本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥材料制備領(lǐng)域；具體涉及一種由黑磷納米片/抗腫瘤化合物通過簡(jiǎn)單的靜電吸附組裝復(fù)合制得的新型的多功能的抗腫瘤材料、制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黑磷作為一種新型的層狀材料，在過去幾年已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。由于其結(jié)構(gòu)與石墨烯類似可以剝離成單層結(jié)構(gòu)，故而被稱為“磷烯”。與石墨烯不同的是黑磷的納米片厚度可以影響它的能帶隙，大塊黑磷的能帶隙為0.3eV，而單層黑磷的能帶隙增加到2.0eV。此外其吸收帶橫跨紫外和整個(gè)可見光區(qū)域，正是由于這種獨(dú)特的光電性質(zhì)，其已被廣泛應(yīng)用于氣體傳感器，光探測(cè)器以及光電器件。同時(shí)其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域也具有很大的發(fā)展?jié)撃?，例如BP納米片已被用于產(chǎn)生單線態(tài)氧的光動(dòng)力療法(PDT)試劑，此外BP量子點(diǎn)也被研究在808nm激光照射下能產(chǎn)生大量的熱是一種良好的光熱治療(PTT)試劑。

納米材料作為藥物載體傳送抗癌藥物治療癌癥的策略一直是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱門，同時(shí)二維材料載生物醫(yī)藥方面也展現(xiàn)出了很大的潛能。由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，許多關(guān)于二維材料作為納米載體構(gòu)建多功能的納米材料的研究已經(jīng)開展，例如石墨烯、Bi₂Se₃、MoO_x、WS₂以及MoS₂等都被利用來構(gòu)建多功能的納米治療平臺(tái)，同時(shí)也展現(xiàn)了良好的性能。但是，這些多功能納米材料由于過渡金屬的引入以及一些毒性較大物質(zhì)的修飾后表現(xiàn)出生物相容性差，組織毒性以及低的藥物負(fù)載率。另外光熱治療，光動(dòng)力學(xué)治療以及化學(xué)治療相結(jié)合的三療一體的納米復(fù)合材料卻有待開發(fā)，即便是現(xiàn)有的三療一體的納米材料如：將介孔硅，上轉(zhuǎn)換，金納簇和阿霉素等不同功能的材料結(jié)合起來構(gòu)建三療一體的納米材料雖然擁有協(xié)同治療作用，但是其多種材料的雜合性使其制備過程異常復(fù)雜昂貴，過渡金屬的引入使其生物相容性也大打折扣，此外其平庸的負(fù)載率(絕大多數(shù)的納米粒子作為藥物載體，其負(fù)載量都比較低)使得其實(shí)用性也很低。而對(duì)于構(gòu)建良好的載藥體系，簡(jiǎn)單的制備過程，低廉的價(jià)格，好的生物相容性以及高的藥物負(fù)載率都是需要考慮的難點(diǎn)。所以，構(gòu)建新的價(jià)格低廉，合成簡(jiǎn)單，具有良好生物相容性以及高負(fù)載率的多功能納米材料從而實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療是極具挑戰(zhàn)性的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有納米載藥材料負(fù)載率低、功能單一、生物相容差等問題，本發(fā)明提供了一種通過靜電吸附組裝制備黑磷納米片/抗腫瘤化合物的復(fù)合材料，旨在提高藥物負(fù)載率、多功能化，改善材料的生物相容性。

本發(fā)明還包括一種所述的黑磷納米片/抗腫瘤化合物的復(fù)合材料的制備方法。

另外，本發(fā)明還包括采用所制得的黑磷納米片/阿霉素復(fù)合材料在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明人將黑磷納米片和阿霉素采用常規(guī)手段復(fù)合負(fù)載，但一直難于獲得具有良好藥物負(fù)載量及優(yōu)良的協(xié)同抗腫瘤效果的復(fù)合材料；經(jīng)過進(jìn)一步的研究，發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)，對(duì)復(fù)合過程的pH進(jìn)行控制有利于提升阿霉素的負(fù)載量，同時(shí)可協(xié)同促進(jìn)二者抗腫瘤效果，故提供以下技術(shù)方案：

