本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及RPS15A基因的用途及其相關(guān)藥物，具體涉及針對(duì)RPS15A基因的醫(yī)藥用途及其小干擾RNA(siRNA)分子。
背景技術(shù)：
：核糖體蛋白S15A(RibosomalProteinS15a,RPS15A)位于細(xì)胞質(zhì)中，是40S亞基的一個(gè)組成部分。該蛋白屬于S8P家族核糖體蛋白，是一種高度保守的蛋白，其在早期的翻譯能夠促進(jìn)mRNA/核糖體的相互作用。目前臨床上腫瘤治療常由于病人產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致預(yù)后不良的情況發(fā)生，因此迫切需要了解抗藥性的分子機(jī)制和開發(fā)新的治療策略。有研究表明，核糖體的結(jié)構(gòu)成分RPS15A可能與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)(SertelS,EichhornT,SieberS,etalFactorsdeterminingsensitivityorresistanceoftumorcelllinestowardsartesunate.Chemico-BiologicalInteractions.2010；185(1):42-52.)HersheyJ.W.B.RegulationofproteinsynthesisandtheroleofeIF3incancer.Braz.J.Med.Biol.Res.2010；43(10):920-930.)。核仁，合成核糖體的重要細(xì)胞器，很早就被認(rèn)為與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。一些核糖體蛋白(RPS)突變可能會(huì)增加癌癥發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。P53是重要的抑癌基因，在細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等生物過程中發(fā)揮重要作用，并已成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。MDM2(Mdm2p53bindingproteinhomolog)及MDMX(Mdm4p53bindingproteinhomolog)是p53的主要抑制因子，兩者相互協(xié)同并通過不同的信號(hào)途徑抑制p53的活性。MDM2是p53的E3連接酶，介導(dǎo)p53的泛素化從而降低p53的穩(wěn)定性。MDMX則主要通過與p53的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)結(jié)合，抑制p53對(duì)其下游基因的轉(zhuǎn)錄活性。MDM2與MDMX通過不同機(jī)制協(xié)同對(duì)p53產(chǎn)生抑制作用(V,A,Garcia-EcheverriaC,etal.Comparativestudyofthep53-mdm2andp53-MDMXinterfaces.Oncogene1999Jan；18(1):189-99.)。研究表明，RPS15在Mdm2-p53-MdmX途徑中具有相當(dāng)重要的作用。在Mdm2-p53-MdmX途徑中，一些核糖體蛋白已經(jīng)被證明與MDM2相連接，抑制MDM2E3連接酶的活性，導(dǎo)致p53穩(wěn)定化和細(xì)胞周期停滯，因此，RP-Mdm2的p53的信號(hào)通路用于核糖體合成監(jiān)控，因而是至關(guān)重要 的。研究發(fā)現(xiàn)，RPL37，RPS15和RPS20為RP，并且也可以連接Mdm2并激活p53。每一個(gè)上述的RP異位表達(dá)時(shí)，在p53零表達(dá)的細(xì)胞和含有內(nèi)源性p53基因的細(xì)胞系中，分別可發(fā)現(xiàn)共表達(dá)Flag標(biāo)記的Mdm2、HA標(biāo)記的p53基因以及內(nèi)源性p53。對(duì)于每個(gè)RP，Mdm2的機(jī)制和p53穩(wěn)定化似乎是通過抑制Mdm2的E3泛素連接酶的活性而實(shí)現(xiàn)的。有趣的是，盡管它們各自能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期停滯，這些核糖體蛋白的不同之處在于由它們各自引入到細(xì)胞中調(diào)控p53的靶基因不同。此外，每個(gè)核糖體蛋白可以以不同的方式下調(diào)MDMX的水平。因此，RPS15A參與調(diào)節(jié)Mdm2-p53基因MDMX網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制對(duì)于腫瘤的治療可能具有非常重大的意義(DaftuarL,ZhuY,JacqX,PrivesC.RibosomalproteinsRPL37,RPS15andRPS20regulatetheMdm2-p53-MdmXnetwork.PLoSOne2013；8(7):e68667.)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是用核苷酸組成的短的雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默的技術(shù)。它可高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，導(dǎo)致其降解，從而引起生物體內(nèi)特定基因的沉默，使細(xì)胞表現(xiàn)出某種基因表型的缺失，是近年來新興的一種常用的研究基因功能、尋找疾病治療方法的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。研究表明，長度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平特異性地引起RNAi(TuschlT,ZamorePD,SharpPA,BartelDP.RNAi:double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell2000；101:25-33.)。在目前的腫瘤治療中，腫瘤患者雖經(jīng)化療、放療和綜合治療，但五年生存率仍很低，如能對(duì)腫瘤發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)的基因進(jìn)行干預(yù)，將能為腫瘤的治療開辟新途徑。近年來，RNAi已成為腫瘤基因治療的有效策略。利用RNAi技術(shù)可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、抗凋亡相關(guān)基因等的表達(dá)，從而抑制腫瘤進(jìn)程(Uprichard,SusanL.ThetherapeuticpotentialofRNAinterference.FEBSLetters2005；579:5996-6007.)。因此本領(lǐng)域仍需要進(jìn)一步明確RPS15A蛋白與疾病的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上尋找能夠影響RPS15A蛋白表達(dá)的藥物，從而達(dá)到治療疾病的目的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)和反復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)下調(diào)RPS15A基因表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而達(dá)到治療腫瘤的目的；并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了可以高效抑制RPS15A基因表達(dá)的靶序列、核酸分子等相關(guān)藥物，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明第一方面涉及特異性抑制RPS15A基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制RPS15A蛋白的表達(dá)或活性的分子在制備預(yù)防和/或治療腫瘤、抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的分子包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述核酸分子包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、小干擾RNA(siRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述siRNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述shRNA包含正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤選自肝癌、食管癌。