技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑等。另外，本發(fā)明涉及用于選拔誘導(dǎo)PPARγ表達(dá)并由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的物質(zhì)來(lái)作為骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑的篩選方法。

背景技術(shù)：

作為骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤，已知有骨中產(chǎn)生的骨巨細(xì)胞瘤、軟組織中產(chǎn)生的腱鞘巨細(xì)胞瘤、色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎等。

骨巨細(xì)胞瘤是在青年～中老年的膝關(guān)節(jié)周圍好發(fā)的良性腫瘤，男女比例為1:1.3～1.5，女性的患病率高。另外，占全部骨腫瘤中的約5％，占良性骨腫瘤中的約20％，雖是良性腫瘤，但復(fù)發(fā)率高達(dá)10～30％，另外，有時(shí)存在因肺轉(zhuǎn)移、惡性轉(zhuǎn)化而使治療困難的情況。依病理所見(jiàn)，多核巨細(xì)胞和單核細(xì)胞的增生是主體，其間觀察到梭形細(xì)胞。認(rèn)為腫瘤的主體并非該多核巨細(xì)胞，而是存在于間質(zhì)的成纖維細(xì)胞樣的梭形細(xì)胞。此外，由于在膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、手關(guān)節(jié)等關(guān)節(jié)附近產(chǎn)生，所以最重要的是如何進(jìn)行預(yù)防復(fù)發(fā)且保護(hù)關(guān)節(jié)功能的治療。

腱鞘巨細(xì)胞瘤是由腱鞘、關(guān)節(jié)、滑液囊的滑膜產(chǎn)生的腫瘤性疾病?；诓∽兊脑鲋承?，被分為局限型和彌漫型，一般認(rèn)為，局限型的病變與腱鞘巨細(xì)胞瘤的意思相同，彌漫型的腱鞘巨細(xì)胞瘤與色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的意思相同。腱鞘巨細(xì)胞瘤好發(fā)于30～50歲的女性，約85％在手指的關(guān)節(jié)附近、屈肌腱上產(chǎn)生，其次在腳趾產(chǎn)生。也有時(shí)浸潤(rùn)到骨內(nèi)。依病理所見(jiàn)，卵圓形～梭形的組織細(xì)胞樣單核細(xì)胞是主體，多核巨細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中伴隨含鐵血黃素沉著。治療依照良性腫瘤而進(jìn)行腫瘤切除術(shù)(單純摘除術(shù))，復(fù)發(fā)率被報(bào)告為4～30％。

色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎在40歲以下的相對(duì)年輕的成年人中女性略多，膝關(guān)節(jié)最多，在股、足、肘、肩關(guān)節(jié)等也產(chǎn)生。關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生滑膜的絨毛像、結(jié)節(jié)樣的增殖，屢見(jiàn)關(guān)節(jié)血癥，另外，也浸潤(rùn)到骨內(nèi)，因此產(chǎn)生二次變形性關(guān)節(jié)癥。依病理所見(jiàn)，滑膜細(xì)胞樣的單核細(xì)胞和多核巨細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、含鐵血黃素吞噬細(xì)胞、炎癥性細(xì)胞等混合存在。治療是在手術(shù)中切除腫瘤，但難以完全切除，復(fù)發(fā)率高達(dá)40～50％。

對(duì)于骨巨細(xì)胞瘤、腱鞘巨細(xì)胞瘤、色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎，目前均沒(méi)有開(kāi)發(fā)出手術(shù)以外的有效治療法。

軟骨肉瘤占原發(fā)性惡性骨腫瘤的約20％，僅次于骨肉瘤，頻率高。組織學(xué)上被分成普通型軟骨肉瘤、骨膜性軟骨肉瘤、間葉性軟骨肉瘤、去分化型軟骨肉瘤、透明細(xì)胞型軟骨肉瘤、骨外粘液型軟骨肉瘤等。普通型好發(fā)于30～50歲，男性多。最多發(fā)生在骨盆骨，其次在肋骨·股骨近端·肱骨近端·股骨遠(yuǎn)端多發(fā)。間葉性軟骨肉瘤與普通型軟骨肉瘤相比，好發(fā)于年輕的10～30歲人群，好發(fā)于顎骨·脊椎·髂骨·肋骨·股骨遠(yuǎn)端部等。去分化型軟骨肉瘤是由低惡性普通型軟骨肉瘤產(chǎn)生非軟骨性高惡性腫瘤的，兩者具有明顯的邊界并鄰接。好發(fā)于50～60歲，股骨最多，其次在骨盆·肱骨也多。透明細(xì)胞型軟骨肉瘤好發(fā)于20～50歲，約2/3在肱骨骨頭·股骨骨頭產(chǎn)生。除此之外，在頭蓋骨·脊椎·手足的骨頭產(chǎn)生。骨外粘液型軟骨肉瘤好發(fā)于40～50歲，在大腿等四肢的近端部、軀干的深部軟組織、四肢末端部、縱隔、后腹膜等軟組織中產(chǎn)生?，F(xiàn)在，對(duì)于這些腫瘤，除手術(shù)以外的有效治療尚未開(kāi)發(fā)出來(lái)。

另外，過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ：Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ)是屬于核受體超家族的蛋白質(zhì)，也作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能。PPARγ主要分布在脂肪組織，與脂肪細(xì)胞分化等相關(guān)，除此之外，還發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)，但是作為其它作用，報(bào)告了具有抗糖尿病作用、抗動(dòng)脈硬化作用、骨代謝、抗腫瘤作用、抗炎作用。例如，報(bào)告了PPARγ的活化引起各種腫瘤的細(xì)胞凋亡(非專利文獻(xiàn)1、2)，確認(rèn)了PPARγ在乳癌(非專利文獻(xiàn)3)、大腸癌(非專利文獻(xiàn)4)、肺癌(非專利文獻(xiàn)5)等各種癌細(xì)胞中表達(dá)。另外，報(bào)告了PPARγ的活化除受PPARγ配體誘導(dǎo)之外，還受非甾體抗炎劑誘導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(非專利文獻(xiàn)6)。

然而，目前為止并沒(méi)有關(guān)于以骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤的PPARγ的表達(dá)和PPARγ為靶的治療的報(bào)告，僅公開(kāi)了對(duì)作為腱鞘巨細(xì)胞瘤或骨巨細(xì)胞瘤的類似疾病的色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎具有IL-6產(chǎn)生抑制帶來(lái)的細(xì)胞增殖抑制、抗炎作用的咪唑立賓(專利文獻(xiàn)1)。

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：WO2008/026729

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Jpn J Cancer Res.1999；90：75-80

非專利文獻(xiàn)2：FEBS Lett.1999；455：135-139

非專利文獻(xiàn)3：Biochem Pharmacol.2011；82：464-475

非專利文獻(xiàn)4：Cancer Lett.2010；297：65-74

非專利文獻(xiàn)5：Mol Pharmacol.2007；72：674-685

非專利文獻(xiàn)6：J Pharmacol Exp Ther.2002；302：18-25

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中誘導(dǎo)PPARγ表達(dá)且誘導(dǎo)介由PPARγ進(jìn)行的細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的物質(zhì)作為骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑。本發(fā)明進(jìn)一步的目的在于提供一種用于選拔誘導(dǎo)PPARγ表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的物質(zhì)作為骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑的篩選方法。

本發(fā)明人等確認(rèn)了在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中PPARγ通常不表達(dá)。此外，另一方面確認(rèn)了在被給予了扎托洛芬的骨巨細(xì)胞瘤中PPARγ表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、向脂肪細(xì)胞的分化，其中，所述扎托洛芬屬于非甾體抗炎劑之一，具有PPARγ激動(dòng)活性，所述骨巨細(xì)胞瘤屬于骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤。

本發(fā)明人等基于上述見(jiàn)解進(jìn)一步進(jìn)行了深入研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明提供如下技術(shù)等：

[1]一種骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑，含有非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物作為有效成分；

[2]根據(jù)上述[1]記載的預(yù)防或治療劑，非甾體抗炎劑選自扎托洛芬、雙氯芬酸、吲哚美辛、奧沙普秦、對(duì)乙酰氨基酚以及酮洛；

[3]根據(jù)上述[1]記載的預(yù)防或治療劑，噻唑烷衍生物選自曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮；

