本發(fā)明屬于材料化學領域，具體涉及一種應用于光動力治療的卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料的可控制備方法。

背景技術：

近年來，隨著癌癥的病發(fā)率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，其治療手段也日趨多樣化、高效化，從傳統(tǒng)的手術治療、放療和化療轉向了熱療、光療與化療和放療相結合的多模態(tài)結合療法，這樣的轉變大大降低了傳統(tǒng)治療療法中術后易復發(fā)、全身性盲目性手術、局部副作用較大等缺點，其中特別是光動力療法（PDT）由于劑量小、良好的生物相容性、優(yōu)異的癌細胞靶向性和高的殺死癌細胞效率等優(yōu)點受到了越來越多的關注。

光動力療法（PDT）是指有氧分子參與的伴隨生物效應的光敏反應，它是一種光敏劑通過靶向到達癌細胞，吸收一定波長的激光而受到激發(fā)，與組織周圍氧發(fā)生反應生成具有癌細胞殺傷效力的活性氧物種（ROSs），從而達到殺死靶向癌細胞的目標的高效非侵入的臨床研究和治療的療法。

其中，光敏劑（photosensitizer）和入射光是影響光動力療法效率的主要影響因素，而如何選擇高效的光敏劑是影響光療效率最關鍵的因素?；谶策苌锏墓饷魬B(tài)氧產(chǎn)率、低的生物毒性，而備受研究者的青睞，但多數(shù)卟啉及其衍生物為非水溶性的，傳統(tǒng)合成應用中通常需要通過微囊泡、磷脂、聚合物和納米顆粒（如介孔SiO₂納米顆粒等）等不同的載體將光敏劑單體輸送到靶向位點。文獻中常常報道的介孔SiO₂納米顆粒做載體需要合成介孔SiO₂，然后將光敏劑通過物理吸附或化學連接到介質表面或孔道內，從而步驟繁瑣且負載效率非常低。因此，如何既能提高卟啉及其衍生物的水溶性及其生物相容性，又能提高其負載效率依然是卟啉及其衍生物在生物光療中的應用挑戰(zhàn)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種應用于光動力治療的卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料的可控制備方法。

基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種應用于光動力治療的卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料的可控制備方法，包括以下步驟：

1）配制四吡啶基鋅卟啉和鹽酸的混合溶液、MTAB水溶液和正硅酸乙酯甲醇溶液；

2）攪拌下，將四吡啶基鋅卟啉和鹽酸的混合溶液加入至含有NaOH溶液的MTAB水溶液中，使混合后的溶液的pH為4.0~5.3；

3）每間隔10~20分鐘向步驟2）的溶液中滴加正硅酸乙酯甲醇（正硅酸乙酯簡稱TEOS）溶液，3~4 h加完；

4）將步驟3）得到的反應液在室溫下攪拌40-50 h，離心分離，所得沉淀即為卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料。

優(yōu)選地，四吡啶基鋅卟啉和鹽酸的混合溶液中四吡啶基鋅卟啉濃度為0.01-0.015 mol/L、鹽酸濃度為0.1~0.2M；MTAB水溶液的濃度為0.01-0.015 mol/L，正硅酸乙酯甲醇溶液的體積分數(shù)為15%-25%，四吡啶基鋅卟啉和鹽酸的混合溶液、MTAB水溶液、正硅酸乙酯甲醇溶液的體積比為（4.5-5）︰（85-95）︰（2.5-3）。

進一步地，步驟（2）中精確調控溶液的pH分別為4.1、 4.4、4.7和5.3，卟啉和SiO₂共組裝納米復合材料的內部結構出現(xiàn)了連續(xù)過渡性變化，從完全核殼結構，分別經(jīng)過兩個過渡性形貌（核殼型居多、摻雜型居多），最后得到完全摻雜型卟啉/SiO₂結構，實現(xiàn)了尺寸均一、形貌規(guī)整和高產(chǎn)率的復合物納米材料的大規(guī)模制備。