一種黑磷納米片-抗腫瘤化合物的復(fù)合材料，由黑磷納米片、帶伯氨基和/或酚羥基的抗腫瘤化合物在pH為7.2～7.6的條件下復(fù)合得到。

本發(fā)明中，所述的帶伯氨基以及酚羥基的抗腫瘤化合物在所述的pH條件下攪拌使抗腫瘤化合物分子通過靜電吸附堆積在黑磷納米片的表面，可有效解決抗腫瘤化合物負(fù)載率低、復(fù)合材料的各組分的抗腫瘤性能損耗等問題。本發(fā)明所提供的復(fù)合材料的抗腫瘤藥物的負(fù)載率高；生物相容性好；所述的復(fù)合材料可通過多功能協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤效率；此外，所述的復(fù)合材料副作用小，易降解。

本發(fā)明中，復(fù)合過程的pH對(duì)所述的復(fù)合材料的負(fù)載率的提高及協(xié)同抗腫瘤效果的改善至關(guān)重要；低于所述的pH的下限或高于所述的pH的上限，均易導(dǎo)致抗腫瘤化合物的負(fù)載率降低，制得的復(fù)合材料的抗腫瘤活性減弱。例如pH≤6.8時(shí)，所述的抗腫瘤化合物的難于負(fù)載或較少負(fù)載(復(fù)合)至所述的黑磷納米片上，進(jìn)而導(dǎo)致制得的復(fù)合材料的抗腫瘤效果較差。

作為優(yōu)選，所述的pH為7.4。

所述的抗腫瘤化合物為具有與黑磷的PO_x鍵靜電吸附的化學(xué)鍵、官能團(tuán)和/或正電荷中心的抗腫瘤化合物，例如，所述的抗腫瘤化合物具有伯氨基和/或酚羥基。

作為優(yōu)選，所述的抗腫瘤化合物為阿霉素、姜黃素中的至少一種。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的所述的抗腫瘤化合物為阿霉素。

作為優(yōu)選，所述的黑磷納米片的厚度為1～7nm。

在所述的優(yōu)選的黑磷納米片的厚度下，進(jìn)一步優(yōu)選，其直徑為200nm。

作為優(yōu)選，所述的復(fù)合材料中，所述的抗腫瘤化合物的負(fù)載率為不高于900％，優(yōu)選為300％～900％。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的阿霉素的負(fù)載率為900％。

本發(fā)明還提供了一種所述的黑磷納米片-抗腫瘤化合物的復(fù)合材料的制備方法，向包含所述黑磷納米片的分散液中投加所述抗腫瘤化合物的水溶液，在所述的pH氛圍下避光攪拌復(fù)合，隨后再經(jīng)離心分離、洗滌、分散得所述黑磷納米片/抗腫瘤化合物的復(fù)合材料。

所述的方法中，攪拌復(fù)合過程的pH優(yōu)選為7.2～7.6；進(jìn)一步優(yōu)選為7.4。

本發(fā)明方法中，所述的黑磷納米片的制備方法為：將黑磷粉末置于NMP的飽和氫氧化鈉溶液中，冰浴條件下超聲剝離、隨后再經(jīng)離心、洗滌、再水分散得所述的黑磷納米片的分散液；其中，超聲的頻率20～40kHz，超聲功率為150～300W。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，超聲的功率，頻率及時(shí)間也對(duì)黑磷納米片的形貌具有一定的影響。在所述參數(shù)下制得的黑磷納米片，分散均勻，粒徑均一，表面帶有大量的負(fù)電荷，同時(shí)具有優(yōu)良的性質(zhì)，可與許多帶正電的抗腫瘤化合物的復(fù)合。

作為優(yōu)選，在所述的超聲頻率及功率下，超聲處理時(shí)間為6～12h。

本發(fā)明所述的制備方法中，所述的黑磷納米片的厚度優(yōu)選為1～7nm，直徑為200nm。

本發(fā)明方法中，將制得的黑磷納米片和阿霉素分散在所述pH的水溶液中，隨后在避光條件下攪拌復(fù)合(負(fù)載)。所述pH的水溶液優(yōu)選為堿金屬氫氧化物的水溶液，例如包含氫氧化鈉、氫氧化鉀中的至少一種的水溶液。