[4]根據(jù)上述[1]～[3]中任一個(gè)記載的預(yù)防或治療劑，骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤選自骨巨細(xì)胞瘤、腱鞘巨細(xì)胞瘤和色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎；

[5]一種骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑的篩選方法，包括以下工序：

(1)將來(lái)自骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的細(xì)胞在被檢物質(zhì)存在的條件下或不存在的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的工序；

(2)在兩個(gè)條件下，分別測(cè)定PPARγ基因的表達(dá)，和

(i)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，或者

(ii)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)或脂質(zhì)的表達(dá)的工序；

(3)與被檢物質(zhì)不存在的條件下進(jìn)行比較，選擇有意地使PPARγ基因的表達(dá)，和

(i)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，或者

(ii)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)或脂質(zhì)的表達(dá)改變的被檢物質(zhì)的工序；

[6]根據(jù)上述[5]記載的篩選方法，骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤選自骨巨細(xì)胞瘤、腱鞘巨細(xì)胞瘤和色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎；

[7]一種骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療方法，包括向?qū)ο蠼o予有效量的非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物；

[8]根據(jù)上述[7]記載的預(yù)防或治療方法，非甾體抗炎劑選自扎托洛芬、雙氯芬酸、吲哚美辛、奧沙普秦、對(duì)乙酰氨基酚以及酮洛芬；

[9]根據(jù)上述[7]記載的預(yù)防或治療方法，噻唑烷衍生物選自曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮；

[10]根據(jù)上述[7]～[9]中任一個(gè)記載的預(yù)防或治療方法，骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤選自骨巨細(xì)胞瘤、腱鞘巨細(xì)胞瘤和色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎；

[11]一種用于骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療的非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物；

[12]根據(jù)上述[11]記載的非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物，非甾體抗炎劑選自扎托洛芬、雙氯芬酸、吲哚美辛、奧沙普秦、對(duì)乙酰氨基酚以及酮洛芬；

[13]根據(jù)上述[11]記載的非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物，噻唑烷衍生物選自曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮、巴格列酮以及利格列酮；

[14]根據(jù)上述[11]～[13]中任一個(gè)記載的非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物，骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤選自骨巨細(xì)胞瘤、腱鞘巨細(xì)胞瘤和色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎。

通過(guò)使用本發(fā)明的預(yù)防或治療劑，能夠向骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤患者給予來(lái)作為外科手術(shù)前或后的化學(xué)療法劑，或者向可能患有骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的人給予來(lái)作為預(yù)防劑。另外，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)選擇控制PPARγ和細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的被檢物質(zhì)，能夠探索骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的新型預(yù)防或治療劑。

附圖說(shuō)明

圖1是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制的結(jié)果的圖。

圖2是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的Tunel檢測(cè)的結(jié)果的圖。

圖3是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞中的Tunel陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖4是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的Caspase3染色的結(jié)果的圖。

圖5是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞中的Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖6是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的PPARγ染色的結(jié)果的圖。

圖7是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞中的PPARγ陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖8是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的脂質(zhì)染色的結(jié)果的圖。

圖9是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞中的脂質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖10是表示來(lái)自被給予扎托洛芬的GCT患者的GCT標(biāo)本的Tunel檢測(cè)和Caspase3染色的結(jié)果的圖。

圖11是表示來(lái)自被給予扎托洛芬的GCT患者的GCT標(biāo)本的PPARγ染色的結(jié)果的圖。

圖12是表示在含有對(duì)乙酰氨基酚、吲哚美辛、雙氯芬酸或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制的結(jié)果的圖。

圖13是表示在含有對(duì)乙酰氨基酚、吲哚美辛、雙氯芬酸或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制的結(jié)果的圖。

圖14是表示PPARγsiRNA對(duì)在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的效果的圖。

圖15是表示PPARγsiRNA對(duì)在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的效果的圖。

圖16是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制的結(jié)果的圖。

圖17是表示在含有曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制的結(jié)果的圖。

圖18是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞的Tunel檢測(cè)的結(jié)果的圖。

圖19是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞中的Tunel陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖20是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞的Tunel檢測(cè)的結(jié)果的圖。

圖21是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞中的Tunel陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖22是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞的Caspase3染色的結(jié)果的圖。

圖23是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞中的Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖24是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞的Caspase3染色的結(jié)果的圖。

圖25是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞中的Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖26是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞的PPARγ染色的結(jié)果的圖。

圖27是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞中的PPARγ陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖28是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞的PPARγ染色的結(jié)果的圖。

圖29是表示在含有扎托洛芬或曲格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞中的PPARγ陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖30是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞的脂質(zhì)染色的結(jié)果的圖。

圖31是表示在含有扎托洛芬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞中的脂質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖32是表示在含有吡格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的GCT培養(yǎng)細(xì)胞、來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的培養(yǎng)細(xì)胞、來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的培養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制的結(jié)果的圖。

圖33是表示扎托洛芬服用前的骨盆部骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者的骨盆部的X射線圖像的圖。

圖34是表示扎托洛芬服用前的骨盆部骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者的骨盆部的MRI圖像的圖。

圖35是表示扎托洛芬服用后經(jīng)過(guò)2個(gè)月后的骨盆部骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者的骨盆部的MRI圖像的圖。箭頭表示腫瘤的壞死區(qū)域。

圖36是表示扎托洛芬服用后經(jīng)過(guò)4個(gè)月后的骨盆部骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者的骨盆部的MRI圖像的圖。箭頭表示腫瘤的壞死區(qū)域。

圖37是表示扎托洛芬給予前的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部矢狀面的MRI圖像的圖。

圖38是表示扎托洛芬給予前的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部橫截面的MRI圖像的圖。

圖39是表示扎托洛芬給予后經(jīng)過(guò)3個(gè)月后的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部矢狀面的MRI圖像的圖。箭頭表示MRI造影效果的減弱。

圖40是表示扎托洛芬給予后經(jīng)過(guò)3個(gè)月后的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部橫截面的MRI圖像的圖。箭頭表示MRI造影效果的減弱。

圖41是表示扎托洛芬給予前的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部冠狀面的MRI圖像的圖。

圖42是表示扎托洛芬給予前的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部橫截面的MRI圖像的圖。

圖43是表示扎托洛芬給予后經(jīng)過(guò)2個(gè)月后的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部冠狀面的MRI圖像的圖。箭頭表示腫瘤的縮小。

圖44是表示扎托洛芬給予后經(jīng)過(guò)2個(gè)月后的右膝部色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎復(fù)發(fā)患者的右膝部橫截面的MRI圖像的圖。箭頭表示腫瘤的縮小。

圖45是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株的增殖抑制的結(jié)果的圖。

圖46是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株的Caspase3染色的結(jié)果的圖。

圖47是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株中的Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

圖48是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株的PPARγ染色的結(jié)果的圖。

圖49是表示在含有扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株中的PPARγ陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在來(lái)自骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤患者的細(xì)胞中PPARγ不表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)具有PPARγ激動(dòng)活性的特定物質(zhì)在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤中誘導(dǎo)PPARγ表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化。因此，本發(fā)明提供一種能夠利用PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性和PPARγ激動(dòng)活性，在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤中誘導(dǎo)介由PPARγ進(jìn)行的細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤的預(yù)防或治療劑。另外，本發(fā)明還提供一種能夠利用PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性和PPARγ激動(dòng)活性，誘導(dǎo)介由PPARγ進(jìn)行的細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑。

作為可適用本發(fā)明的預(yù)防或治療劑的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤，只要是觀察到骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞的腫瘤，就沒(méi)有特別限制。特別優(yōu)選適用于在骨、關(guān)節(jié)或腱鞘周邊產(chǎn)生巨細(xì)胞的腫瘤。另外，作為觀察到骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞的腫瘤，優(yōu)選是良性腫瘤。作為這樣的腫瘤，例如，可舉出骨巨細(xì)胞瘤、腱鞘巨細(xì)胞瘤、色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎等。另外，作為其它的骨·軟組織中產(chǎn)生的良性巨細(xì)胞性腫瘤，還可舉出成軟骨細(xì)胞瘤、非骨化性纖維瘤、成骨細(xì)胞瘤、動(dòng)脈瘤樣骨囊腫等。