在本發(fā)明中，采用酸堿中和膠束限域的方法制備了卟啉組裝的過程中，引入了二氧化硅的水解過程，通過精確調控溶液的pH值，可以有效的調控卟啉的組裝過程及TEOS的水解過程，引入乳化劑MTAB可以有效的降低卟啉沉出速度，而調節(jié)溶液pH可以調節(jié)TEOS的水解和卟啉組裝速度。在本發(fā)明中，通過精確調控溶液的pH值、正硅酸乙酯的加入量和卟啉溶液的加入量，從而實現(xiàn)卟啉與SiO₂核殼結構、卟啉與SiO₂共組結構的兩種結構的可控制備。在后續(xù)實驗中通過HCl溶液刻蝕掉卟啉證實了這兩種結構的形成。通過在這兩種結構外面修飾葉酸，實現(xiàn)了高的殺死癌細胞的光療效率。

本發(fā)明結合了卟啉溶液組裝和正硅酸乙酯的水解過程，利用乳化劑減緩卟啉沉出速度，精確調控溶液pH從而減緩卟啉去質子化速度和正硅酸乙酯的水解速度，精確調節(jié)溶液中正硅酸乙酯與卟啉的加入比例，進而調控組裝，實現(xiàn)卟啉與SiO₂協(xié)同共組裝復合納米材料的可控制備，從而得到一系列尺寸均一、形貌規(guī)整的共組裝納米復合材料。該方法兼具了以往采用SiO₂作為載體方法的優(yōu)點，同時利用卟啉酸堿中和膠束限域共組裝的優(yōu)點，解決了卟啉負載量和產(chǎn)量的問題，并最終得到形貌可以控制的卟啉與SiO₂協(xié)同共組裝復合納米材料，這種組裝之后的材料在光動力治療中將會有很重要的作用。

本發(fā)明的方法工藝簡單，對設備要求低，成本低廉，是制備卟啉與SiO₂共組裝復合納米材料的好方法。

附圖說明

圖1為實施例1產(chǎn)物的TEM圖；

其中A為實施例1在pH=4.1時的產(chǎn)物的TEM圖；B為實施例1用1 M的HCl溶液浸泡5-10 s后，離心分離，沉淀水洗2遍，得到產(chǎn)物的TEM圖；

圖2為實施例2產(chǎn)物的TEM圖；

A為實施例2在pH=5.3時的產(chǎn)物的TEM圖； B為實施例2用1 M的HCl溶液浸泡5-10 s后，離心分離，沉淀水洗2遍，得到產(chǎn)物的TEM圖；

圖3為實施例3產(chǎn)物的TEM圖；

A、B分別為pH為4.4、4.7時所得材料用1 M的HCl溶液浸泡5-10 s后，離心分離，沉淀水洗2遍，得到產(chǎn)物的TEM圖；

圖4為不同pH下所得材料的紫外可見吸收光譜；

圖5為實施例1和2的產(chǎn)物在空氣下煅燒的熱重分析圖；

圖6為葉酸靶向修飾后的實施例1、2的激光共聚焦顯微鏡圖；

圖7為葉酸靶向修飾后的實施例1、2在660 nm的光照下的光動力效率比較圖。

具體實施方式

以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。

下述實施例中的MTAB化學名為十四烷基三甲基溴化銨，購自Sigma，CAS號：1119-97-7；四吡啶基鋅卟啉的化學全稱：5,10,15,20-四吡啶基鋅卟啉，購自Frontier Scientific, Inc.，CAS號：31183-11-6；1N 氫氧化鈉標準溶液（NaOH 1N），購自Acros，CAS號：1310-73-2；硅酸四乙酯（又稱正硅酸乙酯，TEOS，99%，GC），購自阿拉丁，CAS號：78-10-4；葉酸（FA，>97%）購自阿拉丁，CAS號：59-30-3；

實施例1

一種應用于光動力治療的卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料的可控制備方法，包括以下步驟：

（1）配制四吡啶基鋅卟啉和鹽酸的混合溶液，使混合溶液中四吡啶基鋅卟啉濃度為0.01M，鹽酸濃度為0.2M；

（2）配制0.01 M的MTAB水溶液，

（3）配制體積分數(shù)為20%的正硅酸乙酯甲醇溶液；

（4）攪拌下，取0.5 mL步驟（1）所得溶液快速注入到含有96 μL的1N 氫氧化鈉標準溶液的9.5 mL步驟（2）所得溶液中，此時測得混合后溶液pH=4.1；

