠化，但其凝膠時(shí)間也需要8天左右（浙江工程學(xué)報(bào)，1999,16(3): 172-176）。添加表面活性劑、有機(jī)醇等化學(xué)試劑也能夠加速絲素蛋白的凝膠化速度。中國發(fā)明專利（CN102220017）公開了一種絲素蛋白水凝膠的制備方法，采用添加表面活性劑可以誘導(dǎo)絲素蛋白快速凝膠。中國發(fā)明專利（CN103289107）公開了一種絲素蛋白可注射水凝膠的制備方法，將有機(jī)醇和絲素蛋白溶液混合可以在短時(shí)間內(nèi)形成凝膠。但是，pH的降低和化學(xué)物質(zhì)使用將降低凝膠的生物相容性，而且不利于蛋白類生物活性物質(zhì)和細(xì)胞的加載。此外，中國發(fā)明專利（CN101502670）公開了一種超聲波誘導(dǎo)的方法制備絲素蛋白水凝膠，采用超聲波震蕩的方法，可以誘導(dǎo)絲素蛋白溶液在短時(shí)間內(nèi)形成凝膠，但是難以做到可注射和體內(nèi)成型，而且超聲波的局部劇烈作用會(huì)導(dǎo)致絲素蛋白分子的降解（Macromolecular Materials and Engineering, 2013, 298(11): 1201-1208），從而破壞絲素蛋白水凝膠的物理、化學(xué)和生物學(xué)性能。
鑒于以上缺陷，本發(fā)明人通過積極研究并加以創(chuàng)新，設(shè)計(jì)了一種通過冷凍誘導(dǎo)絲素蛋白快速凝膠化的方法，促進(jìn)絲素蛋白作為生物醫(yī)用水凝膠的發(fā)展，使其更具有產(chǎn)業(yè)化上的利用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種綠色、溫和的方法加速絲素蛋白凝膠化，促進(jìn)絲素蛋白作為生物醫(yī)用水凝膠的發(fā)展。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
一種快速凝膠化的絲素蛋白溶液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1.取純化的絲素蛋白溶液，將其質(zhì)量濃度調(diào)整為0.1-10%；
S2.將純化的絲素蛋白溶液在不高于0℃下進(jìn)行冷凍處理，得到冷凍體；
S3.將冷凍體在0℃~37 ℃下解凍，得到解凍的絲素蛋白溶液；
S4.將解凍的絲素蛋白溶液離心去除不溶物，得到具有快速凝膠化特征的絲素蛋白溶液。
進(jìn)一步地，所述步驟S2冷凍處理是在-10~0℃下進(jìn)行。
進(jìn)一步地，所述冷凍處理的時(shí)間為2-48h。
進(jìn)一步地，所述冷凍體為凝固態(tài)，其中絲素蛋白處于濃縮狀態(tài)。
進(jìn)一步地，所述步驟S4中離心是以轉(zhuǎn)速10000-20000r/min離心2-10min。
進(jìn)一步地，所述絲素蛋白為家蠶絲素蛋白。
一種快速凝膠化的絲素蛋白溶液，由上述方法制備而成。
一種快速凝膠化的絲素蛋白水凝膠，由上述快速凝膠化的絲素蛋白溶液制成。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用簡單的冷凍方法誘導(dǎo)絲素蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變形成快速凝膠化特征的絲素蛋白溶液，制備過程溫和，制備條件綠色可控，避免了化學(xué)試劑、高溫和劇烈的機(jī)械作用等條件的使用，不會(huì)引起絲素蛋白生物相容性的降低和分子的降解；本發(fā)明的絲素蛋白溶液無需添加任何化學(xué)試劑即可快速形成水凝膠，因此具有良好的生物相容性，可用于裝載生物活性因子和活細(xì)胞，對(duì)促進(jìn)絲素蛋白作為生物醫(yī)用水凝膠的應(yīng)用發(fā)展具有重要意義。
附圖說明
圖1為實(shí)施例1制備過程中絲素蛋白的凝膠動(dòng)力學(xué)曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。
實(shí)施例1
將100g家蠶生絲浸漬入5 L的0.05%NaCO3溶液中，于98-100℃下煮沸處理30 min，重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維；將絲素纖維加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下攪拌溶解1 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；
將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到2%，在-7℃下冷凍24h成絲素蛋白冷凍固體；
將絲素蛋白冷凍固體在室溫25℃下融化，獲得解凍的絲素蛋白溶液；
解凍的絲素蛋白溶液以10000 r/min離心5 min，去除凍干過程形成的少量不溶物，獲得具有快速凝膠化特征的絲素蛋白溶液；
將實(shí)施例1制備過程中得到的絲素蛋白溶液用酶標(biāo)儀在37℃下檢測(cè)波長550 nm處吸光度隨時(shí)間的變化，表征絲素溶液的凝膠化過程，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。
實(shí)施例2
將脫膠的絲素纖維加入到摩爾比1:2:8的CaCl2/CH3CH2OH/H2O三元溶液中，在72℃下攪拌溶解1 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；
將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到3%，析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；
將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到3%，在-4℃下冷凍20 h成絲素蛋白冷凍固體；
將絲素蛋白冷凍固體在37℃下融化，獲得解凍的絲素蛋白溶液；
解凍的絲素蛋白溶液以20000 r/min離心3 min，去除凍干過程形成的少量不溶物，獲得具有快速凝膠化特征的絲素蛋白溶液；
將上述絲素蛋白溶液置于37℃下靜置，獲得由具有快速凝膠化特這的絲素蛋白溶液制成的水凝膠。
實(shí)施例3
將脫膠的絲素纖維加入到熔融的Ca(NO3)2溶液中，在90℃下攪拌溶解2 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；
將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到2%，在-7℃下冷凍24h成絲素蛋白冷凍固體；
將絲素蛋白冷凍固體在0℃下融化，獲得解凍的絲素蛋白溶液；
解凍的絲素蛋白溶液以10000 r/min離心5 min，去除凍干過程形成的少量不溶物，獲得具快速凝膠化特征的絲素蛋白溶液。
實(shí)施例4
將100g家蠶生絲浸漬入5 L的0.05%NaCO3溶液中，于98-100℃下煮沸處理30 min，重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維；將絲素纖維加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下攪拌溶解1 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；
將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到10%，在-10℃下冷凍2h成絲素蛋白冷凍固體；
將絲素蛋白冷凍固體在20℃下融化，獲得解凍的絲素蛋白溶液；
解凍的絲素蛋白溶液以10000 r/min離心2 min，去除凍干過程形成的少量不溶物，獲得具有快速凝膠化特征的絲素蛋白溶液。
實(shí)施例5
將100g家蠶生絲浸漬入5 L的0.05%NaCO3溶液中，于98-100℃下煮沸處理30 min，循環(huán)重復(fù)進(jìn)行浸漬、煮沸處理3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維；將絲素纖維加入到9.3 mol/L的LiBr溶液中，在60℃下攪拌溶解1 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；
將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到0.1%，在0℃下冷凍48h成絲素蛋白冷凍固體；
將絲素蛋白冷凍固體在25℃下融化，獲得解凍的絲素蛋白溶液；
解凍的絲素蛋白溶液以15000 r/min離心10 min，去除凍干過程形成的少量不溶物，獲得具有快速凝膠化特征的絲素蛋白溶液。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。