另外，作為可適用本發(fā)明的預(yù)防或治療劑的軟骨肉瘤，可舉出普通型軟骨肉瘤、骨膜性軟骨肉瘤、間葉性軟骨肉瘤、去分化型軟骨肉瘤、透明細(xì)胞型軟骨肉瘤、骨外粘液型軟骨肉瘤等。

或者，本發(fā)明的預(yù)防或治療劑也可以用于確認(rèn)PPARγ的表達(dá)。作為確認(rèn)PPARγ的表達(dá)的腫瘤，可舉出乳癌、大腸癌、肺癌、甲狀腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、白血病、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤等。

PPARγ是屬于核受體超家族的蛋白質(zhì)，通過(guò)形成作為核受體之一的維甲酸X受體(RXR)和異二聚體來(lái)識(shí)別PPAR反應(yīng)區(qū)(PPRE)，活化下游基因的轉(zhuǎn)錄。

本發(fā)明中，作為具有PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)，可舉出非甾體抗炎劑。因此，所謂能夠利用PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性和PPARγ激動(dòng)活性在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中誘導(dǎo)介由PPARγ進(jìn)行的細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑，在一個(gè)實(shí)施方式中就是含有非甾體抗炎劑作為有效成分的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑。在此，所謂非甾體抗炎劑，只要是通過(guò)阻礙環(huán)氧合酶來(lái)阻礙前列腺素和血栓素的合成而發(fā)揮抗炎作用的化合物，就沒(méi)有特別限制，例如，可舉出扎托洛芬、雙氯芬酸、吲哚美辛、奧沙普秦、對(duì)乙酰氨基酚、酮洛芬等，優(yōu)選舉出扎托洛芬、雙氯芬酸、吲哚美辛。另外，除了非甾體抗炎劑以外，例如，還可舉出噻唑烷衍生物。因此，所謂能夠利用PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性和PPARγ激動(dòng)活性在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中誘導(dǎo)介由PPARγ進(jìn)行的細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑，就是含有噻唑烷衍生物作為有效成分的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑。噻唑烷衍生物被已知活化PPARγ，是促進(jìn)脂聯(lián)素基因轉(zhuǎn)錄的PPARγ激動(dòng)劑。作為噻唑烷衍生物，例如，可舉出曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮、巴格列酮、利格列酮等。

本發(fā)明中，含有非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物的具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)的PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性能夠用后述的公知的方法確認(rèn)，例如，通過(guò)用通常的方法從骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中提取mRNA并使用能夠擴(kuò)增PPARγ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的引物而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR的方法；或者通過(guò)將骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤固定或提取細(xì)胞粉碎物并使用針對(duì)PPARγ翻譯產(chǎn)物的抗體而利用了抗原抗體反應(yīng)的方法，能夠確認(rèn)PPARγ的表達(dá)。PPARγ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物是公知的，例如，作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)(GenBank)的登錄號(hào)(accession)No.BC006811中公開(kāi)了堿基序列信息，作為翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH06811中公開(kāi)了氨基酸序列信息。另外，PPARγ激動(dòng)活性例如可以通過(guò)測(cè)定下游基因的表達(dá)水平或脂質(zhì)的表達(dá)水平來(lái)確認(rèn)。作為PPARγ的下游基因，例如，可舉出細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因、動(dòng)脈硬化相關(guān)基因、抗炎相關(guān)基因等。在此，作為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，可以是承擔(dān)細(xì)胞凋亡信號(hào)的基因，也可以是細(xì)胞凋亡的標(biāo)記基因。作為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，例如，可舉出Caspase3(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3)、p53等。作為Caspase3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC016926中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH16926中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為p53的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.NM＿000546中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.NP＿000537中公開(kāi)了氨基酸序列信息。另外，作為脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因，可以是誘發(fā)向脂肪細(xì)胞的分化的基因，也可以是脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)記基因。作為脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因，例如，可舉出Setd8(SET domain containing(lysine methyltransferase)8：含有SET結(jié)構(gòu)域的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶)、Setdb1(SET domain，bifurcated 1：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶)、LPL(Lipoprotein Lipase：脂蛋白脂肪酶)、Leptin(瘦素)、FABP4/aP2(fatty acid-binding protein-4：脂肪酸結(jié)合蛋白-4)、Adiponectin(脂聯(lián)素)、a2Col6(αchain 2of type6collagen：IV型膠原蛋白a2鏈)等。作為Setd8的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.NM＿020382中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.NP＿065115中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為Setdb1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC028671中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH28671中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為L(zhǎng)PL的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC011353中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH11353中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為L(zhǎng)eptin的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC069452中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH69452中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為FABP4/aP2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC003672中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH03672中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為Adiponectin的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC096308中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH96308中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為a2Col6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC002483中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH002483中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為動(dòng)脈硬化相關(guān)基因，例如，可舉出AT1R(angiotensin II receptor I：血管緊張素II的I型受體)等。作為AT1R的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.BC068494中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.AAH68494中公開(kāi)了氨基酸序列信息。作為抗炎相關(guān)基因，例如，可舉出NF-κB(nuclear factorkappa-light-chain-enhancer of activated B cells：核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子)等。作為NF-κB的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.NM＿003998中公開(kāi)了堿基序列信息，另外，作為其翻譯產(chǎn)物，基因庫(kù)的登錄號(hào)No.NP＿003989中公開(kāi)了氨基酸序列信息。另外，作為脂質(zhì)，只要是脂肪細(xì)胞或組織中所含的脂質(zhì)，就沒(méi)有特別限制，可舉出磷脂、糖脂、脂蛋白、中性脂肪、神經(jīng)酰胺等。

具體而言，PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性的測(cè)定可以通過(guò)從細(xì)胞中制備RNA(例如：總RNA、mRNA)組分，檢測(cè)該組分中含有的PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來(lái)實(shí)施。RNA組分的制備可以采用胍-氯化銫超速離心法、AGPC法等公知的方法進(jìn)行，也可以使用市售的RNA提取用試劑盒(例如：RNeasy Mini Kit；QIAGEN制等)，從少量的細(xì)胞迅速且簡(jiǎn)便地制備高純度的總RNA。作為檢測(cè)RNA組分中的該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的手段，例如，可舉出利用雜交(Northern印跡、斑點(diǎn)印跡、DNA芯片解析等)的方法、或者利用PCR(RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR、實(shí)時(shí)PCR等)的方法等。從能夠由微量試樣迅速且簡(jiǎn)便地定量精確地檢測(cè)該基因的表達(dá)變化的角度考慮，優(yōu)選競(jìng)爭(zhēng)PCR、實(shí)時(shí)PCR等定量PCR法。

利用Northern印跡或斑點(diǎn)印跡雜交時(shí)，PPARγ基因的檢測(cè)例如可以使用能夠特異性地檢測(cè)出該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸探針來(lái)進(jìn)行。PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性的測(cè)定中使用的核酸探針是包含約15個(gè)堿基以上、優(yōu)選為約18～約500個(gè)堿基、更優(yōu)選為約18～約200個(gè)堿基、進(jìn)一步優(yōu)選為約18～約50個(gè)堿基的連續(xù)的該基因的一部分或全部的多核苷酸或包含其互補(bǔ)序列的多核苷酸。作為PPARγ基因的一部分或全部，可舉出上述公知的PPARγ的堿基序列的一部分或全部。該多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合體。可優(yōu)選舉出DNA。另外，作為探針使用的多核苷酸可以是雙鏈，也可以是單鏈。在雙鏈的情況下，可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或者DNA:RNA的雜交體。在單鏈的情況下，可以使用反義鏈。

另外，PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性的測(cè)定中使用的核酸探針是PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中含有在嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列的多核苷酸。雜交可以根據(jù)本身公知的方法或者基于該公知方法的方法，例如分子克隆(Molecular Cloning)第2版(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)中記載的方法等進(jìn)行。作為嚴(yán)格條件，例如，可舉出在6×SSC(sodium chloride/sodium citrate：氯化鈉/檸檬酸鈉)中于45℃進(jìn)行雜交反應(yīng)后，在0.2×SSC/0.1％SDS中于65℃進(jìn)行一次以上的清洗等。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)適當(dāng)?shù)刈兏s交溶液的鹽濃度、雜交反應(yīng)的溫度、探針濃度、探針的長(zhǎng)度、錯(cuò)配數(shù)、雜交反應(yīng)的時(shí)間、清洗液的鹽濃度、清洗的溫度等，能夠容易地調(diào)節(jié)成所希望的嚴(yán)格度。