本發(fā)明第二方面涉及分離的抑制RPS15A基因表達(dá)的siRNA的靶序列，其包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明第三方面涉及抑制RPS15A基因表達(dá)的siRNA分子，其包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明第四方面涉及抑制RPS15A基因表達(dá)的shRNA分子，其包含正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述shRNA分子包含SEQIDNO：9所示的序列。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，其包含本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體為慢病毒載體。在本發(fā)明中，所述慢病毒載體的種類為本領(lǐng)域所公知，例如選自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。本發(fā)明還涉及細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子或本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及慢病毒，其包含本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子，或者其由含有上述核酸分子的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其含有本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞或本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還涉及本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的靶序列用于篩選針對(duì)RPS15A基因、影響RPS15A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性的藥物或試劑中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的靶序列在篩選用于預(yù)防和/或治療與RPS15A基因的表達(dá)或RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述與RPS15A基因的表達(dá)或RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病為腫瘤，例如為肝癌、食管癌。本發(fā)明還涉及本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞、本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒或本發(fā)明任一項(xiàng)的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療與RPS15A基因的表達(dá)、RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療與RPS15A基因的表達(dá)、RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給予有需要的受試者有效量的本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞、本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒或本發(fā)明任一項(xiàng)的藥物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述與RPS15A基因的表達(dá)、RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病為腫瘤，例如為肝癌、食管癌。本發(fā)明還涉及分離的RPS15A基因或該基因的一部分在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述該基因的一部分含有本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的靶序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的腫瘤選自肝癌、食管癌。本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療腫瘤、抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，所述方法包括給予有需要的受試者或腫瘤細(xì)胞有效量的特異性抑制RPS15A基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制RPS15A蛋白的表達(dá)或活性的分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的分子包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述核酸分子包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、小干擾RNA(siRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤選自肝癌、食管癌。本發(fā)明還涉及用于降低腫瘤細(xì)胞中的RPS15A基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括：存在于容器中的本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞、本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒或本發(fā)明任一項(xiàng)的藥物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤選自肝癌、食管癌。以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。本發(fā)明首先提供了特異性抑制RPS15A基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制RPS15A蛋白的表達(dá)或活性的分子在制備預(yù)防和/或治療腫瘤、抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療腫瘤、抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，所述方法包括給予有需要的受試者或腫瘤細(xì)胞有效量的特異性抑制RPS15A基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制RPS15A蛋白的表達(dá)或活性的分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤選自其生長與RPS15A蛋白的表達(dá)或活性相關(guān)的腫瘤，例如選自肝癌、食管癌。