作為優(yōu)選，所述pH的水溶液為氫氧化鈉的水溶液。

作為優(yōu)選，所述的方法中，所負(fù)載的抗腫瘤化合物為阿霉素、姜黃素中的至少一種。

本發(fā)明中，可通過控制復(fù)合過程中的抗腫瘤化合物的濃度來調(diào)控制得的復(fù)合材料的藥物負(fù)載量；進(jìn)而根據(jù)需要制得不同藥物負(fù)載量的復(fù)合材料。

作為優(yōu)選，復(fù)合過程中，所述的抗腫瘤化合物的濃度為0.125～1.00mg/mL。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述的優(yōu)選濃度范圍內(nèi)，通過增加抗腫瘤化合物的濃度，黑磷納米片上的藥物負(fù)載量也會(huì)隨之增加直至達(dá)到最大的負(fù)載量900％。

在所述的優(yōu)選的抗腫瘤化合物的濃度下能進(jìn)一步提高制得的復(fù)合材料的藥物負(fù)載率；有助于進(jìn)一步降低黑磷的副作用，改善復(fù)合材料的生物適應(yīng)性，進(jìn)而提高協(xié)同抗腫瘤效果。作為優(yōu)選，所述的復(fù)合材料的抗腫瘤化合物的負(fù)載率為300％～900％。

更為優(yōu)選，復(fù)合過程中，所述抗腫瘤化合物的濃度為1.0mg/mL；所制得的復(fù)合材料中，抗腫瘤化合物的負(fù)載率為900％。

在該優(yōu)選的負(fù)載量下，更有利于復(fù)合材料實(shí)現(xiàn)更大的化學(xué)療效，進(jìn)而更有利于制備抗腫瘤性能優(yōu)良的復(fù)合材料。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，黑磷納米片藥物負(fù)載量最大時(shí)，復(fù)合材料有良好的分散性，從而可以提高復(fù)合材料的抗腫瘤性能。

本發(fā)明中，在復(fù)合攪拌過程中，避光和攪拌程度對(duì)制得的復(fù)合材料的性能也具有一定的影響。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)攪拌過程不避光時(shí)，黑磷納米片在日光照射下會(huì)有一部分光降解容易導(dǎo)致黑磷納米片量的減少。當(dāng)攪拌程度過慢時(shí)，不利于抗腫瘤化合物充分吸附在黑磷納米片的表層。這均對(duì)復(fù)合材料的抗腫瘤性能產(chǎn)生影響。

作為優(yōu)選，避光下攪拌復(fù)合時(shí)間為12～24h。

作為優(yōu)選，黑磷阿霉素復(fù)合材料通過攪拌靠靜電吸附組裝而成。

本發(fā)明中，以抗腫瘤化合物為阿霉素為例，所述的黑磷阿霉素復(fù)合材料的制備步驟為：先用堿溶液將純水調(diào)整為pH7.2～7.6，將上述得到的黑磷納米片沉淀分散于所述pH的水溶液中，再投加阿霉素；混合后再在常溫避光條件下劇烈攪拌過夜，隨后高速離心去除游離的阿霉素并收集沉淀，用二次水洗滌多次后分散得負(fù)載阿霉素的黑磷納米片溶液。

本發(fā)明一種優(yōu)選的BP(黑磷)@DOX(阿霉素)的復(fù)合材料的制備方法，其制備方法為：

將通過超聲剝離法制備的BP納米片沉淀分散于pH為7.4的水溶液中得BP納米片水溶液，同時(shí)將不同質(zhì)量的DOX溶于pH為7.4的水溶液中得不同濃度的DOX水溶液。向BP納米片水溶液中加入不同濃度的DOX水溶液，隨后常溫避光劇烈攪拌過夜，高速離心收集沉淀，洗滌三次后超聲分散得DOX負(fù)載量不同的BP-DOX納米復(fù)合物。并通過紫外可見光譜，Zeta電位來表征納米片表征復(fù)合物的形成。