作為能夠檢測(cè)PPARγ基因的表達(dá)的探針而發(fā)揮功能的核酸可以通過(guò)如下方式獲得，即，使用能夠擴(kuò)增該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一部分或全部的后述的引物對(duì)(Primer Set)，以來(lái)自個(gè)體(例如：人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠等，優(yōu)選人)的所有細(xì)胞[例如，肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、系膜細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)、巨核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、乳腺細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞、或者這些細(xì)胞的祖細(xì)胞、干細(xì)胞或癌細(xì)胞等]或者存在這些細(xì)胞的所有組織[例如，腦、腦的各部位(例如，嗅球、杏仁核、大腦基底核、海馬、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓、小腦)、脊髓、腦垂體、胃、胰腺、腎臟、肝臟、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肺、消化道(例如，大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾臟、下頜下腺、外周血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、關(guān)節(jié)、脂肪組織、骨骼肌等]的cDNA或基因組DNA為模板并利用PCR法擴(kuò)增所希望的長(zhǎng)度的核酸，或者從來(lái)自上述細(xì)胞·組織的cDNA或基因組DNA文庫(kù)，利用菌落或菌斑雜交等將上述基因或cDNA克隆，根據(jù)需要使用限制酶等形成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段而獲得。雜交例如可以根據(jù)分子·克隆(Molecular Cloning)第2版(上述)中記載的方法等進(jìn)行?；蛘撸摵怂嵋部梢酝ㄟ^(guò)基于上述PPARγ基因的堿基序列信息，使用市售的DNA/RNA自動(dòng)合成儀等化學(xué)合成該堿基序列和/或其互補(bǔ)鏈序列的一部分或全部來(lái)獲得。另外，也可以通過(guò)在硅、玻璃等固相上直接原位(在芯片上)合成該核酸，制成該核酸被固相化的芯片。

另外，作為能夠擴(kuò)增PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一部分或全部的引物而發(fā)揮功能的核酸，可以通過(guò)基于上述PPARγ基因的堿基序列信息，使用市售的DNA/RNA自動(dòng)合成儀等化學(xué)合成該堿基序列及其互補(bǔ)鏈序列的一部分來(lái)獲得。

為了能夠檢測(cè)·定量靶核酸，優(yōu)選利用標(biāo)記劑標(biāo)記該核酸。作為標(biāo)記劑，例如，可使用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。作為放射性同位素，例如，可使用〔³²P〕、〔³H〕、〔¹⁴C〕等。作為酶，優(yōu)選穩(wěn)定且比活性大的酶，例如，可使用β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等。作為熒光物質(zhì)，例如，可使用熒光胺、異硫氰酸熒光素等。作為發(fā)光物質(zhì)，例如，可使用魯米諾、魯米諾衍生物、熒光素、光澤精等。此外，也可以在探針與標(biāo)記劑的結(jié)合中使用生物素-(鏈霉)抗生物素蛋白。

利用Northern印跡雜交時(shí)，可以將如上所述制備的RNA組分用凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素、尼龍、聚偏氟乙烯等的膜上，在含有如上所述制備的標(biāo)記探針的雜交緩沖液中，使之特異性雜交后，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄒ詭?band)為單位測(cè)定與膜結(jié)合的標(biāo)記量，由此測(cè)定PPARγ基因的表達(dá)量。在斑點(diǎn)印跡的情況下，將點(diǎn)樣有RNA組分的膜同樣地用于雜交反應(yīng)，測(cè)定斑點(diǎn)的標(biāo)記量，由此測(cè)定該基因的表達(dá)量。

利用DNA芯片解析時(shí)，例如，由如上所述制備的RNA組分利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成導(dǎo)入了T7啟動(dòng)子等適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的cDNA，進(jìn)一步使用RNA聚合酶來(lái)合成cRNA(此時(shí)，通過(guò)使用以生物素等標(biāo)記的單核苷酸為基質(zhì)，可得到被標(biāo)記的cRNA)。通過(guò)使該標(biāo)記cRNA與將上述探針固相化的芯片接觸而使之進(jìn)行雜交反應(yīng)，測(cè)定與固相上的各探針結(jié)合的標(biāo)記量，由此能夠測(cè)定PPARγ基因的表達(dá)量。

根據(jù)其它優(yōu)選的實(shí)施方式，作為測(cè)定PPARγ基因的表達(dá)的方法，可使用定量PCR法。作為定量PCR，例如，有競(jìng)爭(zhēng)PCR、實(shí)時(shí)PCR等。

作為在PCR中被用作引物的寡核苷酸組，例如，可舉出能夠特異性檢測(cè)上述PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸引物。一個(gè)優(yōu)選的方式中，作為在本發(fā)明的檢查方法中使用的核酸引物，可舉出具有約15個(gè)堿基以上、優(yōu)選為約15～約50個(gè)堿基、更優(yōu)選為約15～約30個(gè)堿基、進(jìn)一步優(yōu)選為約15～約25個(gè)堿基的連續(xù)的核苷酸序列的長(zhǎng)度且以擴(kuò)增約100bp～數(shù)kbp的DNA片段的方式設(shè)計(jì)的與多核苷酸(正義鏈)序列互補(bǔ)的多核苷酸，以及能夠與具有與上述多核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的多核苷酸(反義鏈)雜交的多核苷酸的寡核苷酸組。

競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR是指將能夠被可擴(kuò)增目的DNA的引物對(duì)擴(kuò)增的已知量的其它模板核酸作為競(jìng)爭(zhēng)子(competitor)并使之在反應(yīng)液中共存而發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)比較擴(kuò)增產(chǎn)物的量，計(jì)算目的DNA的量的方法。因此，利用競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR時(shí)，除使用上述引物對(duì)之外，還使用能夠用該引物組擴(kuò)增且擴(kuò)增后能夠與靶核酸(即，PPARγ基因的堿基序列信息的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)別(例如，擴(kuò)增尺寸不同、限制酶處理片段的電泳圖譜不同等)的已知量的競(jìng)爭(zhēng)子核酸。靶核酸和競(jìng)爭(zhēng)子核酸爭(zhēng)奪引物而競(jìng)爭(zhēng)性地發(fā)生擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的量比反映原模板的量比。競(jìng)爭(zhēng)子核酸可以是DNA，也可以是RNA。在DNA的情況下，利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由如上所述制備的RNA組分合成cDNA后，在上述引物組和競(jìng)爭(zhēng)子共存的條件下進(jìn)行PCR即可，在RNA的情況下，向RNA片段中添加競(jìng)爭(zhēng)子而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再添加上述引物組而實(shí)施PCR即可。在后者的情況下，由于還考慮到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，所以能夠推定原mRNA的絕對(duì)量。

另一方面，實(shí)時(shí)PCR是使用熒光試劑來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增量的方法，需要將熱循環(huán)儀和熒光分光光度計(jì)一體化的裝置。這樣的裝置已市售。根據(jù)所使用的熒光試劑，存在幾種方法，例如，嵌入法、TaqMan^TM探針?lè)?、分子信?biāo)(Molecular Beacon)法等。均是在利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由如上所述制備的RNA組分合成cDNA后，將上述引物組和如下熒光試劑添加到PCR反應(yīng)體系中的方法，所述熒光試劑是SYBR Green I、溴化乙錠等通過(guò)與雙鏈DNA結(jié)合而產(chǎn)生熒光的試劑(嵌入劑)、將能夠作為上述探針使用的核酸(其中，該核酸在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)與靶核酸雜交)的兩端分別用熒光物質(zhì)(例如：FAM、HEX、TET、FITC等)和消光物質(zhì)(例如：TAMRA、DABCYL等)修飾的試劑(TaqMan^TM探針或分子信標(biāo)探針)等熒光試劑(探針)。嵌入劑與被合成的雙鏈DNA結(jié)合并通過(guò)照射激發(fā)光而產(chǎn)生熒光，因此通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度，能夠監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量，由此推定原模板cDNA量。TaqMan^TM探針是將兩端分別用熒光物質(zhì)和消光物質(zhì)修飾而得的能夠在靶核酸的擴(kuò)增區(qū)域雜交的寡核苷酸，退火時(shí)與靶核酸雜交，但是因消光物質(zhì)的存在而不發(fā)出熒光，在延伸反應(yīng)時(shí)利用DNA聚合酶的核酸外切酶活性而被分解，熒光物質(zhì)游離，由此發(fā)出熒光。因此，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度，能夠監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量，由此能夠推測(cè)原模板cDNA量。分子信標(biāo)探針是將兩端分別用熒光物質(zhì)和消光物質(zhì)修飾而得的能夠在靶核酸的擴(kuò)增區(qū)域雜交并且能夠形成發(fā)卡型二級(jí)構(gòu)造的寡核苷酸，形成發(fā)卡構(gòu)造時(shí)因消光物質(zhì)的存在而不發(fā)出熒光，退火時(shí)與靶核酸雜交，熒光物質(zhì)與消光物質(zhì)的距離變寬，由此發(fā)出熒光。因此，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度，能夠監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量，由此能夠推定原模板cDNA量。由于實(shí)時(shí)RT-PCR能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR的擴(kuò)增量，所以不需要電泳，能夠更迅速地解析PPARγ基因的表達(dá)。

