本發(fā)明涉及分子生物學
技術領域：
，具體地說，涉及高表達DNMT3b基因治療阿爾茨海默癥。
背景技術：
：阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是最常見的神經退行性疾病之一。其病理變化為病人廣泛性的大腦萎縮，腦溝回增寬，腦室擴大，臨床癥狀主要表現(xiàn)為學習和記憶力下降，認知功能障礙，最終患者癡呆并喪失生活自理能力。流行病學調查顯示，60歲的人群AD患病率為1％，而85歲的人群患病率將達到30％。據估計，我國現(xiàn)有AD患病人數達700多萬，而且隨著我國人口老齡化進程的加快，到21世紀中葉，我國老年人口將增加到4億，AD患者將超過2000萬，嚴重影響患者的生活質量，給社會和家庭帶來沉重的負擔。國際上關于AD的發(fā)病機制和治療方面的研究不少，但沒有一個系統(tǒng)全面的認識，也缺乏針對疾病的有效治療手段。常用的治療策略僅僅局限于對癥治療，盡量減輕患者的臨床癥狀，這類治療手段并不能夠從根本上逆轉AD的發(fā)生和發(fā)展。研究AD的發(fā)病機制、尋找治療AD的有效靶點將為人類健康做出重大貢獻。AD可分為家族遺傳型和散發(fā)型兩類，其中以散發(fā)型居多。AD的神經病理特征是位于神經元外的老年斑(SP)和位于神經元內的神經原纖維纏結(NFTs)以及神經元的丟失。老年斑主要由Aβ(Amyloid-β)異常折疊后聚集形成；神經原纖維纏結主要為異常過度磷酸化的微管相關蛋白Tau成分。Aβ是形成老年斑的主要成分，是由APP依次通過β和γ剪切而生成。APP主要有非淀粉樣途徑和淀粉樣途徑兩種代謝方式。淀粉樣途徑中，APP蛋白通過β分泌酶(β-siteAPPcleavingenzyme,BACE)剪切，形成可溶性的APPN端片斷(sAPPβ)分泌到細胞外；細胞內的C端片斷(C99)通過γ分泌酶復合物進一步剪切，生成Aβ40和Aβ42。γ分泌酶復合物由Presenilin(PS)，Nicastrin(NCT)，APH-1和PEN2組成。AD的病因很復雜，目前認為AD是遺傳因素和環(huán)境危險因素共同作用的結果。DNMT3b基因編碼從頭甲基化酶DNMT3b。目前關于DNMT3b基因和阿爾茨海默癥病程之間的關系還未見報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供DNMT3b基因或蛋白的增效劑的用途。第一方面，本發(fā)明提供了DNMT3b基因或蛋白的增效劑在制備治療阿爾茨海默癥的藥物中的應用。所述的增效劑為激動劑、上調劑或穩(wěn)定劑。所述的增效劑為模擬核酸。第二方面，本發(fā)明提供了DNMT3b基因或蛋白的增效劑在制備藥物中的應用，所述的藥物用于逆轉慢性低氧引起的阿爾茨海默癥。所述的增效劑為激動劑、上調劑或穩(wěn)定劑。所述的增效劑為模擬核酸。第三方面，本發(fā)明提供了DNMT3b基因或蛋白的增效劑在制備藥物中的應用，所述的藥物用于：a)抑制APP的蛋白表達；b)抑制β分泌酶的蛋白表達；c)抑制γ分泌酶的蛋白表達；或d)抑制Aβ的生成。所述的增效劑為激動劑、上調劑或穩(wěn)定劑。所述的增效劑為模擬核酸。如本文所用，所述的“DNMT3b基因或蛋白的增效劑”包括了激動劑、上調劑、穩(wěn)定劑等，只要它們能夠上調DNMT3b基因或蛋白的表達水平，或維持DNMT3b基因或蛋白的穩(wěn)定性，或增加DNMT3b基因或蛋白的有效作用時間等。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是上調DNMT3b基因或蛋白表達的病毒產品。所述的DNMT3b基因或蛋白增效劑是指任何可提高DNMT3b基因或蛋白的活性、提高DNMT3b基因或蛋白的穩(wěn)定性、上調DNMT3b基因或蛋白的表達、增加DNMT3b基因或蛋白有效作用時間的物質，這些物質均可用于本發(fā)明。例如，所述的增效劑是：表達DNMT3b基因或蛋白的質粒/病毒、化學合成的小分子化合物。如本文所用，所述的“模擬核酸”是模擬生物體內源的mRNA，運用載體表達或化學合成的方法合成，能增強內源性mRNA的含量。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明證實通過抑制細胞內DNMTs的表達，可以明顯下調基因組DNA甲基化水平并上調APP蛋白表達及其β和γ剪切；而通過基因操作高表達DNMT3b可以下調APP蛋白表達及其β和γ剪切，并降低細胞內Aβ42/Aβ40比例，減少細胞內Aβ的生成。