另外，本發(fā)明還提供了一種所述的黑磷納米片-抗腫瘤化合物的復(fù)合材料的在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

采用本發(fā)明提供的所述的抗腫瘤藥物實(shí)現(xiàn)了化學(xué)治療，光動(dòng)力學(xué)治療和光熱治療相結(jié)合的抗腫瘤效果，此外其超高的藥物負(fù)載效率，良好的生物相容性以及易降解性使其在生物醫(yī)藥方面具有很大的應(yīng)用潛能。

采用本發(fā)明所提供的黑磷/阿霉素復(fù)合材料作為抗腫瘤材料殺死癌細(xì)胞的方法為：將一定量的滅菌后的BP-DOX復(fù)合材料分散在培養(yǎng)基中，再與癌細(xì)胞(例如4T1細(xì)胞，Hela細(xì)胞或L929細(xì)胞)共培養(yǎng)12h，讓癌細(xì)胞充分吸收復(fù)合材料。再通過不同光照(808nm激光和660nm紅光)處理相同的時(shí)間(10min)，隨后加入MTT培育4h后，離心除去上清液，加入DMSO溶解形成的甲臜，然后通過酶標(biāo)儀測(cè)試其OD值計(jì)算癌細(xì)胞的存活率。

相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案的特色：

(1)本發(fā)明從原理上和實(shí)踐上提供了一種以黑磷納米片為基底制備黑磷納米片/阿霉素復(fù)合材料用于腫瘤治療的方法。實(shí)現(xiàn)了化學(xué)治療，光動(dòng)力學(xué)治療和光熱治療相結(jié)合的抗腫瘤途徑，大大提高了抗腫瘤效果。

(2)本發(fā)明中，在負(fù)載藥物的過程中通過改變模型藥物的濃度，我們實(shí)現(xiàn)了其超高的藥物負(fù)載效率900％。同時(shí)，良好的生物相容性以及易降解性使其在生物醫(yī)藥方面具有很大的應(yīng)用潛能。

(3)該材料的制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和、成本低，應(yīng)用前景大，可進(jìn)行大規(guī)模的制備。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的步驟1制得的黑磷納米片的TEM圖和AFM圖，其中，(a)部分為BP納米片的TEM圖，標(biāo)尺：0.2μm，(b)部分為BP納米片的AFM圖以及BP納米片的厚度曲線；

圖2為實(shí)施例1步驟2中負(fù)載DOX后復(fù)合材料的紫外和紅外表征，其中，(a)為復(fù)合前后的紫外吸收曲線，(b)為復(fù)合前后的紅外吸收曲線；

圖3為實(shí)施例1步驟2中改變DOX的濃度后(a)BP納米片對(duì)DOX的負(fù)載量和(b)Zeta電位的變化圖；

圖4為實(shí)施例1步驟1制得的BP納米片生物相容性以及其對(duì)細(xì)胞的毒性

其中圖4(a)不同濃度的BP納米片對(duì)紅細(xì)胞的溶血性圖，圖4(b)不同濃度的BP納米片對(duì)癌細(xì)胞的毒性圖。從圖4中可以看出BP納米片即便是200μg/mL對(duì)紅細(xì)胞基本沒有溶血性，對(duì)細(xì)胞也基本沒有毒性，說明BP納米片具有良好的生物相容性且對(duì)細(xì)胞基本無毒；

圖5為癌細(xì)胞通過不同的治療后的細(xì)胞存活率圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，基于本發(fā)明的原理對(duì)本發(fā)明所做出的各種改動(dòng)或修改同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍

實(shí)施例一：

步驟(1)BP納米片的制備：

BP納米片通過液體剝離法剝離黑磷粉末樣品制備。具體的做法是：稱取20mg黑磷粉末分散在50mL飽和NaOH的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，冰浴超聲10h(20～40kHz，150～300W)，得到深棕色懸浮液，低速離心(4000r/min)8min，除去未剝離的大塊黑磷，收集上清液得棕色透明液體即為黑磷納米片。儲(chǔ)存于4℃冰箱，使用前高速(12000r/min)離心10min，得沉淀，超聲分散于所需溶液中。