所述抑制或降低腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量為足夠降低RPS15A基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低RPS15A蛋白的表達(dá)或活性的劑量。進(jìn)一步的，所述RPS15A基因的表達(dá)至少被降低90％以上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的分子包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述核酸分子包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、小干擾RNA(siRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。所述反義寡核苷酸、雙鏈RNA、siRNA或者shRNA含有RPS15A基因的啟動(dòng)子序列或RPS15A基因的信息序列。優(yōu)選地，所述小干擾RNA(siRNA)包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈 和第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。優(yōu)選地，所述短發(fā)夾RNA(shRNA)包含正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明第二方面涉及分離的抑制RPS15A基因表達(dá)的siRNA的靶序列，其包含選自如下(1)-(3)所示的序列中的一種：(1)SEQIDNO：1所示的序列；(2)與SEQIDNO：1所示的序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列；(3)與(1)或(2)所述序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明中，所述RPS15A基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默RPS15A基因表達(dá)時(shí)，被所述siRNA識(shí)別并沉默的mRNA片段所對(duì)應(yīng)的RPS15A基因中的片段。優(yōu)選地，所述靶序列為RPS15A基因的mRNA片段中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，例如為19-23個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，例如為19、20或21個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述RPS15A基因中的靶序列含有SEQIDNO:1所示的序列。進(jìn)一步地，所述RPS15A基因來源于人。本發(fā)明第三方面涉及針對(duì)上述靶序列設(shè)計(jì)的抑制RPS15A基因表達(dá)的siRNA分子。所述siRNA分子包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與RPS15A基因中的靶序列相同，或者為與該靶序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列。所述siRNA分子第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個(gè)核苷酸；優(yōu)選地，長度均為19-23個(gè)核苷 酸；更優(yōu)選地，長度均為19、20或者21個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述siRNA分子第一鏈的序列如SEQIDNO：14所示，具體為5’-GUGCAACUCAAAGACCUGGAA-3’。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，以SEQIDNO:1所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計(jì)針對(duì)人RPS15A基因的小干擾RNA的一條鏈，另一條鏈即第二鏈的序列與第一鏈序列互補(bǔ)，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源RPS15A基因表達(dá)的作用。本發(fā)明第四方面涉及抑制RPS15A基因表達(dá)的shRNA分子，其包含正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與RPS15A基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列相同，或者能夠與該序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交。所述shRNA經(jīng)加工后可成為小干擾RNA(siRNA)進(jìn)而起到特異性沉默細(xì)胞中內(nèi)源RPS15A基因表達(dá)的作用。優(yōu)選地，所述正義鏈片段與RPS15A基因中19-23個(gè)連續(xù)的核苷酸序列相同；更優(yōu)選地，所述正義鏈片段與RPS15A基因中19、20或者21個(gè)連續(xù)的核苷酸序列相同；或者與上述序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交。進(jìn)一步地，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一種序列：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述shRNA的序列如SEQIDNO:9所示，具體為：5’-GTGCAACTCAAAGACCTGGAATTCAAGAGATTCCAGGTCTTTGAGTTGCAC-3’。shRNA經(jīng)酶切加工后可成為siRNA，進(jìn)而起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性人RPS15A基因表達(dá)的作用。編碼本發(fā)明所述shRNA片段的核酸構(gòu)建體(例如慢病毒載體)含有SEQIDNO:9所示的序列及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，其包含本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體為慢病毒載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其含有本發(fā)明任一項(xiàng)所述的shRNA的片 段，能表達(dá)所述shRNA。所述核酸構(gòu)建體可以通過將編碼前述shRNA的片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)一步地，所述核酸構(gòu)建體為慢病毒載體。所述慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄出本發(fā)明所述shRNA，通過酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用于特異性沉默RPS15A基因的表達(dá)。進(jìn)一步地，所述慢病毒載體還含有啟動(dòng)子序列和/或編碼細(xì)胞中可被檢測(cè)的標(biāo)記物的核苷酸序列；所述可被檢測(cè)的標(biāo)記物例如為綠色熒光蛋白(GFP)。在本發(fā)明中，所述慢病毒載體的種類為本領(lǐng)域所公知，例如選自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人RPS15A基因干擾慢病毒載體，命名為pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA。本發(fā)明的RPS15A基因siRNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步地可以用作治療腫瘤的藥物或制劑。所述的慢病毒載體則可用于制備所述RPS15A基因的siRNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時(shí)，是將安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳動(dòng)物。具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明還涉及細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子或本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及慢病毒，其包含本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸 分子，或者其由含有上述核酸分子的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生針對(duì)RPS15A基因的小分子干擾RNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。該慢病毒可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其含有本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞或本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在制備這些藥物組合物時(shí)，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括:濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。該藥物組合物的應(yīng)用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預(yù)防或治療對(duì)象體內(nèi)腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對(duì)象中。進(jìn)一步的，所述腫瘤選自肝癌、食管癌。所述藥物組合物用于預(yù)防或治療對(duì)象體內(nèi)腫瘤時(shí)，需要將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對(duì)象中。采用該方法，所述腫瘤的生長、增殖、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移被抑制。進(jìn)一步的，所述腫瘤的生長、增殖、復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。所述方法的對(duì)象可以為人。本發(fā)明從眾多的RPS15A基因片段上篩選到了能夠通過基因沉默來降低RPS15A基因表達(dá)或RPS15A蛋白活性的靶序列，可以利用該靶序列為靶標(biāo)篩選影響該基因表達(dá)和該蛋白活性的分子，進(jìn)而用于預(yù)防或治療與該基因相關(guān)的疾病例如腫瘤。因此本發(fā)明還涉及本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的靶序列用于篩選針對(duì)RPS15A基因、影響RPS15A基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)或活性的藥物或試劑中的用途，以及在篩選用于預(yù)防和/或治療與RPS15A基因的表達(dá)或RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病的藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述與RPS15A基因的表達(dá)或RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病為腫瘤，例如為肝癌、食管癌。本發(fā)明還涉及本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞、本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒或本發(fā)明任一項(xiàng)的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療與RPS15A基因的表達(dá)、RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療與RPS15A基因的表達(dá)、RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給予有需要的受試者有效量的本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞、本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒或本發(fā)明任一項(xiàng)的藥物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述與RPS15A基因的表達(dá)、RPS15A蛋白活性相關(guān)的疾病為腫瘤，例如為肝癌、食管癌。本發(fā)明還涉及分離的RPS15A基因或該基因的一部分在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述該基因的一部分含有本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的靶序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的腫瘤選自其生長與RPS15A蛋白的表達(dá)或活性相關(guān)的腫瘤，例如肝癌、食管癌。所述將分離的RPS15A基因或該基因的一部分用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容：其一，將RPS15A基因或該基因的一部分作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將RPS15A基因或該基因的一部分作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。所述將RPS15A基因或該基因的一部分作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑具體是指：將RPS15A基因或該基因的一部分作為RNA干擾作用的靶標(biāo)，來研制針對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑，從而能降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)RPS15A基因的表達(dá)水平。所述將RPS15A基因或該基因的一部分作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指：將RPS15A基因或該基因的一部分作為作用對(duì)象，對(duì)藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人RPS15A基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的 RPS15A基因小分子干擾RNA(siRNA)即是以人RPS15A基因?yàn)樽饔脤?duì)象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將RPS15A基因及其蛋白作為作用對(duì)象。所述將RPS15A基因或該基因的一部分用于制備腫瘤診斷藥物，是指將RPS15A基因或該基因的一部分的表達(dá)產(chǎn)物作為一項(xiàng)腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制RPS15A基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制RPS15A蛋白的表達(dá)或活性的分子，從而降低腫瘤細(xì)胞中RPS15A基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。