提示高表達DNMT3b基因可治療阿爾茨海默癥。本發(fā)明為阿爾茨海默癥的預防和治療提供了理論依據。附圖說明圖1.5Aza作用后DNMTs家族在mRNA和蛋白水平表達情況及基因組DNA甲基化水平檢測。(A)實時定量PCR方法檢測5Aza作用后DNMTs家族mRNA的表達水平。(B)斑點印跡技術檢測Aza作用后全基因組DNA甲基化水平。(C)Westernblot方法檢測5Aza作用后DNMTs家族蛋白水平的表達情況。每組實驗重復3次，用One-wayANOVA統(tǒng)計學方法分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。圖2.免疫印跡技術檢測5Aza作用后APP，β和γ分泌酶的表達水平。(A)Westernblot方法檢測5Aza作用后APP，C99和C83的蛋白表達水平。(B)Westernblot方法檢測5Aza作用后BACE1的蛋白表達水平。(B)Westernblot方法檢測5Aza作用后PS1，APH1a，PEN2和NCT的蛋白表達水平。每組實驗重復3次，用Two-wayANOVA統(tǒng)計學方法分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。圖3.C99(+)細胞株中瞬時高表達DNMT3a或者DNMT3b后細胞內蛋白和基因組DNA甲基化變化情況。(A)Westernblot方法檢測穩(wěn)定高表達C99和空載質粒的細胞系中C99蛋白表達水平。每組實驗重復3次，用T-test統(tǒng)計學方法分析。(B)Westernblot方法檢測C99(+)細胞株中瞬時高表達pLVX-DNMT3a-Puro或者pLVX-DNMT3b-Puro質粒后的細胞中DNMT3a或者DNMT3b蛋白表達水平。(C)Dotblot方法檢測C99(+)細胞株中瞬時高表達pLVX-DNMT3a-Puro或者pLVX-DNMT3b-Puro質粒后的細胞中全基因組DNA的甲基化水平。每組實驗重復3次，用Two-wayANOVA統(tǒng)計學方法分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。圖4.高表達DNMT3a或DNMT3b對低氧處理之后細胞內Aβ，APP，C99和C83表達的影響。(A)ELISA技術檢測低氧處理后細胞內可溶性Aβ42/Aβ40的比例變化。(B)Westernblot方法檢測低氧處理后細胞內APP，C99和C83蛋白表達水平的變化情況，以及高表達DNMT3a或者DNMT3b后細胞內APP， C99和C83蛋白表達水平的變化情況。每組實驗重復3次，用Two-wayANOVA統(tǒng)計學方法分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。圖5.高表達DNMT3a或者DNMT3b對低氧處理之后細胞內β和γ分泌酶表達水平的影響。(A)Westernblot方法檢測低氧處理后細胞內BACE1蛋白表達水平的變化情況，以及高表達DNMT3a或者DNMT3b后細胞內BACE1蛋白表達水平的變化情況。(B)Westernblot方法檢測低氧處理后細胞內NCT，APH1a，PS1和PEN2蛋白表達水平的變化情況，以及高表達DNMT3a或者DNMT3b后細胞內PS1，APH1a，PEN2和NCT蛋白表達水平的變化情況。每組實驗重復3次，用Two-wayANOVA統(tǒng)計學方法分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。實施例1一、方法和材料1.主要使用的試劑1.1使用的抗體列表表1.使用的抗體具體信息1.2其他試劑列表表2.其他主要試劑的具體信息1.3主要使用的儀器Bio-Rad普通PCR儀，實時定量PCR儀(ABI7500)，Bio-Rad凝聚成像儀，Bio-RadWestern系統(tǒng)，Sigma低/高速離心機，Sonics超聲細胞破碎儀，Thermo超低溫冰箱，奧林巴斯顯微鏡/熒光顯微鏡，吉爾森移液器，天能水平電泳槽，SANYO三氣培養(yǎng)箱(MCO-5M)。2.