或者，細(xì)胞中的PPARγ基因的表達(dá)可以通過(guò)從該細(xì)胞提取蛋白質(zhì)組分，檢測(cè)該組分中含有的該基因的翻譯產(chǎn)物(即，PPARγ)來(lái)實(shí)施。PPARγ的檢測(cè)也可以通過(guò)使用特異性識(shí)別該蛋白質(zhì)的抗體，利用免疫學(xué)測(cè)定法(例如：ELISA、FIA、RIA、免疫印跡法等)進(jìn)行，也可以通過(guò)利用公知的方法測(cè)定該蛋白質(zhì)所具有的活性來(lái)進(jìn)行?；蛘?，該蛋白質(zhì)的檢測(cè)也可以利用MALDI-TOFMS等質(zhì)量分析法進(jìn)行。

特異性識(shí)別PPARγ的抗體可以通過(guò)使用該蛋白質(zhì)所含的多肽、具有其抗原性的部分肽的全部或具有相當(dāng)于表位的部分的部分肽作為免疫原，利用現(xiàn)有的一般制造方法制造。本說(shuō)明書中，抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)等天然型抗體，能夠使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制造的嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體以及它們的結(jié)合性片段，但不限于這些。優(yōu)選抗體是多克隆抗體、單克隆抗體或它們的結(jié)合性片段。結(jié)合性片段是指具有特異性結(jié)合活性的上述抗體的一部分的區(qū)域，具體而言，例如可舉出F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等(Exp.Opin.Ther.Patents，Vol.6，No.5，p.441-456，1996)?？贵w的類型沒(méi)有特別限定，也包含IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等任意具有同型的抗體。優(yōu)選為IgG或IgM，如果考慮到精制的容易性等，則更優(yōu)選IgG。

在將各免疫學(xué)測(cè)定法用于PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性的測(cè)定時(shí)，不需要特別的條件、操作等的設(shè)定。在各方法的通常的條件、操作方法中加入本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常技術(shù)考慮來(lái)構(gòu)建PPARγ的測(cè)定體系即可。關(guān)于這些常規(guī)技術(shù)手段的詳細(xì)內(nèi)容，可以參照總論、專著等。例如，可以參照入江寬編“放射免疫分析”(講談社，昭和49年發(fā)行)、入江寬編“放射免疫分析續(xù)”(講談社，昭和54年發(fā)行)、石川榮治等編“酶免疫測(cè)定法”(醫(yī)學(xué)書院，昭和53年發(fā)行)、石川榮治等編“酶免疫測(cè)定法”(第2版)(醫(yī)學(xué)書院，昭和57年發(fā)行)、石川榮治等編“酶免疫測(cè)定法”(第3版)(醫(yī)學(xué)書院，昭和62年發(fā)行)、“酶學(xué)方法(Methods in ENZYMOLOGY”Vol.70(免疫學(xué)技術(shù)(Immunochemical Techniques)(PartA))、“酶學(xué)方法”Vol.73(免疫學(xué)技術(shù)(PartB))、“酶學(xué)方法”Vol.74(免疫學(xué)技術(shù)(PartC))、“酶學(xué)方法”Vol.84(免疫學(xué)技術(shù)(PartD：特異性免疫(Selected Immunoassays)))、“酶學(xué)方法”Vol.92(免疫學(xué)技術(shù)(PartE：?jiǎn)慰寺】贵w和常規(guī)免疫分析法(Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)))、“酶學(xué)方法”Vol.121(免疫學(xué)技術(shù)(PartI：雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體(Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)))(以上為Academic Press公司發(fā)行)等。

另外，PPARγ激動(dòng)活性的測(cè)定與上述PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性的測(cè)定同樣地可以通過(guò)從細(xì)胞制備RNA組分、蛋白質(zhì)組分或脂質(zhì)組分，檢測(cè)該組分中含有的PPARγ的下游基因(例如，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因、動(dòng)脈硬化相關(guān)基因、抗炎相關(guān)基因等)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物或脂質(zhì)來(lái)實(shí)施。RNA組分、蛋白質(zhì)組分的制備方法及其檢測(cè)方法可以按照上述的PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性的測(cè)定方法。作為脂質(zhì)的制備方法，可以使用公知的方法制備，例如，加入為試樣的數(shù)倍量的氯仿-甲醇混合物等溶劑而從含有脂質(zhì)的試樣中提取的Folch法、加入數(shù)倍量的氯仿-甲醇-水混合物等溶劑來(lái)進(jìn)行提取的Bligh-Dyer法等。另外，作為分離出的脂質(zhì)的檢測(cè)方法，可以采用液相色譜法(LC)，氣相色譜法(GC)，高效液相色譜法(HPLC)等公知的方法檢測(cè)?；蛘撸部梢圆捎弥苯訖z測(cè)脂肪細(xì)胞、組織所含有的脂質(zhì)的方法。能夠在這樣的方法中使用的試劑等已市售，例如，可以使用HCS LipidTOX磷脂癥/脂質(zhì)癥檢測(cè)試劑盒(Invitrogen公司)等。

可適用本發(fā)明的含有具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)、優(yōu)選含有非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物作為有效成分的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防/治療劑的人，例如可舉出臨床診斷患有骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的患者、疑似患者、或者被預(yù)測(cè)將來(lái)發(fā)病的人。另外，以骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤為原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移癌也優(yōu)選適用本發(fā)明的治療劑。作為這樣的轉(zhuǎn)移癌，可舉出肺癌、大腸癌、乳癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽道癌、脾癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腦腫瘤、血液腫瘤等。

本發(fā)明的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑根據(jù)需要可以以包有糖衣的片劑、膠囊劑、酏劑、微膠囊劑等形式經(jīng)口使用，或者以與水或其以外的藥學(xué)上允許的液體的無(wú)菌性溶液、或懸濁液劑等注射劑的形式非經(jīng)口使用。該治療或預(yù)防劑可以通過(guò)與生理學(xué)上被認(rèn)可的載體、矯味劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑等以通常認(rèn)為的制劑實(shí)施所要求的單位用量形態(tài)進(jìn)行混合而形成制劑。這些制劑的有效成分量可考慮后述的給予量而適當(dāng)?shù)剡x擇。

作為能夠在片劑、膠囊劑等中混合的添加劑，例如，使用明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、阿拉伯樹(shù)膠之類的粘合劑，結(jié)晶纖維素之類的賦形劑，玉米淀粉、明膠、海藻酸等之類的膨化劑，硬脂酸鎂之類的潤(rùn)滑劑，蔗糖、乳糖或糖精之類的甜味劑，薄荷、白珠油或櫻桃之類的矯味劑等。在制劑單位形態(tài)為膠囊的情況下，上述類型的材料中可以進(jìn)一步含有油脂之類的液態(tài)載體。用于注射的無(wú)菌組合物可以根據(jù)使注射用水之類的媒介物中的活性物質(zhì)、胡麻油、椰子油等之類的產(chǎn)自天然的植物油等溶解或懸浮等通常的制劑實(shí)施方式設(shè)計(jì)處方。

