三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小分子熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 三磷酸腺苷（簡稱ATP)是一類高能磷酸化合物。在細胞中它與二磷酸腺苷（簡稱 ADP)的相互轉(zhuǎn)化實現(xiàn)儲能和放能，從而保證細胞各項生命活動的能量供應(yīng);對ATP的檢測有 利于我們了解生命體新陳代謝過程，為與ATP相關(guān)的疾病診斷提供幫助。開發(fā)新型的ATP分 子熒光探針具有非常重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景。
[0003] 熒光探針具有高度靈敏性，優(yōu)良的選擇性，反應(yīng)時間短以及易于操作等優(yōu)點；在 ATP的檢測中，熒光探針是一種有效的檢測方法。方酸菁染料(SQ)作為一種近紅外吸收的染 料，具有優(yōu)越的光學(xué)性能，即它能降低生物體內(nèi)物質(zhì)的自吸收和自發(fā)熒光的干擾，提高檢測 的靈敏度和選擇性，降低對生命體的損傷，肉眼即可觀察顏色的變化，所以近紅外染料在生 活中發(fā)揮著重要的作用。
[0004] 三磷酸腺苷廣泛存在于動植物的細胞中，其直接為生命活動提供能量。目前檢測 ATP的探針多為有機熒光染料，如:喹琳類、熒光素、羅丹明、芳烴類及其衍生物等，但是這些 熒光染料存在著一些不足，如：對樣品激發(fā)光的散射光敏感，這會使探針的檢測靈敏度下 降。此外，在一定范圍內(nèi)，熒光分子在被測分子上標(biāo)記的數(shù)目越多，其熒光強度會下降，這對 ATP檢測是不利的。盡管有很多探針可被用于ATP的檢測，但是一部分探針的靈敏度不高，或 者不能夠區(qū)分與ATP性質(zhì)相似的分子。而近紅外熒光染料是采用近紅外光譜分析的，其本身 具有很強的穿透能力，在檢測樣品時，不需要對樣品進行繁瑣的處理，使用方便快捷，并可 以降低生物體內(nèi)物質(zhì)的自吸收和自發(fā)熒光的干擾，所以近紅外熒光探針具有很好的應(yīng)用前 景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供三磷酸腺苷近紅外熒光探 針的制備方法，能夠?qū)TP快速、靈敏地分析，并克服現(xiàn)有熒光探針的缺點，高效檢測ATP，具 有合成步驟簡單，熒光法分析快捷方便，干擾較小的特點。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0007] 三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制備方法，其步驟為：
[0008] S1、將方酸菁染料溶于有機溶液中，獲得方酸菁有機溶液；
[0009] S2、將N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺溶于有機溶液中，獲得N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺有機溶液；
[0010] S3、將方酸菁有機溶液滴加到N，N-二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺有機溶液中，在室溫 環(huán)境下攪拌2小時，然后去除有機溶液，經(jīng)柱色譜分離提純，獲得三磷酸腺苷近紅外熒光探 針。
[0011] 所述有機溶液包括二氯甲烷溶液，特別包括無水二氯甲烷。
[0012] 所述方酸菁有機溶液的濃度為4.19mM〇
[0013] 所述N，N-二（2-氨乙基）-l，2-乙二胺有機溶液的濃度為24.07mM。
[0014] 所述方酸菁染料與N，N-二(2-氨乙基)-l，2-乙二胺的摩爾比為1:6。
[0015] 所述室溫環(huán)境為18-25°C。
[0016]所述三磷酸腺苷近紅外熒光探針的分子結(jié)構(gòu)式為：
[0018]本發(fā)明的工作原理為：
[0019]將方酸菁染料與N，N_二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺在有機溶劑一一二氯甲烷溶液中 進行反應(yīng)，反應(yīng)生成三磷酸腺苷近紅外熒光探針。
[0020] 本發(fā)明的有益效果為：
[0021] 本發(fā)明可以克服現(xiàn)有熒光探針性能上的不足，能夠高效、靈敏的在緩沖體系中檢 測ATP;探針在與ATP作用后，會不斷使探針的熒光增強，并可極大地減少外界的干擾，達到 理想的效果，這是該近紅外熒光探針優(yōu)勢所在。本發(fā)明具有合成步驟簡單，熒光法分析快捷 方便，干擾較小等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明制備的近紅外熒光探針的緩沖溶液中逐漸加入ATP后的紫外吸收譜 圖。
[0023]圖2是本發(fā)明制備的近紅外熒光探針的緩沖溶液中逐漸加入ATP后的熒光譜圖。