細胞培養(yǎng)及低氧處理N2a細胞培養(yǎng)：從液氮中取出N2a細胞凍存管，置于37℃水浴中快速復溫，加入含等體積完全培養(yǎng)基(DMEM，10％FBS，1％青霉素+鏈霉素)的5ml離心管，1200rpm離心5min，棄上清，沉淀重懸于完全培養(yǎng)液，用移液器吹散，以5×104/cm2接種于6cm培養(yǎng)皿。置于5％CO2，37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。復蘇后第二天換液，待細胞長致80-90％豐度后，用0.25％胰酶消化傳代。細胞貼壁長致70-80％豐度時進行后續(xù)實驗處理。DNMT3a基因(序列如SEQIDNO.13所示)用高保真PCR方法從小鼠基因組DNA中擴增獲得。按照NCBI提供的小鼠DNMT3a基因序列設計上下游引物，并在上下游引物的5′端分別引入限制性內切酶EcoR1和BamH1位點。DNMT3a上游引物：5'-CCGGAATTCATGAATGCTGTGGAAGAGAACC-3'(SEQIDNO.1)；下游引物：5'-CGCGGATCCTTACACACAAGCAAAATATTCC-3'(SEQIDNO.2)。PCR反應條件為：10×PCRBuffer5μl、2mMdNTPMixture5μl、5pM上下游引物各1μl、基因組DNA3μl、KOD-plus-Neo1μl，加ddH2O至50μl體系。擴增條件如下：94℃2min；98℃10sec，68℃90sec，共進行30個循環(huán)；最后于68℃延伸10min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、回收后雙酶切，雙酶切后全部體系上樣電泳，膠回收用于連接。pLVX-IRES-Puro空載體(購于Clontech公司，國家USA，貨號：632183)同樣用EcoRI和BamHI雙酶切，膠回收后用于連接。連接后轉入DH5α感受態(tài)細胞中，將菌液涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種到含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中小量搖菌，取1.5ml培養(yǎng)液提取質粒并進行酶切驗證。把酶切正確的重組質粒送上海鉑尚生物有限公司進行測序。DNMT3b基因序列(序列如SEQIDNO.14所示)直接由上海鉑尚生物有限公司合成，并克隆至pLVX-IRES-Puro表達載體中，具體插入到EcoRI和BamHI位點之間。hC99基因序列(序列如SEQIDNO.15所示)從已有載體中克隆得到，克隆至pLVX-IRES-Puro表達載體中，具體插入到XhoI和BamHI位點之間。質粒轉染按Invitrogen公司脂質體轉染Lipofect2000的操作說明進行操作。以4×105細胞每孔的密度接種到35mm的培養(yǎng)皿中。待細胞長到60-80％時換液、轉染。轉染體系含2μgpLVX-hC99-Puro重組質粒、4μLLipfect2000。陰性對照組轉染pLVX-IRES-Puro空質粒。轉染48小時后，細胞培養(yǎng)液中加入1μg/ml的嘌呤霉素進行篩選連續(xù)兩個月之后，以RealtimePCR和Westernblotting檢測C99在高表達單克隆細胞中的表達。pLVX-DNMT3a-Puro和pLVX-DNMT3b-Puro重組質粒的轉染按Lipofect2000的操作說明進行操作，轉染48h以后，更換培養(yǎng)基，進行低氧處理，低氧濃度1％O2，低氧時間為0h，1h或者4h。3.Western免疫印跡分析3.1蛋白樣品的準備處理完成的細胞，用PBS洗一遍之后，加入冰RIPA裂解液，超聲勻漿裂解后，12000rpm，4℃離心30min，取上清，置于-80℃保存。根據Bradford法測定蛋白濃度，步驟如下：完全溶解蛋白標準品(BSA)，取10μl稀釋至100μl，使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品用0.9％NaCl稀釋標準品。將標準品按0，1，2，4，8，12，16，20μl分別加到96孔板中，加標準品稀釋液補足到20μl。加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液補足到20μl。