作為注射用的水性液，例如，可舉出生理鹽水、含葡萄糖或其它輔助藥的等滲液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化鈉等)等，也可以并用適當(dāng)?shù)娜芙廨o助劑，例如，醇(例如，乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非離子型表面活性劑(例如，聚山梨酯80^TM、HCO-50等)等。作為油性液，例如，可舉出芝麻油、大豆油等，可以并用苯甲酸芐酯、苯甲醇等作為溶解輔助劑。另外，可以配合緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖液、乙酸鈉緩沖液等)、舒緩劑(例如，苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白，聚乙二醇等)、保存劑(例如，苯甲醇、苯酚等)、抗氧化劑等。所制備的注射液通常填充到適當(dāng)?shù)陌碴持小?/p>

由此制得的制劑安全且低毒性，因此可以給予給例如哺乳動(dòng)物(例如，人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)。

本發(fā)明的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的治療或預(yù)防劑的給予量因骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的嚴(yán)重度、給予對(duì)象、給予途徑等不同而異，例如，經(jīng)口給予時(shí)，一般對(duì)于成人(體重60kg)而言，一日約0.1mg～約100mg，優(yōu)選為約1.0～約50mg，更優(yōu)選為約1.0～約20mg。非經(jīng)口給予時(shí)，該治療/預(yù)防劑的給予量也因給予對(duì)象、嚴(yán)重度等不同而異，例如，以注射劑的形式給予成人(體重60kg)時(shí)，一日約0.01～約30mg左右，優(yōu)選為約0.1～約20mg左右，更優(yōu)選為約0.1～約10mg左右。給予對(duì)象為人以外的動(dòng)物時(shí)，可以投入換算成體重60kg的量。

另外，至今為止，作為骨巨細(xì)胞瘤的治療方法，利用外科手術(shù)進(jìn)行的患部除去成為主流，通過(guò)切除患部的腫瘤并使用同種骨、自體骨、人工骨填充骨缺失部而進(jìn)行治療。然而，就這種方法而言，腫瘤的復(fù)發(fā)率高，在反復(fù)復(fù)發(fā)的過(guò)程中孕育著轉(zhuǎn)移、惡性轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)性。通過(guò)使在填充骨缺失部時(shí)使用的人工骨含有本發(fā)明的具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)、優(yōu)選含有非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物，可以期待骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防效果。因此，本發(fā)明提供含有具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)、優(yōu)選含有非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物的人工骨。

本發(fā)明的人工骨所含的具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)、優(yōu)選非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物可以使用如上所述的物質(zhì)。

作為本發(fā)明的人工骨所使用的材料，可舉出公知的整形外科用生物體材料，例如，金屬材料、陶瓷材料、高分子材料、蛋白質(zhì)材料或它們的復(fù)合材料。

作為上述金屬材料，例如、可舉出鈦、鈦合金、不銹鋼、鈷-鉻合金等。

作為上述陶瓷材料，例如，可舉出氧化鋁陶瓷、單晶氧化鋁陶瓷、氧化鋯陶瓷等生物惰性陶瓷、生物玻璃(Hench等，Biomed.Master.Symp.，2，117(1972))、羥基磷灰石(青木等，Ceramics，10，469(1975))、磷灰石-硅灰石(AW)-玻璃(Bull.Inst.Chem.Res.KyotoUni.，60，260(1982))、TCP陶瓷(Ca₃(PO₄)₂)等生物活性陶瓷。

作為上述高分子材料，例如，可舉出聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、高密度聚乙烯(HDP)、硅橡膠、特氟龍(Teflon)、聚酯、聚乳酸、PVA水凝膠等。

作為上述蛋白質(zhì)材料，例如，可舉出膠原蛋白、纖維蛋白、甲殼素、殼聚糖等。

將具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)、優(yōu)選非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物與人工骨材料混合或被覆而成的本發(fā)明的人工骨中，具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ激動(dòng)活性的物質(zhì)、優(yōu)選非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物的含量為約1％～約20％，優(yōu)選為約15％～約20％。

如上所述，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)具有PPARγ激動(dòng)活性的特定的化合物在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中誘導(dǎo)PPARγ表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化。因此，本發(fā)明還提供骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑的篩選方法。

本發(fā)明的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑的篩選方法包括以下工序。

(1)在被檢物質(zhì)存在的條件下或不存在的條件下培養(yǎng)來(lái)自骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的細(xì)胞的工序；

(2)在兩個(gè)條件下，分別測(cè)定PPARγ基因的表達(dá)，和

(i)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，或者

(ii)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)或脂質(zhì)的表達(dá)的工序；

(3)與被檢物質(zhì)不存在的條件下進(jìn)行比較，選擇有意地使PPARγ基因的表達(dá)，和

(i)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，或者

(ii)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)或脂質(zhì)的表達(dá)改變的被檢物質(zhì)的工序。

本發(fā)明的篩選方法中使用的來(lái)自骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的細(xì)胞可以是來(lái)自臨床被診斷患有骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的患者的原代培養(yǎng)細(xì)胞，也可以是已經(jīng)被建立細(xì)胞系的細(xì)胞。細(xì)胞的細(xì)胞系建立可以根據(jù)該領(lǐng)域通常實(shí)施的方法、公知文獻(xiàn)來(lái)制備。另外，來(lái)自骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的細(xì)胞可以是包含該細(xì)胞的任意組織(例如，滑膜、關(guān)節(jié)、軟骨等)，就組織、臟器等而言，可以將它們從生物體中分離出來(lái)并培養(yǎng)，或者向生物體本身給予被驗(yàn)物質(zhì)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后分離出這些生物體試樣。

本發(fā)明的篩選方法中，在來(lái)自上述骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的細(xì)胞為培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，在被檢物質(zhì)存在的條件下或不存在的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。

本發(fā)明中，被檢物質(zhì)并沒(méi)非被特別限制，例如，可使用肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動(dòng)物組織提取液等，這些化合物可以是新的化合物，也可以是公知的化合物。其中，優(yōu)選使用具有PPARγ的表達(dá)誘導(dǎo)活性且具有PPARγ的激動(dòng)活性的物質(zhì)。作為這樣的被檢物質(zhì)，可舉出非甾體抗炎劑。作為非甾體抗炎劑，與上述同樣地舉出扎托洛芬、雙氯芬酸、吲哚美辛等。另外，除了非甾體抗炎劑以外，例如，可與上述同樣地舉出噻唑烷衍生物。作為噻唑烷衍生物，例如，舉出羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮、巴格列酮、利格列酮等。

培養(yǎng)只要在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基材上進(jìn)行即可，例如，可舉出燒瓶、組織培養(yǎng)用燒瓶、培養(yǎng)皿(dish)、陪替氏培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)用培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)皿、微型板(microplate)、微孔板(micro well plate)、多級(jí)板(multiplate)、多孔板(multi well plate)、腔室玻片、平皿(schale)、管、托盤、培養(yǎng)袋、滾瓶。

就上述來(lái)自骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的細(xì)胞而言，只要使以單細(xì)胞的形式懸浮的該細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中并播種在上述的細(xì)胞培養(yǎng)基材上即可。培養(yǎng)通常是在5％CO₂/95％空氣、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)到成為匯合為止。

被驗(yàn)物質(zhì)與上述細(xì)胞的接觸在測(cè)定PPARγ基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)時(shí)，可以通過(guò)如下方式來(lái)實(shí)施，即，例如向適合該細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的培養(yǎng)基(例如，含有約5～20％的胎牛血清(FBS)的最少必需量培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基等)和各種緩沖液(例如，HEPES緩沖液、磷酸緩沖液、磷酸緩沖生理鹽水、Tris-HCl緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸緩沖液等)中添加被驗(yàn)物質(zhì)，使其與細(xì)胞接觸一定時(shí)間。被添加的被驗(yàn)物質(zhì)的濃度因化合物的種類(溶解度、毒性等)不同而異，例如，在約1μM～約1000μM、優(yōu)選為約5μM～約500μM、更優(yōu)選為約50μM～約200μM的范圍適當(dāng)?shù)剡x擇。作為接觸時(shí)間，例如，可舉出約1小時(shí)～約48小時(shí)，優(yōu)選為約5小時(shí)～36小時(shí)，更優(yōu)選為約10小時(shí)～24小時(shí)。另外，測(cè)定PPARγ基因和脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因或脂質(zhì)的表達(dá)時(shí)，可以通過(guò)如下方式來(lái)實(shí)施，即，例如向適合該細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化的無(wú)血清培養(yǎng)基(最小必需量培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基等)和各種緩沖液(例如，HEPES緩沖液、磷酸緩沖液、磷酸緩沖生理鹽水、Tris-HCl緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸緩沖液等)中添加被驗(yàn)物質(zhì)，使其與細(xì)胞接觸一定時(shí)間。另外，上述培養(yǎng)基中根據(jù)需要可以適當(dāng)?shù)丶尤胙?例如，約5～20％的胎牛血清(FBS))、脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)輔助劑(例如，異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素等)。此外，作為其它的添加劑，可舉出轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、皮質(zhì)醇、asc、泛酸鈣、生物素等。另外，可以使用公知的市售的脂肪細(xì)胞分化用試劑盒。被添加的被驗(yàn)物質(zhì)的濃度因化合物的種類(溶解度、毒性等)不同而異，例如，在約1μM～約1000μM、優(yōu)選為約5μM～約500μM、更優(yōu)選為約50μM～約200μM的范圍適當(dāng)?shù)剡x擇。作為接觸時(shí)間，例如，可舉出約1小時(shí)～約48小時(shí)，優(yōu)選為約5小時(shí)～36小時(shí)，更優(yōu)選為約10小時(shí)～24小時(shí)。脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)時(shí)，可以在與被檢物質(zhì)的接觸的同時(shí)在脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也可以在與被檢物質(zhì)接觸一定時(shí)間后，在脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