由圖1可見，步驟1制得的BP納米片為均一的納米片，厚度大約為5.5nm；直徑為200nm。

步驟(2)BP納米片負(fù)載抗腫瘤藥物(阿霉素(DOX))：

先用0.1M的NaOH將純水調(diào)整為pH＝7.4.將上述得到的BP納米片沉淀分散于pH為7.4的水溶液中得濃度為50μg/mL的BP納米片水溶液，同時(shí)將DOX溶于pH為7.4的水中得濃度為2.5mg/mL的DOX水溶液。取3mL BP納米片水溶液(50μg/mL)，并向其中加入2.5mg/mL的DOX水溶液2mL，隨后常溫避光劇烈攪拌12h，高速離心(12000r/min)收集沉淀，洗滌三次后分散得負(fù)載DOX的BP納米片溶液。

改變DOX的濃度，使混合溶液終濃度為125、250、500、1000μg/mL，并通過紫外可見光譜測(cè)定在相應(yīng)濃度下DOX的負(fù)載量，同時(shí)測(cè)定其Zeta電位來表征納米片負(fù)載DOX前后的電位(詳見實(shí)施例三)。

圖2(a)中藍(lán)色線(標(biāo)記為1)，灰色線(標(biāo)記為2)和橘紅色線(標(biāo)記為3)分別是DOX，BP納米片以及BP-DOX的紫外吸收曲線，其中未復(fù)合之前DOX吸收值大約為481nm，復(fù)合后復(fù)合物的吸收變?yōu)?95nm，大約發(fā)生了14nm的紅移，證明DOX已很好的負(fù)載在BP表面形成BP-DOX復(fù)合物。圖2(b)中黑色線(標(biāo)記為1)，藍(lán)色線(標(biāo)記為2)和橘紅色線(標(biāo)記為3)分別為DOX，BP納米片以及BP-DOX的紅外吸收曲線，圖中在1000～2000cm^-1處BP-DOX相較于BP納米片具有更多碎蜂，同時(shí)在3100cm^-1處的峰也更尖銳，證明DOX已很好的負(fù)載在BP表面形成BP-DOX復(fù)合物。

圖3為本實(shí)施例步驟2中改變DOX的濃度后(a)BP納米片對(duì)DOX的負(fù)載量和(b)Zeta電位的變化圖。從圖3中可以看出當(dāng)BP納米片濃度一定時(shí)，隨著DOX濃度從0.125mg/mL，0.250mg/mL，0.500mg/mL逐漸增加到1mg/mL時(shí)，BP納米片對(duì)DOX的負(fù)載量也從350％，550％，650％逐漸增加到最大的負(fù)載量900％，其Zeta電位也由-5mV，-1mV，+1.5mV逐漸變化為+2.5mV。

抗腫瘤效果的測(cè)試：

以4T1細(xì)胞為模型癌細(xì)胞，采用本發(fā)明所提供的黑磷/阿霉素復(fù)合材料作為抗腫瘤材料殺死癌細(xì)胞的方法為：取96孔板，按每孔大約10000個(gè)細(xì)胞的密度種滿96孔的4T1細(xì)胞，每個(gè)孔大約200μL培養(yǎng)基，培育12h。隨后，取5mL200μg/mL(以黑磷質(zhì)量濃度計(jì))的BP-DOX水溶液，離心后去除上層清夜，加入75％酒精，浸泡10min后離心除去上清液，再加入20mL培養(yǎng)基超分散得濃度為50μg/mL(以黑磷質(zhì)量濃度計(jì))的BP-DOX復(fù)合材料溶液，吸走原培養(yǎng)基，加入含有復(fù)合材料的培養(yǎng)基再共培養(yǎng)12h，讓癌細(xì)胞充分吸收復(fù)合材料。再通過不同光照(808nm激光和660nm紅光)處理相同的時(shí)間(10min)，隨后每個(gè)孔20μL加入MTT溶液(5mg/mL)培育4h后，離心除去上清液，每孔加入100μL DMSO以溶解形成的甲臜，然后通過酶標(biāo)儀測(cè)試其OD值計(jì)算癌細(xì)胞的存活率。