各孔加入200μlG250染色液，室溫放置3-5min。用酶標儀按常規(guī)條件比色，讀取各微孔吸光度，測量波長為570nm。根據標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。調整樣品蛋白含量使上樣時每孔蛋白總量基本一致(每孔20μg)。3.2SDS-PAGE電泳、轉膜及封閉配制8％分離膠、10％分離膠、12％分離膠和5％濃縮膠，配制跑膠緩沖液。取20μg蛋白樣品與上樣緩沖液混和，100℃水浴煮沸10min，離心，上樣。先80V電泳30min，再120V條件下電泳1h左右(以溴酚藍條帶電泳至分離膠底邊緣即可)；大分子蛋白電泳時間大致為2h(蛋白maker40KD條帶至分離膠邊緣)。準備PVDF膜，用甲醇浸泡15s使膜活化，之后與SDS-PAGE電泳膠一起浸泡于轉膜緩沖液中平衡30min。制作轉膜“三明治”，順序依次為：負極面(黑色面)-纖維墊-濾紙-分離膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-正極面(紅色面)。150V快速轉膜30-90min(根據蛋白質分子量大小決定)。結束后小心取出PVDF膜，麗春紅染色1min觀察蛋白轉膜情況。TBST洗后，配制5％脫脂奶粉，室溫封 閉PVDF膜1h。3.3抗體孵育封閉后，將封閉液配制的一抗孵育液加于膜上，4℃孵育過夜。之后洗膜緩沖液TBST洗3×15min，用辣根過氧化酶二抗室溫孵育2h。TBST洗3×10min，加入SuperSignalECL熒光顯示劑，用凝聚成像儀拍攝，曝光時間視熒光強度而定。以ImageJ軟件分析熒光強度。部分液體的配制：跑膠緩沖液：3.0gTris-base，14.4g甘氨酸，1.0gSDS，ddH2O定容到1000ml；轉膜緩沖液：3.0gTris-base，14.4g甘氨酸，200ml甲醇，ddH2O定容到1000ml；TBST緩沖液：100ml10×TBS(24.2gTris,80.0gNaCl,ddH2O定容到1000ml),加入1mlTween-20，ddH2O定容到1000ml；封閉液：TBST配制5％脫脂奶粉或5％BSA。4.Aβ的酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測將腦組織置于RIPA裂解液中超聲勻漿破碎，12000rpm，4℃離心30min，取上清(樣本A)。在沉淀中加入70％甲酸并用超聲處理1min，12000rpm，4℃離心30min，取上清(樣本B)。樣本A用來檢測可溶性Aβ的水平，樣本B用來測量不可溶性Aβ的水平。檢測方法按照Millpore公司AβELISA試劑盒內的說明步驟進行：(1)將標準品和樣品用樣品稀釋液稀釋，制備不同濃度的標準品，冰上保存待用；(2)將檢測抗體工作液分別加入測試孔，每孔50μl，再分別加入標準品或者待測樣品50μl，在搖床上室溫孵育3h；(3)移除孔內液體，用洗脫緩沖液清洗小孔5次，倒置96孔板使孔內液體流干；(4)加入100μl堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗工作液，室溫孵育30min；(5)移除孔內液體，用洗脫緩沖液清洗5次，倒置96孔板使孔內液體流干；(6)加入100μl堿性磷酸酶熒光底物工作液，室溫避光孵育40min；(7)用酶標儀檢測，激發(fā)波設為460nm，發(fā)射波設為560nm；(8)繪制標準曲線，計算樣品中Aβ的濃度。5.基因表達分析5.1RNA的提取N2a細胞經處理后，PBS洗1次，6cm細胞培養(yǎng)皿加入100μlTRIzol試劑，冰上裂解10min，吸取裂解液轉入1.5mlEP管，每管加氯仿(200μl/ml)，搖振，室溫放置5min。4℃，12000g/min，15min離心，小心吸取上層水相，移至另1個EP管。加入異丙醇(100μl/ml)，室溫靜置10min。4℃離心，12000g，15min，棄上清；加入75％乙醇1ml，搖振，洗滌沉淀，4℃離心，10000g，5min，棄上清；再次加入75％乙醇1ml，搖振，洗滌沉淀，4℃離心，10000g，5min，棄上清。EP倒置晾干后，每管加入適量RNase-free的水，取1μl用分光光度計測OD260/280比值，計算RNA純度和濃度，用于逆轉錄。