（5）每隔15 min向 步驟（4）所得溶液中手動加入步驟（3）所得溶液20μL，持續(xù)時間3.75 h，加入總量為300μL；

（6）步驟（5）完成后，室溫下繼續(xù)攪拌48 h，離心分離，沉淀水洗得到卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料。

如圖1A所示的實例1的TEM圖，顯示為長95 nm、寬55 nm的長方塊；圖1B為將實例1所得的材料用1 M的HCl溶液浸泡5-10 s后，離心分離，沉淀水洗2遍，得到的材料TEM圖顯示為空心長方塊。

實施例2

一種應用于光動力治療的卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料的可控制備方法，與實例1不同之處在于，步驟（4）中加入98 μL的NaOH溶液，最終測得溶液pH=5.3，所得材料如圖2A的TEM圖，顯示為長106 nm、寬53 nm的長方塊；圖2B將實例2所得的材料用1 M的HCl溶液浸泡5-10 s后，離心分離，沉淀水洗2遍，得到的材料TEM圖浸泡前后無明顯變化仍顯示摻雜長方塊。

實施例3

一種應用于光動力治療的卟啉/SiO₂共組裝納米復合材料的可控制備方法，與實例1不同之處在于步驟（4）中97μL和97.5μL調控NaOH溶液的量，最終測得溶液 pH分別為4.4、4.7，并將所得的材料用1 M的HCl溶液浸泡5-10 s后，離心分離，沉淀水洗1遍所得材料。

實施例1、2、3的紫外可見吸收光譜如圖4所示，當pH較低時，在4.1時卟啉/SiO₂復合材料在411nm、452 nm處有峰，而在Q帶吸收570 nm、611 nm 處有吸收，隨著pH值逐漸升高，411nm、452 nm處的峰逐漸藍移并變成425 nm處的單峰，而Q帶也逐漸藍移到565 nm和605 nm處。表明隨著pH值逐漸增加，由4.1增到5.3，卟啉在復合物中的存在形式主要由組裝體向單分子形式過渡，這與實施例1、2在1 M的HCl溶液浸泡5-10 s后，離心分離所得材料為空心和摻雜型一致。由于組裝體很容易溶解于1 M的HCl溶液中，故實例1用1 M的HCl溶液后為空心材料；而實例2卟啉分子與正硅酸乙酯形成復合材料，雖為單分子形式存在，卻不溶于1 M的HCl溶液因而浸泡之后仍為摻雜材料。

實施例1、2在空氣氣氛下，10℃/min的熱重分析圖如圖5所示，在加熱到700℃時，實例1失重62.3wt%，而實例2失重42.27wt%，這是由于卟啉分子被炭燒變成CO₂損失掉，同時也顯示所制備的復合材料具有較高的卟啉含量，從而具有較高的吸光效率。

當對實施例1、2進行靶向葉酸修飾后，分別取100μL濃度分別為2μM、4μM和8μM的葉酸修飾實施例1加入到Hela細胞中培養(yǎng)，同樣實施例2也分別取100μL濃度分別為2μM、4μM和8μM的葉酸修飾實施例2加入到Hela細胞中培養(yǎng)，（具體過程可參考文獻Huang,P.;Xu,C.;Lin,J.; Wang,C.; Wang,X.; Zhang,C.; Zhou,X.; Guo,S.; Cui,D. Theranostics 2011，1:240.）, a、b和c分別是濃度2、4和8μM的葉酸修飾實施例1加入HeLa細胞中的復合場細胞熒光照片。d、e和f分別是濃度2、4和8μM的葉酸修飾實施例2加入HeLa細胞中的復合場細胞熒光照片。所得癌細胞靶向激光共聚焦顯微鏡圖片如圖6所示，表明所合成的復合材料能夠很好地靶向進入HeLa癌細胞，同時具有很好的熒光標記作用。

在660 nm光源照射下，靶向葉酸修飾后的實施例1高于靶向葉酸修飾后的實施例2的殺死Hela癌細胞的效率，無暗毒性，在光療中表現(xiàn)出光照時間、濃度和結構依賴性的光療效率，僅5-8分鐘就能夠殺死80%癌細胞，如圖7所示。