圖5為癌細(xì)胞通過不同的治療后的細(xì)胞存活率圖，主要包括空白，純660nm和808nm共處理，DOX，BP，BP-DOX復(fù)合材料以及BP-DOX復(fù)合材料+不同的光照處理(只有660nm光照，只有808nm光照以及660nm和808nm共處理)組，當(dāng)上述材料與小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1細(xì)胞)共培養(yǎng)后，并以不同的治療方法后以MTT法計(jì)算癌細(xì)胞的存活率。圖5中，“+”表示進(jìn)行了相關(guān)的操作或含有所述的物料；“-”表示未進(jìn)行相關(guān)的操作或不含相應(yīng)的物料。由圖5可見，空白(標(biāo)記1)，純660nm和808nm共處理(標(biāo)記2)以及BP(標(biāo)記3)對(duì)細(xì)胞基本沒有毒性存活率接近100％，BP-DOX處理組(實(shí)施例1制得的BP-DOX；標(biāo)記4)以及DOX(標(biāo)記5)細(xì)胞分別有58％和62％的存活率，說明DOX對(duì)癌細(xì)胞有一定的殺傷力。當(dāng)復(fù)合材料與癌細(xì)胞共培養(yǎng)后并用660nm光照(標(biāo)記6)或808nm激光照射時(shí)(標(biāo)記7)細(xì)胞存活率分別為50％和38％，而當(dāng)以660nm光和808nm激光同時(shí)照射的時(shí)候(標(biāo)記8)4T1細(xì)胞的存活率只有4％。說明BP-DOX復(fù)合物在660nm和808nm光照處理后實(shí)現(xiàn)了化學(xué)療法，光動(dòng)力學(xué)療法以及光熱療法相結(jié)合的三療一體的效果，大幅度提高了抗腫瘤的效果。

實(shí)施例二：

步驟(1)BP納米片的制備同實(shí)施例1的步驟1

步驟(2)BP納米片負(fù)載抗癌藥物(姜黃素(CUR))

先用0.1M的NaOH將純水調(diào)整為pH＝7.4.將上述得到的BP納米片沉淀分散于pH為7.4的水溶液中得濃度為50μg/mL的BP納米片水溶液，同時(shí)將CUR溶于pH為7.4的水中得濃度為2.5mg/mL的CUR水溶液。取3mL BP納米片水溶液(50μg/mL)，并向其中加入2.5mg/mL的CUR水溶液2mL，隨后常溫避光劇烈攪拌12h，高速離心(12000r/min)收集沉淀，洗滌三次后分散得負(fù)載CUR的BP納米片溶液。改變CUR的濃度，使混合溶液終濃度為125，250，500，1000μg/mL，并通過紫外可見光譜測(cè)定在相應(yīng)濃度下CUR的負(fù)載量，同時(shí)測(cè)定其Zeta電位來表征納米片負(fù)載CUR前后的電位。

抗腫瘤效果的測(cè)試：

以4T1細(xì)胞為模型癌細(xì)胞，采用本發(fā)明所提供的黑磷/姜黃素復(fù)合材料作為抗腫瘤材料殺死癌細(xì)胞的方法為：取96孔板，按每孔大約10000個(gè)細(xì)胞的密度種滿96孔的4T1細(xì)胞，每個(gè)孔大約200μL培養(yǎng)基，培育12h。隨后，取5mL 200μg/mL(以黑磷質(zhì)量濃度計(jì))的BP-CUR水溶液，離心后去除上層清夜，加入75％酒精，浸泡10min后離心除去上清液，再加入20mL培養(yǎng)基超分散得濃度為50μg/mL(以黑磷質(zhì)量濃度計(jì))的BP-CUR復(fù)合材料溶液，吸走原培養(yǎng)基，加入含有復(fù)合材料的培養(yǎng)基再共培養(yǎng)12h，讓癌細(xì)胞充分吸收復(fù)合材料。再通過不同光照(808nm激光和660nm紅光)處理相同的時(shí)間(10min)，隨后每個(gè)孔20μL加入MTT溶液(5mg/mL)培育4h后，離心除去上清液，每孔加入100μL DMSO以溶解形成的甲臜，然后通過酶標(biāo)儀測(cè)試其OD值計(jì)算癌細(xì)胞的存活率。