5.2逆轉錄取上述提取的RNA各2μg，進行逆轉錄，加入OligodT1μl，再加入RNase-free的水至終體積為13.5μl，70℃反應15min；之后分別加入5×RT緩沖液4μl，dNTP1μl，RNAin1μl，逆轉錄酶mix1μl，42℃反應60min，95滅活30s，逆轉錄產物置于-80℃保存。將逆轉錄產物稀釋成5倍后進行RealtimePCR實驗。5.3實時定量PCR實時定量PCR所用引物采用Primer5軟件設計(如表3所示)。表3.RealtimePCR所用引物信息q-mDnmt15'CAGGTGGAAGCCCTCTTGTT3'SEQIDNO.3q-mDnmt15'TCCAAGTCACACAACTGGCT3'SEQIDNO.4q-mDnmt25'ATTCCAAACTCGAGGCTCCG3'SEQIDNO.5q-mDnmt25'CTGCTGCTCTCAGCACAGAT3'SEQIDNO.6q-mDnmt3a5'CTGGCCTTATGGGCTGAGAA3'SEQIDNO.7q-mDnmt3a5'CAGGAGAAGCCCCGAAGTTT3'SEQIDNO.8q-mDnmt3b5'GCTGCAGATGCTTCTGTGTG3'SEQIDNO.9q-mDnmt3b5'GGTACAACTTGGGTGGCTCA3'SEQIDNO.10q-mTBPF5'AGAACAATCCAGACTAGCAGCA3'SEQIDNO.11q-mTBPR5'GGGAACTTCACATCACAGCTC3'SEQIDNO.12每個反應體系(20μl)包括：10μlSYBRGreen反應混合液，終濃度為 0.5μM的引物，1μg模板，用蒸餾水補加到終體積為20μl。反應條件為94℃1min，(95℃45sec，60℃45sec，72℃45sec)×循環(huán)40次，溶解曲線從65℃到95℃，每0.5℃讀板1次，持續(xù)5sec。基因表達相對量計算：由PCR反應曲線得到的Ct值(thresholdcyclenumber，閾值循環(huán)數)，采用△△Ct法進行相對定量。實驗結果均為3次獨立重復試驗結果。6.DNA甲基化修飾分析6.1基因組DNA提取(1)樣本收集，小鼠腦組織和N2a細胞樣本的收集方法分別如下：取100mg的小鼠新鮮皮層組織移入冰浴預冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。加入650μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1，溫和研磨至勻漿狀態(tài)。收集650μl研磨好的組織勻漿液移至CollectionTube中。對于N2a細胞的收集方法是：棄盡培養(yǎng)液，用PBS輕緩清洗一遍后，0.25％胰酶消化兩分鐘，加入含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，1200rpm離心5min，收集細胞沉淀。用PBS懸浮清洗一遍后，1200rpm離心5min，收集細胞沉淀。加入650μl的SolutionA后吹打重懸細胞，將細胞懸浮液轉移至CollectionTube中，加入0.9μl的RNaseA1，激烈振蕩30s，然后室溫靜置1分鐘，65℃裂解5分鐘。(2)加入400μl的SolutionB，振蕩混合。(3)加入1ml的4℃預冷的SolutionC溶液，充分混勻后，12,000rpm離心2min。(4)棄去上層有機相，再加入1ml的4℃預冷的SolutionC溶液，充分混勻后，12,000rpm離心2min。(5)棄去上層有機相，然后將水相溶液(無色下層)轉移至置于CollectionTube上的FilterCup中，12,000rpm離心1min。(6)棄FilterCup，在濾液中加入400μl的DBBuffer，混合均勻。(7)將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。將上述操作6混合溶液轉移至SpinColumn中，12,000rpm離心1min，棄濾液。(8)將500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm離心30s，棄濾液。