本發(fā)明的篩選方法中，在被檢物質(zhì)存在的條件下或不存在的條件下，分別測(cè)定PPARγ基因的表達(dá)和(i)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)或(ii)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)或脂質(zhì)的表達(dá)。PPARγ基因的表達(dá)可以根據(jù)上述的PPARγ表達(dá)誘導(dǎo)活性的測(cè)定方法測(cè)定。另外，關(guān)于細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因、脂質(zhì)的表達(dá)，也可以根據(jù)上述的PPARγ激動(dòng)活性的測(cè)定方法測(cè)定。

如后述的實(shí)施例所示，在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中沒(méi)有觀察到PPARγ的表達(dá)。另外，通過(guò)具有PPARγ激動(dòng)效果的非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物的給予或接觸，確認(rèn)了PPARγ的誘導(dǎo)表達(dá)。并且，伴隨著該誘導(dǎo)表達(dá)，能夠確認(rèn)Caspase3或脂質(zhì)的表達(dá)。因此，上述篩選中，能夠介由PPARγ在骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化，能夠選拔骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑。

根據(jù)PPARγ基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因、脂質(zhì)的表達(dá)水平的比較結(jié)果，被給予了被檢物質(zhì)的細(xì)胞中的該基因或脂質(zhì)的表達(dá)水平與未給予的細(xì)胞相比相對(duì)較高(或較低)時(shí)，能夠選拔該被檢物質(zhì)作為介由PPARγ進(jìn)行的骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑。例如，只要與被驗(yàn)物質(zhì)不存在的條件下的情況比較在統(tǒng)計(jì)上有意義即可，可以選擇PPARγ基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因、脂質(zhì)的表達(dá)量的量增加(或減少)約20％以上、優(yōu)選為約30％以上、更優(yōu)選為約50％以上的被驗(yàn)物質(zhì)作為骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤的預(yù)防或治療劑。

實(shí)施例

以下，通過(guò)實(shí)施例和參考例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步具體說(shuō)明，但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施例和參考例。

實(shí)施例1骨巨細(xì)胞瘤(GCT)培養(yǎng)細(xì)胞中添加扎托洛芬后的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡的解析

用96孔的培養(yǎng)板培養(yǎng)GCT培養(yǎng)細(xì)胞(case1：右股骨遠(yuǎn)端部骨巨細(xì)胞瘤患者，20～30歲；case2：右股骨遠(yuǎn)端部骨巨細(xì)胞瘤患者，20～30歲)，以各濃度(5、10、50、100、200μM)添加扎托洛芬，24小時(shí)后用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo公司)發(fā)色，3小時(shí)后測(cè)定450nm的吸光度(圖1)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)細(xì)胞增殖是扎托洛芬濃度依賴性地被抑制。

另外，在腔室蓋玻片上培養(yǎng)上述case1的GCT培養(yǎng)細(xì)胞，24小時(shí)后以各濃度(100、200μM)添加扎托洛芬。在8小時(shí)后和24小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定，進(jìn)行了Caspase3的染色和Tunel檢測(cè)，對(duì)于有無(wú)細(xì)胞凋亡進(jìn)行解析。觀察是用Keyence公司的熒光顯微鏡(BZ-9000)進(jìn)行，定量觀察各濃度下的陽(yáng)性圖像(圖2-5)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)Tunel陽(yáng)性率和Caspase3陽(yáng)性率是扎托洛芬濃度和給予小時(shí)依賴性地上升。

實(shí)施例2骨巨細(xì)胞瘤(GCT)培養(yǎng)細(xì)胞中添加扎托洛芬后的PPARγ免疫染色

在腔室蓋玻片上培養(yǎng)上述case1的GCT培養(yǎng)細(xì)胞，24小時(shí)后，以各濃度(10、50、100、200μM)添加扎托洛芬。24小時(shí)后，用4％多聚甲醛固定，進(jìn)行了PPARγ的染色。觀察是用Keyence公司的熒光顯微鏡(BZ-9000)進(jìn)行，定量觀察各濃度下的陽(yáng)性圖像(圖6、7)。其結(jié)果，對(duì)照組中PPARγ的表達(dá)為約15％，但是能夠確認(rèn)PPARγ的表達(dá)是扎托洛芬濃度依賴性地亢進(jìn)。

實(shí)施例3骨巨細(xì)胞瘤(GCT)培養(yǎng)細(xì)胞中添加扎托洛芬后的GCT培養(yǎng)細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化的解析

報(bào)告顯示PPARγ是脂肪細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子。因此，在腔室蓋玻片上培養(yǎng)上述case1的GCT培養(yǎng)細(xì)胞，成為匯合時(shí)，以各濃度(10、50、100μM)添加扎托洛芬。24小時(shí)后進(jìn)一步在脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(STREMPRO Adipogenesis Differentiation Kit：脂肪細(xì)胞分化試劑盒；Invitrogen公司)培養(yǎng)7～14天，用HCS LipidTOX Green neutral lipid stain(Invitrogen公司)解析向脂肪細(xì)胞的分化(圖8、9)。其結(jié)果，對(duì)照組中有少量HCS LipidTOX Green的陽(yáng)性圖像，但是能夠確認(rèn)HCS LipidTOX Green的陽(yáng)性圖像是扎托洛芬濃度依賴性地亢進(jìn)。

實(shí)施例4來(lái)自被給予了扎托洛芬的骨巨細(xì)胞瘤(GCT)患者的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的解析

對(duì)針對(duì)由腫瘤引起的疼痛，將作為扎托洛芬片的Soleton片80(通用名稱：扎托洛芬80mg，NIPPON CHEMIPHAR株式會(huì)社)以3片/日給予約28天后執(zhí)行手術(shù)的30～40歲男性的手術(shù)切除標(biāo)本和作為對(duì)象的未給予扎托洛芬的骨巨細(xì)胞瘤的手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行Caspase3的染色和Tunel檢測(cè)，對(duì)于有無(wú)細(xì)胞凋亡進(jìn)行解析。觀察是用Keyence公司的熒光顯微鏡(BZ-9000)進(jìn)行的(圖10)。其結(jié)果，來(lái)自未給予扎托洛芬的GCT患者的的細(xì)胞中幾乎不能確認(rèn)Tunel陽(yáng)性細(xì)胞和Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞，但是在來(lái)自被給予了扎托洛芬的患者的細(xì)胞中，能夠確認(rèn)Tunel陽(yáng)性細(xì)胞和Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞。

實(shí)施例5來(lái)自被給予了扎托洛芬的骨巨細(xì)胞瘤(GCT)患者的細(xì)胞的PPARγ免疫染色

對(duì)針對(duì)由腫瘤引起的疼痛，將作為扎托洛芬片的Soleton片80(通用名稱：扎托洛芬80mg，NIPPON CHEMIPHAR株式會(huì)社)以3片/日給予約28天后執(zhí)行手術(shù)的30～40歲男性的手術(shù)切除標(biāo)本和作為對(duì)象的未給予扎托洛芬的骨巨細(xì)胞瘤的手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行PPARγ的染色，解析PPARγ的表達(dá)。觀察是用Keyence社的熒光顯微鏡(BZ-9000)進(jìn)行的(圖11)。其結(jié)果，在來(lái)自未給予扎托洛芬的GCT患者的細(xì)胞中幾乎不能確認(rèn)PPARγ表達(dá)細(xì)胞，但是在來(lái)自被給予了扎托洛芬的患者的細(xì)胞中，能夠確認(rèn)PPARγ表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)而確認(rèn)了脂肪分化。

