本發(fā)明涉及一種鹽致相變制備外周神經(jīng)導(dǎo)管的方法，具體地說，涉及一種用于外周神經(jīng)缺損修復(fù)導(dǎo)管的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

神經(jīng)移植是修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的有效方法。目前較常采用的是自體神經(jīng)移植，但由于自體神經(jīng)移植需要對供體進(jìn)行手術(shù)切取、供區(qū)易形成神經(jīng)瘤、疤痕以及神經(jīng)來源有限等原因，其臨床使用受到限制。隨著材料學(xué)的發(fā)展，各種可降解的生物材料被用于制作人工神經(jīng)導(dǎo)管，以彌補(bǔ)自體神經(jīng)用于神經(jīng)移植的不足。其中較常使用的材料包括聚乳酸、聚丙交酯、聚羥基脂肪酸酯及它的共聚物等合成高分子材料；殼聚糖及其衍生物、膠原、絲膠等天然生物材料。合成高分子材料一般具有較好的力學(xué)性能，但由于其降解產(chǎn)物呈酸性等原因，會造成移植體周圍無菌性感染或炎癥。

相比而言，天然大分子材料較合成高分子材料生物相容性更加優(yōu)良，尤其地，殼聚糖類材料被證實(shí)其降解產(chǎn)物殼寡糖具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用(楊宇民等，《殼寡糖對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響》，交通醫(yī)學(xué),2007,21(6))；但單一的天然可降解高分子材料如殼聚糖或膠原蛋白無法解決本身的力學(xué)強(qiáng)度差的弊端，解決的辦法主要是與其他合成高分子材料復(fù)合或?qū)ぞ厶羌捌溲苌镞M(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，如發(fā)明專利《一種神經(jīng)導(dǎo)管支架及其制備方法》(發(fā)明專利授權(quán)號：CN101474423B)便采用了添加聚乙醇酸來提高導(dǎo)管材料的力學(xué)強(qiáng)度；而發(fā)明專利《一種可降解的羧甲基殼聚糖復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法及應(yīng)用》(發(fā)明專利授權(quán)號：ZL201010594628)則對羧甲基殼聚糖通過1，4-丁二醇雙縮水甘油醚(BDDE)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)同時(shí)添加聚乙烯醇(PVA)來提高導(dǎo)管的力學(xué)強(qiáng)度。因此如何既保留天然可降解高分子的生物學(xué)特性同時(shí)又保證成分單一、無需引入交聯(lián)劑等化學(xué)物質(zhì)最終還能提供優(yōu)良的力學(xué)性能便成為神經(jīng)導(dǎo)管制備方法的發(fā)展趨勢。

溫敏性幾丁糖凝膠是一種新型的幾丁糖衍生物(專利號ZL200810033699.6)，其主要特點(diǎn)是對溫度的高度智能響應(yīng)，即低溫下為流動的液體，當(dāng)溫度升高時(shí)則 轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃拥哪z，該特點(diǎn)使其易于注模成型、操作方便；同時(shí)還具有其他幾丁糖及其衍生物所不具有的特點(diǎn)—鹽致相變：(專利申請?zhí)枺?01410007429.3)，即當(dāng)浸泡于一定離子強(qiáng)度鹽溶液時(shí)凝膠發(fā)生相轉(zhuǎn)變，整個(gè)過程凝膠的力學(xué)強(qiáng)度發(fā)生非常大的提高，該特點(diǎn)可以提高單一天然高分子的力學(xué)強(qiáng)度。

基于上述兩種特點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種單一天然可降解高分子組分且具有良好力學(xué)強(qiáng)度的神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法，該方法在國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道，且方法操作簡便，導(dǎo)管力學(xué)強(qiáng)度優(yōu)良且成分單一無需添加任何的交聯(lián)劑等化學(xué)物質(zhì)。

創(chuàng)新點(diǎn)

1.本發(fā)明采用溫敏性幾丁糖為原料，且已通過第三方的生物學(xué)評價(jià)，生物相容性良好；

2.利用鹽致相變的物理方法增強(qiáng)單一天然組分神經(jīng)導(dǎo)管的力學(xué)強(qiáng)度，全程不引入任何的有機(jī)溶劑；

3.管壁為多孔結(jié)構(gòu)，利于雪旺細(xì)胞的黏附和增殖；

4.工藝簡單，生產(chǎn)成本較低，利于產(chǎn)品質(zhì)量控制，易于產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化。