(9)將700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm離心30s，棄濾液。(10)重復操作步驟9。(11)將SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm離心1min。(12)將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入50μl的滅菌蒸餾水，室溫靜置1分鐘。12,000rpm離心1min，洗脫DNA。(13)取1μlDNA用分光光度計測OD260/280比值，計算DNA純度和濃度。6.2斑點印跡雜交根據所測濃度，將基因組DNA稀釋配成100ng/μl。用0.4MNaOH/10mMEDTA99℃變性處理5min。將變性完成的DNA梯度稀釋(100ng/μl,50ng/μl,25ng/μl,12.5ng/μl,2.5ng/μl)并點樣2μl到Hybond-N+尼龍膜上，室溫風干后，用2×SSC液洗5min，紫外光照射變性處理15分鐘。5％脫脂奶粉室溫封閉1h。封閉液配制的一抗(5-mc抗體)，加于膜上，4℃孵育過夜。之后洗膜緩沖液TBST洗3×15min，用辣根過氧化酶二抗室溫孵育2h。TBST洗3×10min，加入SuperSignalECL熒光顯示劑，用凝聚成像儀拍攝，曝光時間視熒光強度而定。7.統(tǒng)計學分析應用GraphPadPrism5.0對實驗數據進行分析，結果采用均數±標準誤表示，兩組數據比較用t-test，多組間比較用One-wayANOVA或者Two-wayANOVA，p<0.05視為有統(tǒng)計學差異。二、實驗結果1.抑制DNMTs可以增加APP，β和γ分泌酶的蛋白表達水平Aβ主要是APP蛋白依次經過β分泌酶和γ分泌酶剪切而生成，其中APP是Aβ代謝的底物來源，BACE1是β分泌酶的主要組分，PS1，APH1a，PEN2和NCT是γ分泌酶的主要組分。我們在細胞模型上抑制DNMTs，觀察其對APP，β和γ分泌酶各個組分的蛋白水平的表達影響。首先，我們在N2a細胞系上觀察了不同濃度5Aza(DNMTs抑制劑，中文名：5-氮雜胞苷，購自Sigma-Aldrich公司，國家USA，貨號A3656-5MG)作用24h之后，DNMTs家族各個成員在mRNA水平的表達變化情況。我們發(fā)現(xiàn)隨著5Aza濃度不斷升高(100μM，200μM和400μM)，DNMTs家族的每個成員DNMT1、DNMT2、DNMT3a以及DNMT3b的mRNA表達水平均逐漸受到抑制(圖1中A)。考慮到400μM濃度的5Aza作用時，相對于200μM濃 度的5Aza作用，N2a細胞已經出現(xiàn)部分死亡，我們在后續(xù)實驗中選擇0μM，100μM和200μM三個濃度進行實驗。我們用斑點印跡技術檢測了不同濃度5Aza作用后，N2a細胞全基因組DNA甲基化的水平，我們發(fā)現(xiàn)隨著5Aza濃度升高，全基因組DNA甲基化的水平逐漸降低(圖1中B)。其次，我們檢測了使用抑制劑5Aza作用之后，DNMTs家族各個成員在蛋白水平的表達變化情況。我們發(fā)現(xiàn)隨著5Aza濃度不斷升高，DNMTs家族的每個成員DNMT1、DNMT2、DNMT3a以及DNMT3b的蛋白表達水平均逐漸受到抑制(圖1中C)。緊接著我們檢測了DNMTs表達受到抑制后，細胞內APP，β和γ分泌酶的各個組分在蛋白水平的表達變化情況，同時我們對5Aza作用N2a細胞進行了低氧處理，觀察細胞內APP，β和γ分泌酶的各個組分在蛋白水平的表達變化情況。我們檢測了細胞內APP以及其經過β和α剪切的產物C99和C83的表達。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度5Aza作用后N2a細胞內APP蛋白水平逐漸升高，且C99/C83比例也逐漸升高(圖2中A)，提示DNMTs受到抑制后促進了APP蛋白的表達及其β剪切。同時我們還檢測了5Aza作用再進行低氧處理后細胞內APP和C99/C83比例的變化情況，我們發(fā)現(xiàn)，低氧處理明顯增加細胞內APP的表達水平，且進一步增加了C99/C83的比例(圖2中A)，提示DNMTs抑制后，低氧仍能促進APP蛋白的表達及其β剪切。我們還檢測了抑制DNMTs后細胞內BACE1的蛋白表達水平。