實(shí)施例三：

步驟(1)BP納米片的制備同實(shí)施例1的步驟1

步驟(2)BP納米片負(fù)載抗腫瘤藥物(改變阿霉素(DOX)的濃度)：

先用0.1M的NaOH將純水調(diào)整為pH＝7.4.將上述得到的BP納米片沉淀分散于pH為7.4的水溶液中得濃度為50μg/mL的BP納米片水溶液，同時(shí)將DOX溶于pH為7.4的水中得濃度分別為0.625mg/mL，1.25mg/mL，2.5mg/mL的DOX水溶液。取3mL BP納米片水溶液(50μg/mL)，并向其中加入不同濃度的DOX水溶液2mL，隨后常溫避光劇烈攪拌12h，高速離心(12000r/min)收集沉淀，洗滌三次后分散得負(fù)載DOX的BP納米片溶液。并通過紫外可見光譜測(cè)定在相應(yīng)濃度下DOX的負(fù)載量，同時(shí)測(cè)定其Zeta電位來表征納米片負(fù)載DOX前后的電位。相關(guān)DOX濃度的負(fù)載量及Zeta電位如圖3所示。

抗腫瘤效果的測(cè)試：

同實(shí)施例1的抗腫瘤效果的測(cè)試。

實(shí)施例四：

步驟(1)BP納米片的制備同實(shí)施例1的步驟1

步驟(2)BP納米片負(fù)載抗腫瘤藥物(阿霉素(DOX)，改變負(fù)載時(shí)的pH)：

先用0.1M的NaOH將純水調(diào)整為pH＝6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8(純水pH約為6.7).將上述得到的BP納米片沉淀等量分散于pH不同的水溶液中得濃度為50μg/mL的BP納米片水溶液，同時(shí)將DOX溶于pH為上述相對(duì)應(yīng)的水中得濃度為5mg/mL的DOX水溶液。取3mLBP納米片水溶液(50μg/mL)，并向其中加入不同濃度的DOX水溶液2mL，隨后常溫避光劇烈攪拌12h，高速離心(12000r/min)收集沉淀，洗滌三次后分散得負(fù)載DOX的BP納米片溶液。并通過紫外可見光譜測(cè)定在相應(yīng)pH下DOX的負(fù)載量。發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH小于7.2時(shí)DOX的負(fù)載量非常低(pH為6.8，7.0時(shí)DOX負(fù)載量分別為5％及25％(幾乎測(cè)不出來)，可能是弱酸性影響了BP納米片表面的電荷分布，使DOX與BP之間的靜電吸附減弱)。只有當(dāng)pH介于7.2～7.6之間時(shí)負(fù)載量均可達(dá)到100％以上，而當(dāng)pH為7.4時(shí)達(dá)到最優(yōu)，負(fù)載量可以達(dá)到最大的900％。

抗腫瘤效果的測(cè)試：

同實(shí)施例1的抗腫瘤效果的測(cè)試。

對(duì)比例一：

步驟(1)BP納米片的制備同實(shí)施例1的步驟1

先用0.1M的NaOH將純水調(diào)整為pH＝7.4.將上述得到的BP納米片沉淀分散于pH為7.4的水溶液中得濃度為50μg/mL的BP納米片水溶液，同時(shí)將細(xì)胞色素C以及溶菌酶(溶菌酶先溶于微量DMSO溶液中)溶于pH為7.4的水中分別得到濃度為2.5mg/mL的蛋白溶液。分別取3mL BP納米片水溶液(50μg/mL)，并向其中分別加入上述得到得蛋白溶液2mL，隨后常溫避光劇烈攪拌12h，發(fā)現(xiàn)黑磷納米片聚集成肉眼可見的大塊黑色顆粒，說明大分子量的蛋白質(zhì)會(huì)引起黑磷納米片的聚集從而導(dǎo)致其相關(guān)性質(zhì)的損失。