所述通過分離的RPS15A基因制備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學(xué)藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。所述核酸包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNA(siRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人RPS15A基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低人RPS15A蛋白的表達(dá)或活性的劑量。以使人RPS15A基因的表達(dá)至少被降低90％以上。采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人RPS15A基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的。具體的，治療時(shí)，將能有效降低人RPS15A基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。本發(fā)明還涉及用于降低腫瘤細(xì)胞中的RPS15A基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包括：存在于容器中的本發(fā)明第二、三、四方面任一項(xiàng)的核酸分子、本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、本發(fā)明任一項(xiàng)的細(xì)胞、本發(fā)明任一項(xiàng)的慢病毒或本發(fā)明任一項(xiàng)的藥物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤選自肝癌、食管癌。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)了針對(duì)人RPS15A基因的RNAi靶點(diǎn)序列，構(gòu)建相應(yīng)的RPS15ARNAi載體，其中編碼序列SEQIDNO：1的RNAi載體pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA能夠顯著下調(diào)RPS15A基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡(jiǎn)寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA能夠靶向地將針對(duì)RPS15A 基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人食管癌細(xì)胞，降低RPS15A基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的RPS15A基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人RPS15A基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中RPS15A基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。在本發(fā)明中，所述RPS15A基因是指核糖體蛋白S15A(RibosomalProteinS15a,RPS15A)基因，其序列例如可參考NM_001019。在本發(fā)明中，所述靶序列中可以指RPS15A基因的基因組序列，也可以指其cDNA序列。優(yōu)選地，所述靶序列為與SEQIDNO：1所示的序列中至少連續(xù)10個(gè)(優(yōu)選至少連續(xù)15個(gè)，更優(yōu)選至少連續(xù)18個(gè))序列相同的序列。在本發(fā)明中，所述siRNA，即小干擾RNA(smallinterferingRNA)是一種雙鏈小RNA分子，其由完全互補(bǔ)的第一鏈和第二鏈組成，由Dicer(RNAaseⅢ家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成。所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與RPS15A基因中的靶序列相同，或者為與該靶序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列。所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個(gè)核苷酸；優(yōu)選地，長度均為19-23個(gè)核苷酸；更優(yōu)選地，長度均為19、20或者21個(gè)核苷酸。siRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。在本發(fā)明中，所述shRNA，即小發(fā)卡或短發(fā)卡RNA(asmallhairpinRNAorshorthairpinRNA,shRNA)是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)(tighthairpinturn)的RNA序列，其包含正義鏈片段、反義鏈片段以及連接正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，常被用于RNA干擾沉默靶基因的表達(dá)。其中正義鏈和反義鏈的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與RPS15A基因中15-27個(gè)連續(xù)的核苷酸序列相同，優(yōu)選地，所述正義鏈片段與RPS15A基因中19-23個(gè)連續(xù)的核苷酸序列相同；更優(yōu)選地，所述正義鏈片段與RPS15A基因中19、20或者21個(gè)連續(xù)的核苷酸序列相同，或者為與上述各序列在高等嚴(yán)緊條件 下雜交的序列。shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被細(xì)胞機(jī)制切割成siRNA，然后siRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物上(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，該復(fù)合物能夠結(jié)合到目的mRNAs并將其降解。本發(fā)明的小分子干擾核糖核酸(siRNA)可用化學(xué)合成方法直接合成或者用質(zhì)粒載體在細(xì)胞或體內(nèi)表達(dá)，或者在體外合成、轉(zhuǎn)錄后用Dicer酶消化的方法獲得。本發(fā)明所述的小干擾RNA可以是化學(xué)合成的雙鏈RNA；也可以是載體或表達(dá)框架表達(dá)的雙鏈RNA，所述載體或表達(dá)框架中可采用例如RNA聚合酶III啟動(dòng)子和RNA聚合酶III終止子調(diào)控小干擾RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，RNA聚合酶III啟動(dòng)子包括人源或鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子等。本發(fā)明所述的小干擾RNA可以是由作用于一個(gè)靶序列的單一小干擾RNA組成，也可以由作用于一個(gè)基因的多個(gè)靶序列或多個(gè)基因上的靶序列的多個(gè)小干擾RNA組成；所述的靶序列可以是RPS15A基因的基因組序列，或RPS15A基因的cDNA序列。具體地，本發(fā)明所述的小干擾RNA可以由序列表中的至少一個(gè)序列組成。本發(fā)明的siRNA可通過本文實(shí)施例中公開的方法或者本領(lǐng)域已知的方法篩選。