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度5Aza作用后N2a細胞內BACE1蛋白水平逐漸升高(圖2中B)，提示DNMTs表達受到抑制后促進了BACE1蛋白的表達。同時我們還檢測了5Aza作用再進行低氧處理后細胞內BACE1蛋白的變化情況，我們發(fā)現(xiàn)，低氧處理明顯增加了細胞內BACE1的表達水平(圖2中B)，提示DNMTs表達抑制后，低氧仍能促進APP蛋白的β剪切。接著，我們檢測了抑制DNMTs后細胞內γ分泌酶的主要組分PS1，APH1a，PEN2和NCT的蛋白表達水平變化情況。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度5Aza作用后N2a細胞內PS1，APH1a，PEN2和NCT蛋白水平均逐漸升高(圖2中C)，提示DNMTs表達受到抑制后促進了γ分泌酶各個組分的蛋白水平表達。同時我們還檢測了5Aza作用再進行低氧處理后細胞內γ分泌酶各個組分的蛋白水平變化情況，我們發(fā)現(xiàn)，低氧處理明顯增加了細胞內γ分泌酶各個組分的蛋白水平(圖2中C)，提示DNMTs表達抑制后，低氧仍能促進APP蛋白的γ剪切。以上的實驗結果說明，在體外抑制DNMTs可以促進細胞內APP的表達，并促進其β和γ剪切，從而進一步促進Aβ的生成和AD的發(fā)生。2.高表達DNMT3b降低APP，β和γ分泌酶在蛋白水平的表達接下來，我們想通過上調DNMT3b的表達，觀察其對APP以及β和γ分泌酶主要組分的蛋白水平表達的影響，并觀察細胞內Aβ的生成的變化。首先，我們以人源性APPSwe基因為模板，構建了編碼APP碳端99個氨基酸C99片段的基因，并克隆進入pLVX-IRES-Puro質粒。然后以N2a細胞系為模型，構建并篩選了一個穩(wěn)定高表達pLVX-hC99-Puro的細胞系，我們發(fā)現(xiàn)相對于高表達空載的細胞，C99(+)細胞系可穩(wěn)定高表達2.7倍左右的hC99(圖3中A)。然后，我們利用這株穩(wěn)定高表達pLVX-hC99-Puro的細胞系，來研究高表達DNMT3b對APP以及β和γ分泌酶主要組分的蛋白水平表達的影響。同時觀察高表達DNMT3a對APP蛋白以及β和γ分泌酶主要組分的蛋白水平表達的影響。我們發(fā)現(xiàn)在C99(+)細胞系中瞬時轉染高表達pLVX-DNMT3a-Puro或者pLVX-DNMT3b-Puro質粒后，與轉染空載體的細胞相比，分別達到了高表達5.6倍左右的DNMT3a和2.0倍左右的DNMT3b(圖3中B)，這表明轉染進入細胞的載體可以順利表達DNMT3a或者DNMT3b。為了觀察高表達的DNMT3a或者DNMT3b是否能降低細胞全基因組DNA的甲基化水平，我們通過斑點印跡的方法，檢測到高表達的DNMT3a或者DNMT3b可以明顯升高細胞全基因組DNA的甲基化水平(圖3中C)。瞬時轉染pLVX-DNMT3a-Puro或者pLVX-DNMT3b-Puro質粒72h后，更換新鮮培養(yǎng)基之后，我們分別對這三株細胞C99-None，C99-DNMT3a和C99-DNMT3b進行低氧處理，來觀察低氧處理之后細胞內全基因組DNA的甲基化水平是否會發(fā)生改變。我們發(fā)現(xiàn)，低氧可以明顯降低C99-None細胞內全基因組DNA的甲基化水平，且C99-DNMT3a和C99-DNMT3b細胞中出現(xiàn)相似的現(xiàn)象(圖3中C)。那么，高表達DNMT3a或者DNMT3b是否會逆轉低氧模型中APP以及β和γ分泌酶主要組分的蛋白水平表達的變化呢？于是我們分別對C99-None，C99-DNMT3a和C99-DNMT3b這三株細胞進行低氧處理，來觀察高表達DNMT3a或者DNMT3b對細胞內Aβ及其代謝相關的關鍵蛋白的水平表達的影響。首先，我們利用ELISA技術檢測了低氧處理后三株細胞內可溶性Aβ40 和Aβ42的水平，我們發(fā)現(xiàn)低氧處理之后細胞的Aβ42/Aβ40的比例明顯升高，而高表達DNMT3a或者DNMT3b可以明顯降低低氧引起的Aβ42/Aβ40比例的升高(圖4中A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)低氧處理之后C99-None細胞中，APP蛋白的表達水平明顯升高，C99/C83的比例也明顯升高(圖4中B)，而高表達DNMT3a后，APP蛋白的表達水平明顯下降，C99/C83的比例也明顯降低(圖4中B)；高表達DNMT3b后，APP蛋白的表達水平也明顯下降，C99/C83的比例也明顯降低(圖4中B)。