[0024] 圖3是本發(fā)明制備的近紅外熒光探針的熒光強度與ATP之間的線性關(guān)系圖。
[0025] 圖4是本發(fā)明制備的近紅外熒光探針的檢測專一性的實驗圖。
[0026] 圖5是本發(fā)明制備的近紅外熒光探針對不同的核苷磷酸的響應(yīng)圖。圖中，為ATP， ?為ADP，▲為AMP，▼為CTP，婣為GTP，?為TTP，?為UTP。
[0027] 圖6是本發(fā)明制備的近紅外熒光探針與不同的核苷磷酸作用后所呈現(xiàn)的顏色變化 圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0029]參見附圖，本發(fā)明為三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制備方法，其步驟為：
[0030] S1、將方酸菁染料溶于有機溶液中，獲得方酸菁有機溶液；
[0031 ] S2、將N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺溶于有機溶液中，獲得N，N-二（2-氨乙基)- 1，2-乙二胺有機溶液；
[0032] S3、將方酸菁有機溶液滴加到N，N-二(2-氨乙基)-l，2-乙二胺有機溶液中，在室溫 環(huán)境下攪拌2小時，然后去除有機溶液，經(jīng)柱色譜分離提純，獲得三磷酸腺苷近紅外熒光探 針。
[0033]所述有機溶液包括二氯甲烷溶液，特別包括無水二氯甲烷。
[0034]所述方酸菁有機溶液的濃度為4.19mM。
[0035] 所述N，N-二(2-氨乙基)-1，2-乙二胺有機溶液的濃度為24 · 07mM。
[0036]所述方酸菁染料與N，N-二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺的摩爾比為1:6。
[0037] 所述室溫環(huán)境為18_25。(3。
[0038]所述三磷酸腺苷近紅外熒光探針的分子結(jié)構(gòu)式為：
[0042]公式 1
[0043]實施例一:三磷酸腺苷近紅外熒光探針。
[0044]本實施例包括以下步驟：
[0045] S1、將250mg的方酸菁染料溶于IOOmL的無水二氯甲烷中，獲得方酸菁有機溶液；
[0046] S2、將360yL的N，N-二（2-氨乙基)-1，2_乙二胺溶于無水二氯甲烷中，獲得N，N-二 (2-氨乙基)_1，2-乙二胺有機溶液；
[0047] S3、將方酸菁有機溶液滴加到N，N_二(2-氨乙基)_1，2_乙二胺有機溶液中，在室溫 環(huán)境下劇烈攪拌2小時，然后去除無水二氯甲烷，獲得近紅外染料粗品，然后經(jīng)柱色譜分離 提純，獲得藍紫色固體粉末狀的三磷酸腺苷近紅外熒光探針。
[0048]獲得的三磷酸腺苷近紅外熒光探針的分子結(jié)構(gòu)如下所示：
[0050] ATP分子熒光探針結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：
[0051] 1H NMR(DMS0-d6,500MHz)，S(ppm)8.68(s，2H)，7.78(s，2H)，7.72(d，2H，J = 7.5)， 7.46(d,2H ,J = 8.0) ,7.42(dd,4H ,Ji = 7.5 ,J2 = 14.0) ,7.26(t, 2H ,J = 7.5), 7.208(t, 2H J = 9.0),6.88(t,2H,7.5),6.10(s,2H),5.80(s,2H) ,4.26(dd ,4H ,Ji = 7.0 J2 = 14.0), 3.75 (s,4H) ,3.00(t,2H,J = 6.0) ,2.92(t,4H,J = 5.0) ,2.85(t,2H,J = 6.5) ,1.23-1.17(m, 18H).13C NMR(DMS0-d6,125MHz) ,5(ppm)173.36,163.09,160.94,159.62,157.58,156.02, 140.07,128.20,127.91,122.24,I19.66,I13.06,112.56,86.42,85.99,12.83.MS(ESI+) found 1125.66.[M-CF3SO3J+,calcd for 1125.29.
[0052] ATP分子熒光探針性能實驗
[0053] 將已合成好的ATP分子熒光探針配成含有1%的二甲基亞砜(DMSO)緩沖溶液，然后 將緩沖溶液稀釋到檢測所需要的濃度，對探針的性能進行檢測。
[0054] (I)ATP分子熒光探針的緩沖溶液中不斷加入ATP，對該探針的紫外吸收進行分析。
[0055] 參見圖1，圖1所示的為本發(fā)明制備的近紅外熒光探針的緩沖溶液中逐漸加入ATP 后的紫外吸收譜圖；圖中，橫坐標(biāo)為波長（wavelength)，單位為nm;縱坐標(biāo)為吸光度 (absorption)〇
[0056] 將ATP不斷地加入到溶有近紅外熒光探針的緩沖液中，探針的濃度為5微摩爾每 升，如圖所示，隨著ATP的不斷加入，590nm處的聚集體的吸收峰開始逐漸減弱，在710nm處的 聚集體的吸收分開始逐漸的增強，實驗結(jié)果表明，當(dāng)ATP分子與近紅外熒光