本發(fā)明的siRNA中的第一鏈和shRNA中的正義鏈的序列與靶序列相同，其與siRNA靶序列相比具有至少連續(xù)10個(gè)(優(yōu)選至少連續(xù)15個(gè)，更優(yōu)選至少連續(xù)18個(gè))相同的核苷酸序列，或者為與該靶序列在高等嚴(yán)緊條件下雜交的序列。在本發(fā)明中，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm－5℃(低于探針Tm5℃)；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5－10℃；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10－20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20－25℃。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6×SSC＝極低嚴(yán)緊性；3×SSC＝低至中等嚴(yán)緊性；1×SSC＝中等嚴(yán)緊性；0.5×SSC＝高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook, J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。為便于說明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)溶液預(yù)洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。在本發(fā)明中，所述核酸構(gòu)建體是指包括復(fù)制系統(tǒng)以及能夠在給定的靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽編碼序列的序列。在本發(fā)明中，siRNA和shRNA的序列可以用核糖核酸(RNA)表示，也可以用脫氧核糖核酸(cDNA)表示，其具有相同的含義。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)時(shí)，siRNA和shRNA均以RNA的形式發(fā)揮作用，但在體外或細(xì)胞外，為了方便合成和載體構(gòu)建，可以以DNA序列的形式合成。附圖說明圖1：pGCSIL-GFP質(zhì)粒DNA圖譜圖2：人食管癌細(xì)胞ECA109與EC9706細(xì)胞、TE-1細(xì)胞中RPS15A基因相對(duì)表達(dá)豐度圖3：RPS15A-RNAi慢病毒侵染人食管癌細(xì)胞ECA1095天后，RPS15AmRNA的表達(dá)水平顯著降低圖4：RPS15A-RNAi慢病毒侵染人食管癌細(xì)胞ECA1095天后，引起細(xì)胞增殖抑制具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及一組針對(duì)人RPS15A基因的小分子干擾RNA(siRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人RPS15AmRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)序列。通過基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源RPS15A基因的表達(dá)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人RPS15A基因的表達(dá)后可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，可以有效地控制腫瘤的生長進(jìn)程。發(fā)明人進(jìn)一步合成針對(duì)RPS15A基因的siRNA，篩選出了可有效抑制RPS15A的表達(dá)進(jìn)而抑制食管癌ECA109細(xì)胞增殖和生長的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了干擾人RPS15A基因的小干擾RNA(siRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默RPS15A基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人RPS15A基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA及RNAi慢病毒，能夠穩(wěn)定并特異地下調(diào)RPS15A基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明RPS15A基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點(diǎn)。而且，通過RNAi方式沉默RPS15A基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為：本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人RPS15A基因RNAi慢病毒：從Genbank中調(diào)取人RPS15A基因序列；預(yù)測(cè)siRNA位點(diǎn)；合成針對(duì)RPS15A基因的有效的siRNA序列、兩端含酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNAOligo；慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNAOligo連接，構(gòu)建表達(dá)RPS15A基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix，Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默RPS15A基因的慢病毒。本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低RPS15A基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究表明，RPS15A基因是一個(gè)原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，RPS15A基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的RPS15A基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。如按照[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯，分子克隆試驗(yàn)指南，第三版，北京：科學(xué)出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配制。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1針對(duì)人RPS15A基因RNAi慢病毒的制備1.篩選針對(duì)人RPS15A基因的有效的siRNA靶點(diǎn)從Genbank調(diào)取RPS15A(NM_001019)基因信息；設(shè)計(jì)針對(duì)RPS15A基因的有效的siRNA靶點(diǎn)。表1列出了針對(duì)RPS15A基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列。表1靶向于人RPS15A基因的siRNA靶點(diǎn)序列SEQIDNO靶序列起始位點(diǎn)1GTGCAACTCAAAGACCTGGAA3392.慢病毒載體的制備針對(duì)siRNA靶點(diǎn)合成兩端含AgeI和EcoRI酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNAOligo序列(表2)；以AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶作用于pGCSIL-GFP載體(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供，如圖1所示，該載體是從pSicoR(Plasmid#11579)(http://www.addgene.org/11579/)改造而來，在pSicoR基礎(chǔ)上將mU6啟動(dòng)子替換為人的U6啟動(dòng)子(hU6)，進(jìn)而得到pGCSIL-GFP)，使其線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段。