這說明，高表達DNMT3a或者DNMT3b能夠逆轉低氧引起的APP蛋白水平增高和C99/C83的比例升高，從而進一步降低Aβ的生成。緊接著，我們通過免疫印跡的方法檢測了各組細胞內β和γ分泌酶主要組分的蛋白表達情況。我們發(fā)現(xiàn)低氧處理之后，細胞內BACE1蛋白水平明顯升高(圖5中A)。發(fā)現(xiàn)高表達DNMT3a或者DNMT3b，低氧引起的BACE1蛋白水平升高被顯著降低(圖5中A)，提示高表達DNMT3a或者DNMT3b可以抑制低氧引起的APP蛋白β剪切增多，從而減少低氧引起的Aβ生成增多。最后，我們通過免疫印跡的方法檢測了各組細胞內γ分泌酶主要組分NCT，APH1a，PS1和PEN2等蛋白表達水平，來探討在細胞中低氧對NCT，APH1a，PS1和PEN2等蛋白水平的影響，并進一步探討高表達DNMT3a或者DNMT3b是否可以影響低氧對于NCT，APH1a，PS1和PEN2等蛋白表達水平。我們發(fā)現(xiàn)低氧處理之后，細胞內NCT，APH1a，PS1和PEN2等的蛋白水平均明顯升高(圖5中B)。同時我們高表達DNMT3a或者DNMT3b，低氧引起的NCT，APH1a，PS1和PEN2等蛋白水平升高被顯著降低(圖5中B)，提示高表達DNMT3a或者DNMT3b可以抑制低氧引起的APP蛋白γ剪切增多，從而減少低氧引起的Aβ生成增多。三、討論目前的研究認為遺傳因素和環(huán)境因素可能相互協(xié)同最終導致AD的發(fā)生和發(fā)展。近年來，作為環(huán)境危險因子的慢性低氧及其與AD發(fā)生的相關性已經成為國內外研究的熱點方向。臨床上很多疾病的共同的病理生理基礎都是慢性低氧，如慢性阻塞性肺疾病，腦血管疾病，心血管疾病，阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等等。慢性低氧可能發(fā)生在個體生命過程中的每個階段，并且反復出現(xiàn)。因此，研究慢性低氧與AD發(fā)生發(fā)展的相關性具有非常重要的意義。大量研究證據說明慢性低氧可能 誘發(fā)和促進AD發(fā)生。很多腦血管病患者以及遭受過中風等腦缺血的患者其AD的發(fā)生率明顯增加。最近的一項臨床前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，存在睡眠呼吸障礙和低氧的老年婦女，發(fā)生認知功能障礙和癡呆的風險顯著增加。在動物模型和細胞模型上關于慢性低氧對AD發(fā)病影響的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結果。在SH-SY5Y細胞上，人們發(fā)現(xiàn)慢性低氧可以增加細胞內α和β剪切酶組分的表達。我們前期在AD轉基因動物模型上的研究發(fā)現(xiàn)，慢性低氧可以明顯增加APPSwe/PS1A246E小鼠腦中老年斑的聚集，并通過增加APP的β和γ剪接來增加Aβ的生成；另外，利用APPSwe/PS1dE9小鼠為研究模型，我們發(fā)現(xiàn)孕期慢性間歇性低氧可以明顯加重子代小鼠學習記憶功能障礙并加重子代小鼠大腦中老年斑和神經纖維纏結的形成等AD典型的病理表現(xiàn)。另一個研究小組同樣研究了慢性低氧對于APPSwe/PS1dE9小鼠發(fā)病的影響，他們同樣發(fā)現(xiàn)了慢性低氧不僅可以明顯加重Tg小鼠學習記憶功能障礙，還加重了Tg小鼠腦內老年斑和神經纖維纏結等病理變化，后續(xù)的機制研究發(fā)現(xiàn)，慢性低氧可能會通過激活m-鈣激活酶進一步激活內質網應激來引起海馬區(qū)神經元的凋亡。在我們的研究中，我們通過抑制細胞內DNMTs的表達，可以明顯下調基因組DNA甲基化水平并上調APP蛋白表達及其β和γ剪切；而通過基因操作高表達DNMT3b可以下調APP蛋白表達及其β和γ剪切，并降低細胞內Aβ42/Aβ40比例，減少細胞內Aβ的生成。提示高表達DNMT3b基因可治療阿爾茨海默癥。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3