實(shí)施例6骨巨細(xì)胞瘤(GCT)培養(yǎng)細(xì)胞中添加非甾體抗炎劑后的細(xì)胞增殖抑制的解析

用與實(shí)施例1同樣的方法，培養(yǎng)GCT培養(yǎng)細(xì)胞(case1、case2)，以各濃度添加非甾體抗炎劑(對(duì)乙酰氨基酚、吲哚美辛或雙氯芬酸)或曲格列酮來(lái)測(cè)定450nm的吸光度(圖12、13)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)細(xì)胞增殖是非甾體抗炎劑濃度依賴性地被抑制。

實(shí)施例7PPARγsiRNA對(duì)添加非甾體抗炎劑后的骨巨細(xì)胞瘤(GCT)培養(yǎng)細(xì)胞的效果

用96孔的培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞(case1、case2)，僅使PPARγsiRNA、陰性對(duì)照組siRNA和轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Scientific DharmaFECT：Thermo Scientific公司)反應(yīng)48小時(shí)之后，用通常的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)，其后以200μM添加扎托洛芬或以60μM添加曲格列酮，72小時(shí)后用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo公司)發(fā)色，3小時(shí)后測(cè)定450nm的吸光度(圖14、15)。其結(jié)果，PPARγsiRNA添加組中，能夠確認(rèn)扎托洛芬的效果被顯著地抑制。

實(shí)施例8來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤(GCT of tendon sheath)的細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎(彌漫型巨細(xì)胞瘤)的細(xì)胞中添加非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物后的細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡的解析

與實(shí)施例1同樣地培養(yǎng)腱鞘巨細(xì)胞瘤培養(yǎng)細(xì)胞(右膝腱鞘巨細(xì)胞瘤患者，30～40歲)和色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎培養(yǎng)細(xì)胞(左膝色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎患者，30～40歲)，以各濃度添加扎托洛芬或曲格列酮，測(cè)定吸光度(圖16、17)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)細(xì)胞增殖是扎托洛芬或曲格列酮濃度依賴性地被抑制。

另外，與實(shí)施例1同樣地對(duì)腱鞘巨細(xì)胞瘤培養(yǎng)細(xì)胞和色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行Caspase3的染色和Tunel檢測(cè)，解析有無(wú)細(xì)胞凋亡(圖18-25)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)以400μM濃度添加了扎托洛芬或以200μM濃度添加了曲格列酮的細(xì)胞與對(duì)照組相比，Tunel陽(yáng)性率和Caspase3陽(yáng)性率上升。

實(shí)施例9來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤(GCT of tendon sheath)的細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎(彌漫型巨細(xì)胞瘤)的細(xì)胞中添加非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物后的PPARγ免疫染色

與實(shí)施例2同樣地向來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的細(xì)胞中以濃度400μM添加扎托洛芬或以濃度200μM添加曲格列酮，觀察PPARγ陽(yáng)性圖像(圖26-29)。其結(jié)果，在添加了扎托洛芬或曲格列酮的細(xì)胞中能夠確認(rèn)PPARγ的表達(dá)。

實(shí)施例10來(lái)自添加非甾體抗炎劑后的腱鞘巨細(xì)胞瘤(GCT of tendon sheath)的細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎(彌漫型巨細(xì)胞瘤)的細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化的解析

與實(shí)施例3同樣地，報(bào)告顯示PPARγ是脂肪細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子。因此，向來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤的細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的細(xì)胞中以濃度400μM添加扎托洛芬，解析向脂肪細(xì)胞的分化(圖30、31)。其結(jié)果，添加了扎托洛芬的細(xì)胞中能夠確認(rèn)HCS LipidTOX Green的陽(yáng)性圖像與對(duì)照組相比亢進(jìn)。

實(shí)施例11骨巨細(xì)胞瘤(GCT)培養(yǎng)細(xì)胞中添加吡格列酮后的細(xì)胞增殖抑制的解析

用與實(shí)施例1同樣的方法，培養(yǎng)GCT培養(yǎng)細(xì)胞(case1、case2)、來(lái)自腱鞘巨細(xì)胞瘤(GCT of tendon sheath)的細(xì)胞或來(lái)自色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎(彌漫型巨細(xì)胞瘤)的細(xì)胞，以各濃度添加作為噻唑烷衍生物的吡格列酮來(lái)測(cè)定450nm的吸光度(圖32)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)細(xì)胞增殖是吡格列酮濃度依賴性地被抑制。

實(shí)施例12被給予了扎托洛芬的骨巨細(xì)胞瘤(GCT)患者、腱鞘巨細(xì)胞瘤患者或色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎患者的MRI圖像的解析

讓骨巨細(xì)胞瘤患者、腱鞘巨細(xì)胞瘤患者或色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎患者按3片/日(早·中·晚各服用1片)服用Soleton片80(通用名稱：扎托洛芬80mg，NIPPON CHEMIPHAR株式會(huì)社)，每隔數(shù)月用MRI評(píng)價(jià)腫瘤的尺寸。作為代表癥例，在骨巨細(xì)胞瘤的骨盆部復(fù)發(fā)例(34歲，女性：圖33、34)中，在2個(gè)月后(圖35)、4個(gè)月后(圖36)能夠確認(rèn)腫瘤逐漸縮小。另外，在右膝的色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的復(fù)發(fā)例(26歲，女性：圖37、38)中，在3個(gè)月后(圖39、40)能夠確認(rèn)MRI造影效果的減弱，在疼痛·膝關(guān)節(jié)可動(dòng)區(qū)域看到改善。此外，在其它的右膝的色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎的復(fù)發(fā)例(38歲，女性：圖41、42)中在2個(gè)月后(圖43、44)能夠確認(rèn)腫瘤的縮小，看到疼痛改善。

實(shí)施例13來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株(H-EMC-SS)中添加非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物后的細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡的解析

與實(shí)施例1同樣地培養(yǎng)來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株，以各濃度添加曲格列酮、吡格列酮或扎托洛芬，測(cè)定吸光度(圖45)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)細(xì)胞增殖是曲格列酮、吡格列酮或扎托洛芬濃度依賴性地被抑制。

另外，與實(shí)施例1同樣地對(duì)來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株進(jìn)行Caspase3的染色，解析有無(wú)細(xì)胞凋亡(圖46、47)。其結(jié)果，能夠確認(rèn)以濃度200μM添加了扎托洛芬、以濃度100μM添加了曲格列酮或以濃度200μM添加了吡格列酮的細(xì)胞與對(duì)照組相比，Caspase3陽(yáng)性率上升。

實(shí)施例14來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株(H-EMC-SS)中添加非甾體抗炎劑或噻唑烷衍生物后的PPARγ免疫染色

與實(shí)施例2同樣地向來(lái)自軟骨肉瘤的細(xì)胞株中以濃度200μM添加扎托洛芬，以濃度100μM添加曲格列酮或以濃度200μM添加吡格列酮，觀察PPARγ陽(yáng)性圖像(圖48、49)。其結(jié)果，在添加了扎托洛芬、曲格列酮或吡格列酮的細(xì)胞中能夠確認(rèn)PPARγ的表達(dá)。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明的預(yù)防或治療劑針對(duì)骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤患者或可能發(fā)生骨·軟組織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤疾病的人群有效。另外，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)選擇控制PPARγ基因和細(xì)胞凋亡或脂肪細(xì)胞分化的被檢物質(zhì)，能夠?qū)恰ぼ浗M織中產(chǎn)生的巨細(xì)胞性腫瘤或軟骨肉瘤探索新型治療藥。

本申請(qǐng)以在日本申請(qǐng)的特愿2012-070351(申請(qǐng)日：平成24年3月26日)和特愿2012-235784(申請(qǐng)日：平成24年10月25日)為基礎(chǔ)，其內(nèi)容全部包含在本說(shuō)明書中。