其中頸-環(huán)-頸的序列為：gtgcaactcaaagacctggaattcaagagattccaggtctttgagttgcac(SEQIDNO：9)表2兩端含AgeI和EcoRI酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNAOligo通過T4DNA連接酶將雙酶切線性化(酶切體系如表4所示，37℃，反應(yīng)1h)的載體DNA和純化好的雙鏈DNAOligo連接，在適當(dāng)?shù)木彌_體系(連接體系如表5所示)中于16℃連接過夜，回收連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化氯化鈣制備的新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化操作參考：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版55-56頁)。在連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物長出菌克隆的表面蘸一下，溶于10μlLB培養(yǎng)基，混勻取1μl作為模板；根據(jù)慢病毒載體pGCSIL-GFP中RNAi 序列的上下游序列，設(shè)計(jì)通用PCR引物，上游引物序列：5’-ccatgattccttcatatttgc-3’(SEQIDNO：2)；下游引物序列：5’-gtaatacggttatccacgcg-3’(SEQIDNO：3)，進(jìn)行PCR鑒定實(shí)驗(yàn)(PCR反應(yīng)體系如表6-1，反應(yīng)條件如表6-2)。對(duì)PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的針對(duì)SEQIDNO：1的表達(dá)RNAi的載體，命名為pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA。構(gòu)建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒，陰性對(duì)照siRNA靶序列為5’-ttctccgaacgtgtcacgt-3’(SEQIDNO：4)。構(gòu)建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒時(shí)，針對(duì)ScrsiRNA靶點(diǎn)合成兩端含AgeI和EcoRI酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNAOligo序列(表3),其余構(gòu)建方法、鑒定方法及條件均同pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA。表3兩端含AgeI和EcoRI酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNAOligo表4pGCSIL-GFP質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系試劑體積(μl)pGCSIL-GFP質(zhì)粒(1μg/μl)2.010×buffer5.0100×BSA0.5AgeI(10U/μl)1.0EcoRI(10U/μl)1.0ddH2O40.5Total50.0表5載體DNA和雙鏈雙鏈DNAOligo連接反應(yīng)體系表6-1PCR反應(yīng)體系試劑體積(μl)10×buffer2.0dNTPs(2.5mM)0.8上游引物0.4下游引物0.4Taq聚合酶0.2模板1.0ddH2O15.2Total20.0表6-2PCR反應(yīng)體系程序設(shè)定3.包裝RPS15A-siRNA慢病毒以Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取RNAi質(zhì)粒pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA的DNA，配制成100ng/μl儲(chǔ)存液。轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期的人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml，接種于6孔板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70％-80％時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h，吸出原有培養(yǎng)基，加入1.5ml新鮮的完全培養(yǎng)基。按照Sigma-aldrich公司的MISSIONLentiviralPackagingMix試劑盒的說明，向一滅菌離心管中加入PackingMix(PVM)20μl，PEI12μl，無血清DMEM培養(yǎng)基400μl，取20μl上述抽提的質(zhì)粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。將上述轉(zhuǎn)染混和物在室溫下孵育15min，轉(zhuǎn)移至人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16h。棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)介質(zhì)，PBS溶液洗滌，加入完全培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞上清液，CentriconPlus-20離心超濾裝置(Millipore)純化和濃縮慢病毒，步驟 如下：(1)4℃，4000g離心10min，除去細(xì)胞碎片；(2)0.45μm濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；(3)4000g離心，10-15min，至需要的病毒濃縮體積；(4)離心結(jié)束后，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開，將過濾杯倒扣在樣品收集杯上，離心2min離心力不超過1000g；(5)把離心杯從樣品收集杯上移開，樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液分裝后于-80攝氏度保存。病毒濃縮液中含有的shRNA的第一鏈的序列如SEQIDNO:9所示。對(duì)照慢病毒的包裝過程同RPS15A-siRNA慢病毒，僅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA載體代替pGCSIL-GFP-RPS15A-siRNA載體。實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)RPS15A在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平處于對(duì)數(shù)生長期的人食管癌ECA109，EC9709，TE-1細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為5×104/ml)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約80％。根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書，抽提總RNA。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表7，42℃反應(yīng)1h，然后在70℃水浴鍋中水浴10min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活)。