附圖說明

圖1導(dǎo)管截面SEM圖

圖2導(dǎo)管內(nèi)表面SEM圖

圖3神經(jīng)導(dǎo)管拉伸伸長曲線

圖4為神經(jīng)導(dǎo)管壓縮性能曲線

圖5神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁雪旺細(xì)胞培養(yǎng)3天后SEM圖

圖6 8周后再生神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

圖7 8周后字體移植神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為目前神經(jīng)導(dǎo)管制備中存在的技術(shù)問題，采用的技術(shù)方案是提供一種鹽致相變制備外周神經(jīng)導(dǎo)管的方法，所述方法包括：制備溫敏性幾丁糖溶液；低溫下將溫敏性幾丁糖溶液灌裝于帶芯棒的定型裝置中；將所述溶液和定型裝置在一定溫度下放置，為溶液賦形并進(jìn)一步形成具有管狀結(jié)構(gòu)凝膠；將所述形成凝膠的溶液連同芯棒從定型裝置中取出，利用鹽致相變原理，置于具有離子強(qiáng)度的鹽 溶液中進(jìn)一步形成具有一定強(qiáng)度的彈性凝膠體；使用純水清洗所述的彈性凝膠體；將所述的彈性凝膠體真空冷凍干燥，去除芯棒，得到外周神經(jīng)導(dǎo)管。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)神經(jīng)導(dǎo)管制備，采用一種帶芯棒的定型裝置，所述芯棒與定型裝置連接；所述芯棒采用相變材料涂層、ePTFE涂層或硅油涂層，以方便冷凍干燥后將神經(jīng)導(dǎo)管與芯棒分離，且不對神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁結(jié)構(gòu)造成破壞；所述神經(jīng)導(dǎo)管經(jīng)冷凍干燥后，其管壁呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)徑0.5-3mm，長度0.5-40mm。大體步驟如下：

第一步溫敏性幾丁糖溶液的注模

將所濃度為0.4％-1％(w/v)的溫敏性幾丁糖溶液低溫下灌至帶芯棒的定型裝置中。

第二步溫敏性幾丁糖溶液凝膠化賦形

將灌注好的溫敏性幾丁糖溶液在溫度為20-60℃的環(huán)境下放置10-60min進(jìn)行凝膠化和賦形。

第三步鹽致相轉(zhuǎn)變

將凝膠化賦形好的凝膠放入濃度為0.5％-5％的CH₃COONa、CH₃COONH₄、NaCl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、Na₂SO₄、Na₂CO₃或NaHCO₃、等的一種或一種以上混合鹽溶液中浸泡12-48h后得到彈性凝膠體。

第四步神經(jīng)導(dǎo)管的清洗

將彈性凝膠轉(zhuǎn)入純化水中，采用采用靜態(tài)浸洗、超聲波清洗或機(jī)械振動方式清洗10-60分鐘，得到神經(jīng)導(dǎo)管中間品。

第五步冷凍干燥和滅菌

將神經(jīng)導(dǎo)管中間品放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，得到幾丁糖神經(jīng)導(dǎo)管，最后通過⁶⁰Co輻照滅菌得到神經(jīng)導(dǎo)管成品。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例一：

以濃度為0.4％的溫敏性幾丁糖溶液為原料，制備內(nèi)徑為0.5mm，長度為1mm的神經(jīng)導(dǎo)管，具體步驟為：將羥丁基原料置入特制模具中，40℃放置10min，待溶液形成凝膠并具有一定強(qiáng)度后，將芯棒與凝膠一起取出置于0.5％(w/v)NaCl溶液中收縮12h。將樣品取出-20℃預(yù)凍后，冷凍干燥12h。去除芯棒⁶⁰Co輻照滅菌即成溫敏性幾丁糖神經(jīng)導(dǎo)管。

實(shí)施例二：

以濃度為0.8％的溫敏性幾丁糖溶液為原料，制備內(nèi)徑為1mm，長度為10mm的神經(jīng)導(dǎo)管，具體步驟為：將羥丁基原料置入特制模具中，20℃放置60min，待溶液形成凝膠并具有一定強(qiáng)度后，將芯棒與凝膠一起取出置于2.5％(w/v)CH₃COONH₄溶液中收縮48h。將樣品取出-30℃預(yù)凍后，冷凍干燥18h。去除芯棒⁶⁰Co輻照滅菌即成溫敏性幾丁糖神經(jīng)導(dǎo)管。