采用TP900型RealtimePCR儀(TAKARA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。RPS15A基因的引物如下：上游引物5’-ctccaaagtcatcgtccggtt-3’(SEQIDNO：5)和下游引物5’-tgagttgcacgtcaaatctgg’(SEQIDNO：6)。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，引物序列如下：上游引物5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’(SEQIDNO：7)和下游引物5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’(SEQIDNO：8)。按表8中的比例配置反應(yīng)體系。表7逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑體積(μl)5×RTbuffer4.010mMdNTPs2.0RNasin0.5M-MLV-RTase1.0DEPCH2O3.5Total11.0表8Real-timePCR反應(yīng)體系試劑體積(μl)SYBRpremixextaq:10.0上游引物(2.5μM)：0.5下游引物(2.5μM)：0.5cDNA1.0ddH2O8.0Total20.0設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-timePCR：預(yù)變性95℃，15s；之后每一步變性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結(jié)束后，95℃變性1min，然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同時(shí)讀取吸光值，制作熔解曲線。采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算RPS15AmRNA在各個(gè)食管癌細(xì)胞的表達(dá)豐度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，人食管癌ECA109細(xì)胞表達(dá)RPS15A。實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)RPS15A基因的沉默效率處于對(duì)數(shù)生長期的人食管癌ECA109細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為5×104/ml)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約30％。根據(jù)侵染復(fù)數(shù)(MOI，ECA109:10)值，加入適宜量的實(shí)施例1制備的病毒，培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基，待侵染時(shí)間達(dá)到5天后，收集細(xì)胞。根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書，抽提總RNA。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表7，42℃反應(yīng)1h，然后在70℃水浴鍋中水浴10min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活)。采用TP900型RealtimePCR儀(TAKARA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。RPS15A基因的引物如下：上游引物5’-ctccaaagtcatcgtccggtt-3’(SEQIDNO：5)和下游引物5’-tgagttgcacgtcaaatctgg’(SEQIDNO：6)。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，引物序列如下：上游引物5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’(SEQIDNO：7)和下游引物5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’(SEQIDNO：8)。按表8中的比例配置反應(yīng)體系。表7逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑體積(μl)5×RTbuffer4.010mMdNTPs2.0RNasin0.5M-MLV-RTase1.0DEPCH2O3.5Total11.0表8Real-timePCR反應(yīng)體系試劑體積(μl)SYBRpremixextaq:10.0上游引物(2.5μM)：0.5下游引物(2.5μM)：0.5cDNA1.0ddH2O8.0Total20.0設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-timePCR：預(yù)變性95℃，15s；之后每一步變性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結(jié)束后，95℃變性1min，然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同時(shí)讀取吸光值，制作熔解曲線。采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算侵染了RPS15AmRNA的表達(dá)豐度。侵染對(duì)照病毒(Lv-Scr-siRNA)的細(xì)胞作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，人食管癌ECA109細(xì)胞中RPS15AmRNA的表達(dá)水平下調(diào)了90.0％以上。實(shí)施例4檢測(cè)侵染了RPS15A-siRNA慢病毒的腫瘤細(xì)胞的增殖能力處于對(duì)數(shù)生長期的人ECA109細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為5×104/ml)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約30％。根據(jù)侵染復(fù)數(shù)(MOI，ECA109:10)，加入適宜量的病毒，培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基，待侵染時(shí)間達(dá)到5天后，收集處于對(duì)數(shù)生長期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液(2×104/ml)，以細(xì)胞密度約為2000個(gè)/孔，接種96孔板。每組5個(gè)復(fù)孔，每孔100μl。鋪好板后，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第二天開始，每天用Cellomics儀器(ThermoFisher)檢測(cè)讀板一次，連續(xù)檢測(cè)讀板5天。通過調(diào)整Cellomicsarrayscan的輸入?yún)?shù)，準(zhǔn)確地 計(jì)算出每次掃描孔板中的帶綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，繪出細(xì)胞增殖曲線(結(jié)果如圖4所示)。結(jié)果表明，慢病毒侵染組各腫瘤在細(xì)胞體外培養(yǎng)5天后，增殖速度顯著減緩，遠(yuǎn)低于對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的增殖速度，活力細(xì)胞數(shù)目分別下降了80％以上，表明RPS15A基因沉默導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖能力被抑制。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁1 2 3