實(shí)施例三：

以濃度為1％的溫敏性幾丁糖溶液為原料，制備內(nèi)徑為3mm，長度為40mm的神經(jīng)導(dǎo)管，具體步驟為：將羥丁基原料置入特制模具中，60℃放置40min，待溶液形成凝膠并具有一定強(qiáng)度后，將芯棒與凝膠一起取出置于5％(w/v)Na₂HPO₄和CH₃COONa溶液中收縮24h。將樣品取出-40℃預(yù)凍后，冷凍干燥24h。去除芯棒60Co輻照滅菌即成溫敏性幾丁糖神經(jīng)導(dǎo)管。

實(shí)施例四

將實(shí)施例三中制備的樣品，進(jìn)行液氮脆斷，通過掃描電鏡進(jìn)行斷面和內(nèi)表面的SEM觀察，結(jié)果現(xiàn)實(shí)本發(fā)明制備的神經(jīng)導(dǎo)管具有豐富的多孔結(jié)構(gòu)(圖1)，有利于神經(jīng)損傷修復(fù)過程中營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換，更好地促進(jìn)神經(jīng)的再生和功能修復(fù)，同時(shí)內(nèi)表面也具有豐富的多孔結(jié)構(gòu)(圖2)，粗糙的表面有利于雪旺細(xì)胞的黏附和增殖。

將實(shí)施例三中制備的樣品上截取3cm樣品進(jìn)行測試。將樣品固定在拉力測試機(jī)上，調(diào)整預(yù)加張力使樣品恰好伸直但無拉伸。以20mm/min的速度進(jìn)行拉伸直至樣品斷裂。記錄神經(jīng)導(dǎo)管的拉伸伸長率(結(jié)果見圖3)；結(jié)果顯示本發(fā)明制 備的神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的力學(xué)強(qiáng)度，彈性性能優(yōu)良，斷裂時(shí)伸長率可達(dá)到300％以上，該特性確保了臨床使用過程中良好的操作性，同時(shí)良好的彈性張力有利于雪旺細(xì)胞的增殖和神經(jīng)損傷的修復(fù)。

實(shí)施例五

從實(shí)施例三制備的樣品上截取2cm樣品進(jìn)行測試。將樣品置于下測試平臺，調(diào)整上測試平臺恰好與樣品接觸。上測試平臺以2mm/min速度勻速下降，下降距離為樣品直徑50％時(shí)上夾持平臺返回原位，重復(fù)測試5次(圖4)；結(jié)果顯示本發(fā)明制備的神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的壓縮回復(fù)性能，多次重復(fù)壓縮后仍能回復(fù)，保證了使用過程中不被周圍組織所壓癟，有利于神經(jīng)的修復(fù)和功能恢復(fù)。

實(shí)施例六

從實(shí)施例二制備的樣品中任取樣品，沿縱向剖開、裁剪尺寸并置于96孔板中，導(dǎo)管內(nèi)壁向上。酒精浸泡4h后PBS洗滌3次，紫外燈照射。雪旺細(xì)胞以1500/孔的密度種植于導(dǎo)管內(nèi)壁上。培養(yǎng)3天后，SEM觀察雪旺細(xì)胞在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁的生長情況。(圖5)，結(jié)果現(xiàn)實(shí)本發(fā)明制備的神經(jīng)導(dǎo)管能夠促進(jìn)雪旺細(xì)胞的黏附和增殖。

實(shí)施例七

選用20只雄性SD大鼠(180～220g),采用1％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠左股后外側(cè)行縱形切口,自肌間隙進(jìn)入顯露坐骨神經(jīng)約2.5cm。于坐骨神經(jīng)中段切取12mm，任其回縮到15mm，采用實(shí)施例三中制得的神經(jīng)導(dǎo)管橋接神經(jīng)缺損，二端分別套入1mm，10-0尼龍線3針固定。手術(shù)均在顯微鏡下完成，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。分別于術(shù)后4、8、12、16周取材檢測(再生神經(jīng)的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果如圖6所示)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后8周，缺損部位已經(jīng)有新生神經(jīng)，甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示再生的神經(jīng)纖維均一有序，與自體移植神經(jīng)相似(圖7)，表明本發(fā)明制備的神經(jīng)導(dǎo)管能很好地促進(jìn)神經(jīng)的損傷修復(fù)。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許的修改和完善，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。